EVALUAREA CORELATIVA A LOCALIZARII SI GRAVITATII LEZIUNILOR CU MODIFICARILE SURVENITE IN PROFILUL IMUNOLOGIC IN AGALAXIA CONTAGIOASA OVINA.

In contextul actual al patologiei, in domeniul bolilor infectioase, controlul bolilor transmisibile reprezinta un deziderat esential. Supravegherea epidemiologica eficienta presupune depistarea animalelor fara semne clinice de boala si eliminarea lor din efectiv cat mai curand, intrerupandu-se astfel lantul epizootic. Conturarea profilului imunologic al unei boli pentru care starea de purtator reprezinta o veriga importanta a propagarii bolii este extem de utila in scop de depistare.

Bolile micoplasmice sunt exemple tipice de boli multifactoriale, unde factori cum sunt infectiile intercurente, aglomeratia, modificari ale conditiilor climaterice, varsta, constitutia genetica si stersurile de transport, manipulare si experimentare reprezinta determinanti importanti in realizarea infectiei.

Interactiunea micoplasmelor cu sistemul imun sunt semnificative si joaca un rol cheie in instalarea si evolutia infectiei micoplasmice. Rolul reactiilor imune ale gazdei pe parcursul infectiei cu M. pneumoniae este sustinut de numeroase argumente:

- existenta unei simptomatologii mai grave in cursul infectiilor secundare;

- prezenta autoanticorpilor;

-aspectele lezionale cu prezenta de infiltrate limfoplasmocitare perivasculare si peribronhiale.

Imunoprofilaxia micoplasmozelor ridica de asemenea cateva probleme. Cu toate ca trecerea prin infectie are efect protector, imunitatea este de scurta durata in mastite. A fost deja mentionata capacitatea unor vaccinuri antimicoplasmice de a induce imunosupresie. Unul dintre dezideratele majore ale vaccinarii in aceasta boala este acela de a pastra latura protectoare a raspunsului imun si de a o indeparta pe cea de hipersensibilizare (trasatura cunoscuta in infectiile naturale).

Eliminarea micoplasmelor prin lapte de catre animale fara infectii clinice ca si prezenta micoplasmelor in ureche si in organismul parazitilor din genul Psoroptes si Railletia la purtatorii sanatosi, favorizeaza diseminarea lor in procesul de transhumanta si contaminarea efectivelor indemne, implica largirea cadrului de transmitere si cresterea importantei economice a bolii. Datele legate de supravegherea epidemiologica prin stabilirea profilului imunologic al bolii se limiteaza la semnalarea prezentei anticorpilor antimicoplasma.

Definirea statusului imunopatologic, caracteristic unei boli in care portajul inaparent si specificul de viata al speciei implicate in conditiile tarii noastre (transhumanta), permit propagarea ei si persistenta in efective, aduce un element de noutate. Aplicarea unor teste de investigare a raspunsului umoral si celular nespecific si/sau specific in vitro, aduce­ pe langa posibilitati de standardizare in conditiile speciei ovine, contributii insemnate la caracterizarea unor aspecte particulare legate de conturarea profilului imunologic al micoplasmozei (agalaxiei contagioase) la aceasta specie. Estimarea nivelului functional al diferitilor efectori specifici, in conditiile evolutiei bolii, permit elucidarea unor aspecte legate de patogeneza infectiei si probabil, legate de recrudescenta bolii in conditiile efectuarii constante a vaccinarii antiagalactice in zonele de risc epidemiologic.

Experimentul a urmarit stabilirea conditiilor optime de testare a capacitatii de blastizare leucocitara la ovine, pentru ca ulterior sa poata fi investigat raspunsul acestor efectori la actiunea micoplasmelor existente in organism. O mai buna cunoastere a reactivitatii celulare poate contribui la elucidarea mecanismelor patogenetice si instituirea unor masuri de combatere cu eficienta sporita.

MATERIALE SI METODE

Investigatiile au fost efectuate pe 18 animale bolnave dintr-un efectiv de 245 de ovine din rasa Tigaie, proprietate particulara, in care au fost efectuate in urma cu doi ani vaccinari contra agalaxiei contagioase.

Efectivul a fost mentinut la pasune, cu suplimentarea alimentatiei cu concentrate la saivan, o data pe zi. Au fost supuse investigatiilor atat animale vaccinate cat si animale nevaccinate, toate cu semne clinice de agalaxie contagioasa, cu diferite localizari (articulara, oculara sau mixta). Varsta animalelor testate a fost cuprinsa intre 2 si 8 ani. S-au testat atat masculi cat si femele. La unele dintre animalele, anterior experimentului s-au efectuat tratamente, in timp ce altele nu au fost tratate.

S-au efectuat doua recoltari de sange la 18 zile interval. Sangele a fost prelevat pe heparina, concentratia acesteia nedepasind 50 UI/ml. Prelucrarea lor prin testul de transformare blastica s-a realizat in maximum 4 ore de la recoltare.

Tehnica.

Raspunsul proliferativ al limfocitelor se poate evalua prin testul de transformare blastica, ca proba a masurii reactivitatii celulare. Acest test a fost conceput pentru a pune in evidenta capacitatea de reactie a limfocitelor izolate sau a leucocitelor din sangele integral, fata de diferite antigene bacteriene sau virale. Pe parcursul experimentarilor s-a constatat ca exista compusi izolati din plante, bacterii sau chiar celule, produsi de secretie sau toxine, capabile de a induce blastizarea, chiar daca limfocitele sau leucocitele nu au venit anterior in contact cu ele.

Mitogenele policlonale, fitohemaglutinina (PHA) si concanavalina A (Con A) induc transformarea limfocitelor T.

Sangele a fost suspendat in mediu de cultura RPMI 1640 (cu adaus de 5% ser fetal de vitel -SFV, antibiotice -1000 UI penicilina si 1000 mg streptomicina/ml, tamponat cu o solutie de bicarbonat de sodiu 5% la pH 7,2-7,4) in proportie de 1:4 si apoi repartizat in placi cu 96 godeuri, cate 200 ml in fiecare godeu, in doua variante pentru fiecare proba, o varianta nestimulata si o varianta stimulata cu PHA M, 1 microlitru / godeu (5 microlitri/ml amestec).

Un raspuns cuantificabil fata de mitogeni in cultura de sange, apreciat prin dozarea consumului de glucoza, semnifica prezenta celulelor imunologic competente, respectiv existenta unei reactii imune mediate celular.

Placile au fost inchise cu capac, introducandu-se intr-un exsicator in care s-a realizat atmosfera de CO₂ 5% prin amestecarea de 1,9 g bicarbonat de sodiu cu 40 ml acid clorhidric 0,1 N. Exsicatorul s-a inchis iar capacul s-a etansat cu ajutorul unui strat de vaselina. Timpul de incubare la 38sC a fost de 60 ore.

Aprecierea cresterii celulara s-a realizat prin dozarea glucozei reziduale.

Estimarea gradului de blastizare spontane sau mitogen induse s-a realizat in baza principiului ca dezvoltarea celulara se realizeaza prin consumul glucozei existente in mediu, de aceea la finele perioadei de incubare, determinarea glucozei reziduale poate permite calculul unor indici de stimulare. Dozarea consumului de glucoza se poate realiza prin numeroase metode. Metoda cu orto-toluidina este o metoda usor de aplicat, de aceea isi gaseste o larga utilizare in laboratorul clinic. Prin incalzirea in mediu acid, glucoza formeaza cu orto-toluidina un complex de culoare verde cu intensitati diferite care se fotometreaza la 610 nm.

Dupa incubare, continutul celor doua godeuri existente pentru fiecare varianta s-a trecut in acelasi godeu dintr-o placa noua, pentru realizarea probei medii. Dupa amestecare, la 0,5 ml reactiv o-toluidina s-au adaugat 12,5 μl supernatant cultural mediu. Amestecul s-a tinut 8 minute pe o baie de apa la 100sC, apoi s-a racit brusc pentru stoparea reactiei si s-a spectrofotometrat la 610 nm, la spectrofotometrul Sumal PE 2, in placa de 96 de godeuri (d = 0,5 cm).

Pentru fiecare serie de probe, s-a lucrat in paralel o proba standard de glucoza (100 mg/dl) si o proba din mediul initial. In functie de valorile glucozei, indicii de stimulare s-au calculat dupa relatiile:

Conc. glucozei in mediu - Conc. glucozei martor

IS martor (%) = x 100

Conc. glucozei in mediu

Conc. glucozei in martor - Conc. glucozei in proba

IS proba (%) = x 100

Conc. glucozei in martor

In cazul aplicarii variantei de lucru folosind sange integral, cooperarea celulara necesara explicitarii raspunsului imun este mentinuta, devenind insa mai dificil de atribuit un rezultat reactiv sau altul, diferitelor categorii celulare. De asemenea, reactivitatea fata de diferiti compusi poate fi apreciata doar global, fara a se stabili cu precizie care categorie celulara este cea influentata predominant.

REZULTATE

In tabelele 1 si 2 sunt prezentate valorile obtinute prin spectrofotometrarea probelor tratate cu o-toluidina, concentratiile glucozei reziduale si valorile indicilor de blastizare calculate in baza acestora la cele doua recoltari.

Tabel 1- Valori ale densitatilor optice, glucozei reziduale si indicilor de blastizare pentru probele de sange provenite de la animalele cu semne clinice de agalaxie contagioasa (rec. I)

Legenda: DO- densitate optica, gluc- concentratia glucozei reziduale, IS - indici de blastizare

Urmarind rezultatele obtinute, se poate observa ca valorile individuale ale indicilor de blastizare au variat foarte mult, atat la prima cat si la a doua recoltare, precum si pe variante experimentale, inregsitrandu-se nu rareori valori negative, in special pentru culturile tratat, ceea ce dovedeste o crestere mai slaba a leucocitelor in prezenta PHA.

Cresterea indicelui de blastizare spontana a fost, de la o recoltare la alta, foarte semnificativa statistic (p<0,001)(de la 17,26 la 78,71) in timp ce variatiile raspunsului la PHA, cu toate ca s-au produs in sens negativ (scadere de la -6,75 la - 12,38) nu au beneficiat de asigurare statistica.

Tabel 2- Valori ale densitatilor optice, glucozei reziduale si indicilor de blastizare pentru probele de sange provenite de la animalele cu semne clinice de agalaxie contagioasa (rec.II)

Legenda: DO- densitate optica, gluc- concentratia glucozei reziduale, IS - indici de blastizare

Valorile blastogenezei spontane inregistrate in fazele incipiente ale bolii sunt similare cu cele care s-au observat la animalele sanatoase, din categoria de varsta adulte (12,67 0,36 %). Limitele de variatie ale indicilor de blastizare ai culturilor tratate cu PHA M au fost insa mult sub limita inregistrata la animalele sanatoase (30,73

In fig. 1 se observa evolutia indicilor de blastizare la cele doua recoltari, cu valori negative pentru culturile 'stimulate' cu PHA, la ambele.

DISCUTII

Infectia micoplasmica stimuleaza atat sinteza de anticorpi cat si raspunsul imun celular, anticorpii fiind produsi local sau sistemic. Raspunsul mediat celular poate fi pus in evidenta prin teste de hipersensibilizare cutanata fata de antigenele potrivite sau prin testele de stimulare in vitro a limfocitelor si monitorizarea producerii de limfokine. Micoplasmele pot adera intim de limfocit, procesul fiind finalizat chiar printr-o fuziune completa, cu efecte profunde asupra functionarii limfocitului.

In numeroase boli micoplasmice, indeosebi in pneumoniile cronice, in tesutul interstitial are loc o proliferare masiva limfoplasmocitara, datorita pe de-o parte raspunsului umoral si celular antigen-specific iar pe de alta parte, activtatii mitogenice nespecifice ale micoplasmelor. Unele specii de micoplasme sunt mitogene pentru limfocitele T si B, dar acest tip de activitate il poseda si unele micoplasme nepatogene.

In organismele in care are loc stimularea policlonala a limfocitelor B, apar anticorpi dirijati fata de diferite antigene nerelevante, chiar antigene proprii (auto-antigene). Astfel, infectia cu M. pneumoniae induce la om, anticorpi dirijati impotriva eritrocitelor, limfocitelor, substantei nervoase, muschiului neted, fusului de diviziune. Autoimunitatea duce la boala clinic manifesta la un numar mic, dar semnificativ de pacienti.

Raspunsul mitogenic al limfocitelor poate fi corelat cu gradul de susceptibilitate la infectie. Se cunoaste de asemenea, ca M. arthritidis secreta un mitogen (MAM), cu caracteristici de superantigen, care nu necesita procesare de catre celula prezentatoare de antigen (APC). Acest superantigen stimuleaza o gama larga de limfocite T (CD4 si CD8). Se ajunge astfel la activarea celulelor T citotoxice, stimularea limfocitelor B prin activitatea helper, urmand eliberarea de citokine biologic active, cu potential socogen, de autoreactivitate si generare a inflamatiei. Proteinele de stres, gasite la micoplasme, sugereaza un posibil rol in autoreactivitate.

Persistenta de lunga durata a infectiilor micoplasmice sugereaza un raspuns inadecvat din partea organismului gazda. Este interesant de mentionat ca unele micoplasme au efecte supresoare ale raspunsului imun cum ar fi diminuarea reactivitatii limfocitare la mitogenele standard. Fenomenul de mimetism biologic (molecular) favorizeaza micoplasmele in eludarea raspunsului imun al organismului gazda. M. arthritidis are antigene ce se regasesc la sobolani iar M. mycoides prezinta fractiuni care se aseamana cu pneumogalactanul de la bovine. Superantigenul MAM are efecte puternic supresoare prin inhibarea functiei T_H1, respectiv secretia de IL-2. Pe de alta parte, activitatea T_H2 este stimulata, crescand cantitatile de IL-4 si IL-6. Imunosupresia a fost descrisa in vivo la bovine cu pleuropneumonie, la pui imunizati cu tulpini inactivate de M. gallisepticum si la persone suferind de infectii cu M. pneumoniae. Nu se cunoaste daca rezultatul fuziunii celula gazda-micoplasma, mentionata anterior, are ca rezultat achizitionarea de catre micoplasme a unor antigene in vivo, asa cum acest fenomen are loc in vitro. Integrarea unor antigene ale celulei gazda in structura micoplasmelor ar reprezenta o posibila explicatie a eludarii mecanismelor de protectie concomitent cu instalarea proceselor autoimune.

Rezultatele obtinute prin testarea capacitatii de blastizare a leucocitelor in vitro, in culturi de sange integral provenite de la ovine adulte cu semne clinice de agalaxie contagioasa, vin sa sublinieze efectul imunosupresor al micoplasmelor in organism. Cu toate ca descresterea raspunsului la PHA (mitogen clasic) nu este marcanta pe parcursul experimentului, trebuie tinut cont de faptul ca animalele au fost deja afectate clinic, in faze incipiente la inceperea acestuia. Astfel, comparatia cu valorile similare determinate la animalele sanatoase din aceeasi categorie de varsta este net in defavoarea indicelui de blastizare la animalele bolnave (p<

Indicele de blastizare spontana este insa crescut foarte semnificativ statistic, dovedind implicarea sistemului celular in lupta organismului impotriva bolii. Probabil ca fiind vorba de aceasta perioada incipienta a bolii, resursele de protectie celulara nu sunt inca epuizate. Tehnica nu permite departajarea categoriilor celulare implicate in diminuarea concentratiei de glucoza.

Datele obtinute indica implicarea profunda a sistemului de protectie imuna celulara in patogeneza infectiei micoplasmice.

CONCLUZII

Testul de transformare blastica la ovine se poate executa in conditii bune prin diluarea sangelui cu mediu RPMI 1640 in proportie de 1:4 si incubare aculturilor timp de 60 de ore la 38 C. Aprecierea cresterii celulare se poate aprecia cu rezultate bune prim metoda colorimetrica cu orto-toluidina.

La animalele luate in studiu in faza incipienta a bolii, capacitatea de blastizare spontana este mult crescuta (p<0,001) la momentul final, dupa 18 zile de boala, comparativ cu valorile initiale, indicand o stare de reactivitate sporita a apararii celulare in aceasta perioada evolutiva.

Raspunsul celular indus de PHA este diminuat, comparativ atat cu cel observat la animalele sanatoase, cat si pe durata de efectuare a experimentului. Este posibil ca receptorii pentru acest mitogen sa fie afectati de procesul infectios.

BIBLIOGRAFIE

Almeida, R.A. , Wannemuehler M.J., Rosenbusch R.F. 1992. Interaction of Mycoplasma with alveolar macrophages. Infect. Immun. 60:2914-19

Cole B.C., Atkin C.L. 1991. The Mycoplasma arthritidis T-cell mitogen, MAM: A model superantigen.Immunol. Today, 12:271-76

Franzoso G., Dimitrov D. S., Blumenthal R., Barile M.F., Rottem S. 1992. Fusion of Mycoplasma fermentans strain incognitus with T-lymphocytes. Fed.Eur.Biol.Soc. Lett., 303:251-54.

Lai, W.C., Bennett M., Lu Y-S., Pakes S.P. 1991. Vaccination of Lewis rats with temperature-sensitive mutants of Mycoplasma pulmonis: Adoptive transfer of immunity by spleen cells but not by sera. Infect. Immun., 59:346-50.

Stuart P.M., Cassell G.H., Woodward L.J. 1989. Induction of class II MHC antigen expression in macrophages by Mycoplasma species. J. Immunol., 142:3392-409.

Bolile micoplasmice sunt exemple tipice de boli multifactoriale, unde elemente cum sunt infectiile intercurente, aglomeratia, modificari ale conditiilor climaterice, varsta, constitutia genetica si stresurile de transport, manipulare si experimentare reprezinta determinanti importanti in realizarea infectiei. Afectiunea caracteristica indusa de micoplasme la ovine si caprine este mamita micoplasmica, produsa de M. agalactiae care nu rareori este insotita de septicemie, artrita, keratoconjunctivita. Aceasta micoplasma este adaptata glandei mamare, dar poate fi prezenta de asemenea in tractusul digestiv. Interactiunea micoplasmelor cu sistemul imun este semnificativa si joaca un rol cheie in instalarea si evolutia infectiei micoplasmice. Corelarea prezentei anticorpilor cu sinteza coplexelor imune ar putea fi raspunzatoare de leziunile extrapulmonare asociate infectiei: leziuni ale sistemului nervos, miocardite, artrite.

Estimarea semnificatiei componentei autoimune prin dozarea CIC reprezinta un element important in completarea profilului imunopatologic al bolii.

Experimentul de fata a urmarit cuantificarea, complexelor imune circulante la ovine cu agalaxie contagioasa, in corelatie cu gravitatea tabloului lezional. S-a urmarit de asemenea corelarea tabloului lezional cu situatia imunologica a animalelor (vaccinarea sau absenta vaccinarii) si cu interventiile terapeutice.

MATERIALE SI METODE

Investigatiile au fost efectuate pe 18 animale bolnave dintr-un efectiv de 245 de ovine din rasa Tigaie, proprietate particulara, in care au fost efectuate in urma cu doi ani vaccinari contra agalaxiei contagioase.

Efectivul a fost mentinut la pasune, cu suplimentarea alimentatiei cu concentrate la saivan, o data pe zi. Au fost supuse investigatiilor atat animale vaccinate cat si animale nevaccinate, toate cu semne clinice de agalaxie contagioasa, cu diferite localizari (articulara, oculara sau mixta). Varsta animalelor testate a fost cuprinsa intre 2 si 8 ani. S-au testat atat masculi cat si femele. La unele dintre animalele, anterior experimentului s-au efectuat tratamente, in timp ce altele nu au fost tratate (tabelul nr.1)

Tabelul nr.1. Situatia epidemiologica a animalelor luate in studiu

S-au efectuat doua recoltari de sange la 18 zile interval. Sangele a fost recoltat pe gel coagulant. Probele pentru ser au fost lasate sa coaguleze la 37⁰C, 1 ora dupa care au fost decolate si trecute la frigider 30 minute. Serul rezultat a fost centrifugat la 2500 turatii / minut timp de 10 minute. Serurile au fost separate, trecute in tubulete de plastic si pastrate la congelator la - 20⁰C pana in momentul determinarilor.

Dozarea complexelor imune circulante s-a facut folosind micrometoda, prin precipitare cu polietilenglicol (PEG) 4,2 %. Durata precipitarii este de 60 minute, precipitarea avand loc la temperatura camerei. Citirea s-a facut spectrofotometric, fata de solutia tampon la lungimea de unda de 450 nm. Rezultatele se exprima in unitati si se calculeaza dupa formula:

(U)CIC = (extinctia PEG+proba) - (extinctia tampon+proba) x 1000

Calculul statistic a fost efectuat folosind programul Excel. S-au acordat scoruri pentru tabloul lezional, pe localizari (localizarea articulara = 1, localizarea oculara =2, localizare mixta=3), pentru efectuarea vaccinarii sau absenta acestei manopere (nevaccinat=1, vaccinat=2) respectiv efectuarea tratamentului sau absenta acestuia (netratat=1, tratat=2). Aceste scoruri au fost corelate cu nivelele complexelor imune circulante la cele doua recoltari, pentru a estima interventia sintezei de complexe in procesul patogenetic.

REZULTATE SI DISCUTII

Datele obtinute sunt prezentate in tabelele 2-5 si figurile 1 si 2.

Din figura 1 se poate observa predominanta formelor articulara apoi oculara de boala, forma mixta fiind prezenta la un singur individ (6%).

Figura 2 ilustreaza repartitia leziunilor pe sexe si localizari. Majoritatea animalelor afectate au fost femele (numarul masculilor in turma fiind mai redus), localizarea observata la acestea fiind preponderent cea oculara, pe cand masculii au prezentat exclusiv leziuni articulare. Scorurile lezionale acordate si nivelele CIC determinate trebuie corelate si cu statusul nutritional al animalelor testate, cunoscut fiind faptul ca factorii de mediu influenteaza cu o intensitate diferita raspunsul fata de micoplasme, cei nutritionali situandu-se pe primele planuri (de exemplu, aflatoxina, care duce la cresterea concentratiei serice de gammaglobulina) (4).

Valorile individuale obtinute la prima recoltare (tabel 2) se incadreaza intre 0,002 si 0,016 UDO in timp ce la recoltarea a doua acestea sunt cuprinse intre 0 si 0,029 UDO.

Urmarind evolutia valorilor medii se observa o usoara crestere a acestora la recoltarea a doua (tabel 2)(0,0089 UDO) comparativ cu prima recoltare (0,0086 UDO) dar inregistnd dupa cum se si observa, valori medii apropiate intre cele doua recoltari.

Tabel nr.2. Valorile individuale si medii ale CIC la ovine cu agalaxie contagioasa

	REC  I			REC   II
Nr. proba.	PEG	T. BORAT	CIC	Nr. proba.	PEG	T. BORAT	CIC
					nt	nt	nt
					nt	nt	nt
media				media
dev.st.				dev.st.
var.

In conditiile in care prezenta micoplasmelor patogene este demonstrata la capre sanatoase in conductul auricular si atunci cand aceste animale pot cohabita cu oile, in cresterea extensiva, rolul lor patogenetic poate fi relativ usor de demonstrat si aparitia unui raspuns imun la acestea nu reprezinta o surpriza (

Tabel 3. Sirurile de valori utilizate pentru evaluarea corelatiei dintre scorurile lezionale acordate si nivelele complexelor imune circulante la cele doua recoltari.

Calculul coeficientului de corelatie dintre scorurile lezionale si nivelele CIC demonstreaza ca dependenta celor doua siruri studiate este directa dar nu foarte stransa, lipsind asigurarea statistica. Se poate deduce de aici ca, desi aparitia leziunilor poate fi influentata de sinteza complexelor imune circulante, aceasta influenta nu este majora sau obligatorie (tabel 3).

Tabel 4. Sirurile de valori utilizate pentru evaluarea corelatiei dintre nivelel imunizarii si concentratiile complexelor imune circulante la cele doua recoltari.

Efectul diferitilor adjuvanti in cresterea protectiei impotriva mamitei micoplasmice (Mycoplasma agalactiae) este demonstrat de numeroase cercetari. Imunizarea contra agalaxiei contagioase implica in mod special proteina Hsp60 (3,5,6). Astfel de exemplu se cunoaste ca acidul poliinosinic-policitidilic duce la conversia sintezei IgG2a catre IgG3, prin modificarea isotipului B intr-un mediu adecvat de citokine (1). Efectul vaccinarii per se, prin cresterea titrului de anticorpi, poate duce la cresterea concentratiei complexelor imune circulante. Uneori acestea pot avea efecte nedorite, cum ar fi agravarea leziunilor instalate in timpul evolutiei bolii, atunci cand animalele sunt insuficient protejate, datorita timpului indelungat scurs de la data vaccinarii.

Tabel 5. Sirurile de valori utilizate pentru evaluarea corelatiei dintre scorurile terapeutice acordate si nivelele complexelor imune circulante la cele doua recoltari.

Estimarea similara efectuata in raport cu statusul vaccinal al animalelor investigate a aratat o corelatie inversa intre imunizarea impotriva agalaxiei si nivelele CIC la prima recoltare, aceasta corelatie devenind pozitiva la cea de-a doua vaccinare. Nici pentru acest parametru, valorile lui r nu au fost asigurate statistic. Interesant este faptul ca la prima vaccinare, concentratiile CIC scad cu efectuarea vaccinarii in timp ce la cea de-a doua recoltare, care s-a efectuat la un interval de 17 zile, nivelele CIC au crescut in raport cu cresterea intervalului de timp trecut de la vaccinare si agravarea leziunilor.

Situatia se inverseaza in cazul investigarii corelatiei dintre gravitatea leziunilor si instituirea sau neinstituirea terapiei, tratamentul de durata determinand scaderea nivelelor complexelor imune circulante. Fara a intra in detalii referitoare la mecanismul de reducere al CIC (diminuarea sintezei sau intensificarea eliminarii lor din circulatie), este evidenta influenta benefica a terapiei asupra remedierii leziunilor, probabil si datorita reducerii concentratiilor CIC .

CONCLUZII

Nivelele complexelor imune circulante la animale cu agalaxie contagioasa clinic manifesta nu difera semnificativ inainte si dupa instituirea terapiei.

Calculul coeficientului de corelatie dintre scorurile lezionale si nivelele CIC demonstreaza ca dependenta celor doua siruri studiate este directa dar nu foarte stransa, lipsind asigurarea statistica.

Corelarea nivelelor CIC cu statusul vaccinal al animalelor investigate a aratat o corelatie inversa intre imunizarea impotriva agalaxiei si nivelele complexelor la prima recoltare, aceasta corelatie devenind pozitiva la cea de-a doua vaccinare, fara ca valorile lui r sa fie asigurate statistic. Nivelele CIC au crescut in raport cu cresterea intervalului de timp trecut de la vaccinare si agravarea leziunilor.

Tratamentul de durata determina scaderea nivelelor complexelor imune circulante, influentand benefic remedierii leziunilor, probabil si datorita reducerii concentratiilor CIC .

BIBLIOGRAFIE

Avramidis N, Victoratos P, Yiangou M, Hadjipetrou-Kourounakis L. - 2002 - Adjuvant regulation of cytokine profile and antibody isotype of immune responses to Mycoplasma agalactiae in mice.Vet Microbiol.; 88 (4) :325-38.

Cottew GS, Yeats FR. 1982 - Mycoplasmas and mites in the ears of clinically normal goats. Aust Vet J. Sep;59(3):77-81.

Glew M. D., L. Papazisi, F. Poumarat, D. Bergonier, R. Rosengarten,C. Citti^- - 2000 - Characterization of a Multigene Family Undergoing High-Frequency DNA Rearrangements and Coding for Abundant Variable Surface Proteins in Mycoplasma agalactiae Infect Immun.; 68 (8): 4539-4548

Marin DE, Taranu I, Bunaciu RP, Pascale F, Tudor DS, Avram N, Sarca M, Cureu I, Criste RD, Suta V, Oswald IP. Changes in performance, blood parameters, humoral and cellular immune responses in weanling piglets exposed to low doses of aflatoxin.J Anim Sci. 2002 May;80(5):1250-7.

Ron Y, Flitman-Tene R, Dybvig K, Yogev D. - 2002 - Identification and characterization of a site-specific tyrosine recombinase within the variable loci of Mycoplasma bovis, Mycoplasma pulmonis and Mycoplasma agalactiae. Gene. ;292(1-2):205-11.

Scherm B, Gerlach GF, Runge M. - 2002 - Analysis of heat shock protein 60 encoding genes of mycoplasmas and investigations concerning their role in immunity and infection.Vet.Microbiol.;89(2-3):141-50

2004 - EVALUAREA INFLUENTEI INFECTIEI CU M. AGALACTIAE ASUPRA PROFILULUI FAGOCITAR GLOBAL AL ANGELUI LA ANIMALE CU AGALAXIE CONTAGIOASA; INFLUENTA UNOR EXTRACTE VEGETALE ASUPRA ACESTEI ACTIVITATI

Bolile micoplasmice sunt exemple tipice de boli multifactoriale, unde elemente cum sunt infectiile intercurente, aglomeratia, modificari ale conditiilor climaterice, varsta, constitutia genetica si stresurile de transport, manipulare si experimentare reprezinta determinanti importanti in realizarea infectiei. Afectiunea caracteristica indusa de micoplasme la ovine si caprine este mamita micoplasmica, produsa de M. agalactiae care nu rareori este insotita de septicemie, artrita, keratoconjunctivita. Aceasta micoplasma este adaptata glandei mamare, dar poate fi prezenta de asemenea in tractusul digestiv. Interactiunea micoplasmelor cu sistemul imun este semnificativa si joaca un rol cheie in instalarea si evolutia infectiei micoplasmice. Corelarea prezentei anticorpilor cu sinteza complexelor imune ar putea fi raspunzatoare de leziunile extrapulmonare asociate infectiei: leziuni ale sistemului nervos, miocardite, artrite.

S-a urmarit stabilirea conditiilor optime de testare a activitatii fagocitare la ovine, cu sau fara introducerea in vitro a unor imunomodulatoare (extractul de Echinacea angustifolia).

Material si metoda

Investigatiile au fost efectuate pe 18 animale bolnave dintr-un efectiv de 245 de ovine din rasa Tigaie, proprietate particulara, in care au fost efectuate in urma cu doi ani vaccinari contra agalaxiei contagioase.

Efectivul a fost mentinut la pasune, cu suplimentarea alimentatiei cu concentrate la saivan, o data pe zi. Au fost supuse investigatiilor atat animale vaccinate cat si animale nevaccinate, toate cu semne clinice de agalaxie contagioasa, cu diferite localizari (articulara, oculara sau mixta). Varsta animalelor testate a fost cuprinsa intre 2 si 8 ani. S-au testat atat masculi cat si femele. La unele dintre animalele, anterior experimentului s-au efectuat tratamente, in timp ce altele nu au fost tratate.

S-au efectuat doua recoltari de sange la 18 zile interval. Sangele a fost prelevat pe heparina, concentratia acesteia nedepasind 50 UI/ml. Prelucrarea lor prin testul de inglobare al particulelor de carbon, s-au realizat in maxim 4 ore de la recoltare.

Tehnica

Functia fagocitara reprezinta unul dintre aspectele importante ale protectiei antiinfectioase. Testarea capacitatii functionale a granulocitelor neutrofile corelata cu alte teste aplicate pentru evaluarea imunodeficientelor, poate elucida suspiciunea de imunodeficit neutrofilic primar.

Testele functionale pot depista, in cazul unor deficite neutrofilice secundare, perturbari intervenite in diferitele etape ale fagocitozei: chemotaxia, interactiunea cu particulele opsonizate, ingestia, dezvoltarea suntului respirator, distrugerea si digerarea microorganismelor. Toate functiile depind de integritatea receptorilor de membrana astfel incat identificarea lor prin aplicarea anticorpilor monoclonali poate fi extrem de utila.

Pentru efectuarea acestor teste sangele trebuie recoltat pe heparina, in tuburi sterile. Este bine ca prelucrarea probelor sa fie efectuata imediat dupa recoltare. Daca acest lucru nu este posibil, transportul si conservarea se vor face la 18-20°C altfel se modifica potentialul functional (+4°C) sau se produce aderenta la recipientul de recoltare (temperaturi crescute).

Cu toate ca pentru unele teste nu este obligatoriu lucrul in conditii de sterilitate, este de preferat ca reactivii si materialele folosite sa fie sterile pentru a evita prezenta unor contaminanti din mediu, care pot modifica unele rezultate.

Operatiunile care se efectueaza (centrifugare, agitare) nu trebuie sa fie deosebit de insistente pentru a nu prejudicia celulele. Recipientii cu care se lucreaza este preferabil sa fie de plastic.

Activitatea fagocitara a fost estimata prin testul de incluzie al particulelor de carbon.

Sangele a fost prelucrat in maximum 4 ore de la recoltare, astfel: din eprubetele originale continand 0,5 ml sange, dupa adaugarea a 3 µl de tus, s-au prelevat cate 100 microlitri care s-au transferat in 2 ml ser fiziologic; amestecul a reprezentat martorul pentru densitatea optica conferita de prezenta proteinelor plasmatice + tus nefagocitat. Dupa omogenizare prin rasturnari repetate probele s-au termostatat la 37^oC si pentru stabilirea timpului optim de citire s-au prelevat cate 100 microlitri amestec sange + tus la 15 si 30 de minute. Fiecare din aceste cantitati a fost trecuta in 2 ml ser fiziologic. In final, tuburile cu amestec ser fiziologic + sange + tus au fost centrifugate timp de 10 minute la 1500 rotatii/minut. S-a citit densitatea optica a supernatantelor la spectrofotometrul Sumal PE 2 la lungimea de unda de 535 nm in placi cu 96 de godeuri.

Valorile fagocitozei au fost exprimate in unitati de densitate optica (UDO) avand drept etalon serul fiziologic.

In paralel au fost investigate efectele extractelor administrate asupra reactivitatii fagocitozei in vitro. Variantele de lucru au presupus aceleasi manopere si in plus adaugarea a cate 3 microlitri extract si alcool de 70⁰ in momentul initial, fiind lucrate astfel simultan trei variante experimentale.. Extractul alcoolic folosit a fost cel de Echinaceea angustifolia si alcoolul de 70^o.

Rezultate si discutii

Fagocitele din sangele integral au capacitatea de a ingera nu numai bacterii, dar si particule inerte (de carbon, siliciu, etc). Reducerea cantitatii de particule de carbon dintr-un amestec de sange integral si tus de China, evaluata spectofotometric, ofera indicii asupra capacitatii functionale a fagocitelor circulante. Testarea potentialului functional al fagocitelor in vitro ofera informatii despre capacitatea acestora de recunoastere si ulterior inglobare a particulelor "non-self", nu numai inerte dar si biotice (agresori microbieni).

Rezultatele obtinute prin efectuarea testului de inglobare a particulelor de carbon sunt prezentate in tabelele 1 si 2.

Activitatea fagocitara spontana in cadrul primei recoltari, este diminuata, diferenta fata de citirea initiala fiind de numai 0,025 unitati de densitate optica. La a doua prelevare de probe, diferenta creste la 0,039 unitati de densitate optica, ceea ce indica o activare oarecare a fagocitozei, totusi nu suficient de pronuntata, pentru eliminarea infectiei din organism.

Acest rezultat indica o influenta negativa. Persistenta in timp a infectiei micoplasmice asupra procesului fagocitar spontan.

Comparativ cu fagocitoza spontana, atat alcoolul cat si extractul de Echinacea au efecte negative la recoltarea initiala, valorile densitatilor optice fiind crescute comparativ cu cele ale variantei martor. Cu toate acestea, apare o stimulare a fagocitozei de catre alcool dupa 30 minute de incubare, care nu se regaseste in cazul extractului, el avand o activitate inhibitoare.

La cea de-a doua recoltare, atat alcoolul cat si extractul vegetal inhiba fagocitpza, dovedind ca in doza aplicata si in conditiile terapieie cu antibiotice, utilizarea principiilor extractive alcoolice din Echinacea angustifolia nu sunt favorabile stimularii activitatii fagocitare.

Fig.a - Evaluarea activitati fagocitare spontane si stimulate la recoltarea I-a

Fig. b - Valori medii ale indicilor fagocitari spontani si induti prin terapie in vitro la recoltarea a II-a

Figurile a si b ilustreaza clar diminuarea activitatii fagocitare prin interventia cu extracte sau alcool in vitro.

Concluzii

1. La animalele luate in studiu, fagocitoza spontana a fost crescuta (0.171±0.058 to 0.156±0.062 unitati de densitate optica, UDO, in 30 minute) anterior tratamentului, comparativ cu valorile post-terapeutice.
2. Extractul de Echinacea angustifolia a inhibat fagocitoza (de la 0.242±0.160 la 0.247±0.163 UDO).

Bibliografie

1. Almeida, R.A. , Wannemuehler M.J., Rosenbusch R.F. -1992- Interaction of Mycoplasma with alveolar macrophages. Infect. Immun. 60:2914-19
2. Avramidis N., Panayiotis V., Yiangou M., Hadjipetrou-Kourounakis L.- 2002 - Adjuvant regulation of cytokine profile and antibody isotype of immune responses to M. agalactiae in mice, Vet. Microbiol, 88 (325-338)
3. Bara C. - 1996 - Imunologie fundamentala. Edit. Medicala, Bucuresti.
4. Fox L. K., Hancock D. D., Mickelson A. Britten A. Bulk Tank Milk Analysis: Factors Associated with Appearance of Mycoplasma sp. in Milk J. Vet. Med. B 50,
5. Ghergariu S., Pop Al., Kadar L., Spinu Marina - 2000 - Manual de laborator clinic veterinary, Ed. ALL EDUCATIONAL, Bucuresti
6. Goldsby R. A., Kindt T.J., Osborne B.A. - 2001 - Immunology, fourth ed. W.H.Freeman and Comp. New York
7. Madanat A., D. Zendulkov Z., Pospsil: - 2001 - Contagious Agalactia of Sheep and Goats.A Review. Acta Vet. Brno 2001, 70: 403-412.
8. Rapuntean Gheorghe, Marina Spinu, Ovidiu Spinu - 1994 - Lucrari practice de imunologie, Tipo Agronomia , Cluj-Napoca.
9. Roitt I. M., Delves P.J. - 2001 - Essential Immunology, Blackwell Science, USA.
10. Roitt I., Brostoff I., Male D. - 1996 - Immunology. 4^th ed., Barcelona C.V. Mosby.
11. Stagsted J, Young Jf. - 2002 - Large differences in erythrocyte stability between species reflect different antioxidative defense mechanisms. Free Radic Res.,36(7):779-89.
12. Stites Daniel P., Terr Abba J. - 1991 - Basic and Clinical Immunology, Appleton & Lange, Cunnecticut, pag. 718-725
13. Todar K. - 1998 - Immunology and immune defense against microbial pathogens. Bacteriology, Univ. Visconsin-Madison Department of Bacteriology, p. 1-18.
14. Vasiu C. - 2004 - Bacterioze la animale, Ed. AcademicPres, Cluj - Napoca
15. Webb D.R., Winkelstein A.,- 1983 - Imunosupresion, imunopotentation and antiinflamatory drug, Basic and Clin. Imun. L. Publication, Los Altos California, 227-291.