FUZARIOTOXINELE

FUZARIOTOXINELE

Unele tulpini apartinand unor specii potential toxigene din genul Fusarium elaboreaza, in anumite conditii, produse toxice de metabolism care poarta denumirea generica de fusariotoxine. Dintre acestea cele mai importante sunt:

nivalenonul si fuzareonul - elaborate de Fusarium nivale;

diacetoxiscirpenolul - elaborat de F. avenaceum si F. equiseti;

toxina T-2 si toxina B-24 - elaborate de F. tricintum;

toxina F-2 (zearalenon)- elaborata de F.graminearum (G.zeae);

toxina F-3 - elaborata de F. moniliforme

acidul fuzarian - elaborat de F. oxysporum;

substante vomitive - elaborate de F. poae.

Proprietatile fizico-chimice ale fuzariotoxinelor au fost descrise de Christensen si colab. (1965), Giglan si colab. (1966), Mirocha si colab. (1967 si 1969), Burmeister (1971), Palyusik (1972), Vany si colab. 1973) si altii

ZEARALENONUL

Zearalenonul sau fuzariotoxina F-2 este o lactona a acidului rezorcilic elaborata de F. roseum (graminearum, culorum, equisetti, gibosum), F. moniliforme, F. tricinctum si alte specii de micete.

Efectul nociv cel mai evident al acestei micotoxine este estrogenic, ceea ce inseamna ca provoaca estru si cornificarea celulelor epiteliale vaginale la soricioaicele impubere. In experimentele efectuate sobolanite impubere, inoculate intramuscular cu  cantitati progresive de F-2 (20, 40, 160, 350 si 650 mg), s-a stabilit un raport direct proportional intre doza si intensitatea efectului estrogenic exprimat prin cresterea in greutate a uterului in raport cu sobolanitele martore.

S-a mai observat ca greutatea totala a sobolanilor inoculati cu doze mici (20 si 40 mg) a cresut fata de greutatea martorilor, in timp ce la doze mai mari acest fenomen nu a avut loc. Deci, in afara de efecte toxice, F-2 stimuleaza cresterea daca este folosita in doze mici. Bazati pe aceste constatari, unii autori au prelucrat toxina si au obtinut produse stimulante ale cresterii pentru animalele tinere. Se citeaza faptul ca la miei sporul in greutate a ajuns la sa fiecu 40% mai mare decat la martori.

Pentru speciile de Fusarium care o elaboreaza, F-2 este o substanta fiziologica cu un anumit rol in dezvoltarea sexuala a acestora. Compusi similari ca structura chimica cu F-2 au mai fost extrasi din Curvularia, Penicillium steckii Zaleski, P. expansum Link, Nectaria radicola si Monosporium.

Administrata in ratia permanenta a scrofitelor in varsta de 6 saptamani, F-2 provoaca edemul si rubefactia vulvei, prolaps vaginal, cheratinizarea celulelor epiteliale ale vaginului, hipersecretie vaginala, cresterea secretiei de lapte si a dimensiunilor ugerului, hipertrofia glandei mamare. Astfel de manifestari sunt evidente dupa 7 zile de la inceperea experientei.

Elaborarea zearalenonului este influentata de compozitia substratului pe care se dezvolta tulpina de Fusarium. Acest fapt rezulta din lucrarile experimentale efectuate de Cantini si colab. (1973), care au pregatit culturi de F. graminearum pe mai multe medii naturale: boabe de ovaz, de mei, grau, orez, orz, secara, seminte de floarea soarelui, de soia, de arahide, lucerna deshidratata si celuloza cu adaos de mediu Czapek, dupa care s-a procedat la extractie.

In acest scop, culturile au fost extrase la inceput in apa distilata intr-un omogenizator si centrifugate la 6000 rotatii/minut, timp de 20 minute. Dupa indepartarea extractului apos, rezidul a fost extras cu alcool etilic absolut in doua reprize. Extractul alcoolic concentrat de la volumul initial de 200 ml la 25 ml, a fost introdus in furaje, iar alcoolul din ele a fost evaporat la cald. Astfel de furaje au fost introduse in hrana soricioaicelor impubere in varsta de 19-20 zile. Dupa 76 ore, au fost sacrificate si examinate.

Efectul estrogenic, exprimat prin hipertrofia uterului, a avut loc numai la extractele pregatite pe culturi de ovaz, mei, orz, secara, floarea soarelui. Rezultatul cel mai surprinzator a fost reprezentat de lipsa efectului estrogenic al extractelor efectuate din culturile crescute pe grau, cu atat mai mult cu cat celelalte cereale cercetate au dat rezultate pozitive. Explicatia ar consta in lipsa in grau a unor substante necesare sintetizarii fuzariotoxinei (F-2) de catre F. graminearum sau in prezenta in grau a unor substante capabile sa inhibe sinteza micotoxinei estrogenice.

Extragerea curenta a zearalenonei se face din culturi pe porumb boabe, incubate timp de 2 saptamani la 22-260C si mentinute alte 6 saptamani la 10-120C. cultura uscata (umiditate intrinseca 15 %) se extrage cu aparatul Soxhlet timp de 16 ore cu clorura de metilen. Urmeaza evaporarea extractului pana ce se obtine o substanta siropoasa. Peste aceasta se adauga acetonitril si eter de petrol in parti egale, se separa cele doua faze cu palnia de separare. Fuzarotoxina din faza acetonitrilica se concentreaza prin evaporarea extractului. Substanta ramasa se preia cu cloroform si se determina cromatografic in prezenta de F-2 standard, sau pe sobolanite impubere.

Extragerea directa din probele de furaje bine macinate se poate realiza prin doua procedee:

1. Primul procedeu consta in amestecarea a 50 g proba cu 5 g chiselgur, la care se adauga 150 ml eter de petrol si se agita intens timp de 2-4 minute. Acest amestec se filtreaza prin hartie de filtru si produsul ramas pe filtru se spala de doua ori, cu cate 20 ml eter de petrol. Substanta ramasa si uscata se extrage, timp de 4 ore, intr-un aparat Soxhlet cu clorura de metilen sau cu cloroform. Dupa concentrare, extractul se trece printr-o coloana cu sulfat de sodiu anhidru, dupa care coloana se spala cu cloroform.

2. Cel de al doilea procedeu (rapid) consta in amestecarea a 50 g proba cu 5 g chiselgur, cu 90 ml cloroform si 10 ml apa. Acest amestec se agita 5 minute intr-un omogenizator de mare turatie, dupa care se separa fazele cu o palnie de separare.

In vederea cromatografiei in strat subtire, extractele obtinute prin ambele procedee se concentreaza la 10 ml sau, in caz de rezultat negativ, pana la 2 ml. Cromatografierea se face pe placi cu grosimea stratului de Kisselgel de 250 microni si inactivate la 105⁰C. Pe placa se pun 0,02 ml extract, paralel cu extractul de analizat amestecat cu F-2 (standard) si numai cu F-2 (standard). Placile se developeaza cu cloroform-etanol (96:4) si se citesc in lumina cu lungime de unda de 366 nm.

Determinarea semicantitativa se face prin compararea fluorescentei extractului de analizat cu diverse cantitati de F-2 (1,5; 10; 20 mg si chiar mai mult) dizolvate intr-un volum egal de cloroform. Continutul de F-2, raportat la 1000 g proba, se calculeaza dupa formula:

In care :

Sx = cantitatea de F-2 in extractul de analizat;

Ve = cantitatea de extract de analizat in ml;

Vk = cantitatea (in ml) extractului de analizat in ml depus pe placa;

M = cantitatea (in g) probei extrase;

Numarul obtinut in urma calculului este egal cu cantitatea de F-2 din furajul de analizat exprimata in mg sau ppm. Acest numar trebuie corectat cu niste coeficienti de recuperare valabili pentru conditiile de lucru din fiecare laborator.

Pentru aflarea acestor coeficienti, intr-un anumit sortiment de nutret se introduc cantitati cunoscute de F-2 (2, 4, 10, 20, 40, 50 ppm) si se determina prin metoda de extragere la cald sau prin cea rapida cat anume se poate decela.

Rezultatul obtinut pentru fiecare cantitate de F-2 si pentru fiecare dintre metode arata eficacitatea de decelare a F-2 in probele de furaje supuse analizelor si corespondente sortimentului de furaj pentru care s-au determinat indicii de recuperare.

In conditii naturale, F-2 si F-3, in asociatie cu alte micotoxine, provoaca forma clinica estrogenica de fuzariotoxicoza la porcin, la taurine si la alte specii.

TOXINA T-2

Plecandu-se de la observatia ca extractele de Fusarium tricinctum, izolate din porumbul nociv pentru animale, sunt mai active decat cele din alte specii de Fusarium, s-a cercetat componentele toxice ale acestei specii, reusindu-se a se extrage 3 fractiuni: toxina T-2, toxina 4-dezacetoxi T-2 si un butenolid.

Toxina T-2 este cea mai importanta componenta a tulpinii din care s-au extras cele 3 componente mentionate.

La sobolani, aceasta fuzarotoxina opreste cresterea si produce inflamatii ale pielii in jurul nasului si gurii. In ficatul sobolanilor, se observa degenerarea citoplasmatica. La o taurina de 350 kg, careia i s-a administrat aceasta toxina intramuscular, s-au observat pierderi in greutate si moarte dupa 65 zile.

Anatomopatologic, s-au observat hemoragii generale interne, corespondentecelor din intoxicatia cu porumb mucegait. Dupa unii autori, aceasta toxina si nu fuzariogenina ar avea un rol preponderent in aleucia toxica alimentara la om si la animale. Confuzia isi are originea in faptul ca in unele determinatoare F. sporotrichoides, F. poae si F. ticinctum sunt incluse in specia de Fusarium tricinctum..

Pentru extragerea T-2 din F. tricinctum, Burmeister (1971) a insamantat 300 g porumb alb, uruit si sterilizat (aflat in flacoane Fernbach) cu 2 ml suspensie conidiana de F. tricinctum dintr-o cultura pe agar cu drojdie si cu malt, incubata 14 zile la temperatura de 150⁰C. In flacoane, s-au adaugat 100 ml apa distilata, si s-au mentinut 3 saptamani la 150⁰C.

Mai departe, s-a supus continutul unui flacon extractiei cu 1 litru de cloroform acetona (85 : 15), timp de 2-3 minute, intr-un agitator de tip Warning. A urmat o filtrare, indepartarea solventului si extragerea masei consistente ramase de inca 3 ori in acelasi mod. Produsul ramas in urma celor 4 extractii s-a concentrat la 75 ml pe un agitator rotativ, obtinandu-se, un reziduu uleios. Peste acesta, s-au adaugat 2 volume de acetona, iar prin picurare in hexan s-a obtinut o substanta uleioasa. Aceasta s-a decantat si s-a eliminat, deoarece in amestecul in hexan toxina ramane dizolvata in acetona care se afla in hexan in proportie de 5-10%.

Dupa aceea, pe masura ce solventul s-a evaporat la temperatura camerei, toxina a cristalizat impreuna cu o cantitate mica de substanta vascoasa. Acest produs s-a dizolvat in 10 ml acetona, la care s-au adaugat 1-2 g carbune activat. Dupa 30 minute, a urmat o filtrare prin hartie de filtru Watman 1. Ceea ce a ramas pe hartia de filtru s-a spalat, de 5 ori, cu cate 10 ml acetona. Printr-o a 2-a filtrare, s-au eliminat resturile de carbune, dupa care volumul de acetona s-a concentrat .la 10-15 ml. In acest concentrat, s-a turnat hexan pana ce s-a tulburat si s-a clarificat cu cateva picaturi de toluen.

Toxina T-2 a cristalizat in amestecul hexan-acetona-toluen, lasat la temperatura camerei 18 ore.

A urrnat uscarea si cantarirea toxinei.

DIACETOXISCIRPENOLUL

Aceasta fuzariotoxina a fost pusa in evidenta 1a Fusarium scirpi var. acuminatum, F. equiseti, F. avenaceum, F. bacterioides, F. tricinctum (Behringer, 1972).

Din punct de vedere chimic, diacetoxiscirpeno1ul este un diacetoxi-alcool, tetraciclic optic activ (C₁₀H₂₆O₇) cu punctul de topire 1a 161,2°C.

Substanta este hepatotoxica si dermonecrotica. Injectat la iepuri, diacetoxiscirpenolul provoaca apatie, respiratie prolungita, cianoza, diaree hemoragica, vomismente, tremuraturi, tahicardie si moarte dupa 1049 ore. DL₅₀ in mg/kg in urma inocu1arii i.v. sunt: 12 pentru soarece; 1,3 pentru sobolan; 1 pentru iepure si 1,1 pentru caine. Dozele maxime tolerate, tot in mg/kg si pe aceeasii cale de inoculare, sunt: 6 pentru soarce, 0,55 pentru sobolan; 0,30 pentru iepure si 0,60 pentru caine. Diacetoxiscirpenolul este toxic pentru pastrav.

Concentratiile minime ihibitoare, exprimate in mg/ml, pentru diferite bacterii si levuri sunt: 1 ( pentru M. pyogenes var. aureus, si B. subtilis, 32 pentru E. coli, circa 500 pentu C. albicans si circa 1000 pentru Sacch. cerevisiae.

FUSARIOGENINA

Este elaborata de variantele speciei F. sporotrichella. Din punct de vedere chimic, este un ciclopentan-perhidrofenantren cu un inel cu legatura dubla de tip lactonic (C₂₄H₃₆O₄). Aceast fuzariotoxina este dermonecrotica, are efecte trombopenice si se pare ca ar fi cauza aleuciei toxice alimentare la om si la animale.

FUZARIOTOXICOZA PORCINELOR

La porcine, se cunosc doua forme clinice principale de fuzariotoxicoza care evolueaza in functie de predominanta unora sau altora dintre fuzariotoxinele cunoscute in furaje.

Forma toxicozica este provocata de fuzariogenina, toxina T-2 si alte fractiuni toxice. Animalele bolnave prezinta inapetenta, abatere, ascundre in asternurt, diaree rebela, abdomen supt, sete, slabire progresiva.

La unele animale, se observa pe laturile corpului sau intre ongloane niste indurari uscate sau cu o secretie seropurulenta. Pot fi prezente si edeme ale calpului si gatului care provoaca dispnee si stari asfixice.

Din partea sistemului nervos central se observa o scadere a sensibilitatii, mers vaccilant, spasme sau contractii ale unor grupe de muschi.

In faza initiala creste numarul leucocitelor; mai tarziu, scade pana la 5 000-6 000/mm3.

Forma estrogenica este, provocata de fuzariotoxinele F-2 si F-3. La scrofitele impubere, sunt prezente edeme si rubefactii ale vulvei, marirea in volum a vaginului, cervixului si coarnelor uterine, prolapsuri vaginale, uterine si rectale. Pe langa asfel de manifestari caracteristice hiperestrogenismului, se mai adauga: consumul partial al ratiei pana la refuz, incetinirea cresterii, gastroenterite, necroze cutanate, tu1burari nervoase, vomismente.

La scroafele adulte, boala se manifesta prin dereglari ale ciclului sexual, calduri false si prelungite, gestatii si lactatii false. Coarnele uterine prezinta depuneri adipoase pe seroasa viscerala si pe ligamentele largi. Peretii coarnelor uterine nu mai au caracterul miometralnormal, mucoasa uterina este palida, lucioasa, hipertrofiata si fara aspectul dantelat. Pe suprafata mucoasei uterine se observa depozite cu aspect grunjos, de culoare galben-maro si usor detasabile.

Manifestarile caracteristice hiperetrogenismului impiedica nidarea zigotilor in uter si influenteaza negativ fecunditatea si prolificitatea (Mitroiu si col. 1973). Astfel de porumb refuzat de porci este consumat cu placere de sobo1ani si acestia mor. Aceasta observatie confirma cauza mortii in masa a sobolanilor in focarele de fuzariotoxicoza. In aceste focare, porcinele refuza nutreturile combinate pregatite pe baza de porumb atacat de Fusarium, iar sobolanii il consuma si mor.

Se crede ca nu fuzariotoxinele propriu-zise provoaca asemenea fenomene, ci alte substante cu efecte asemnatoare cu ale emeticului (emetic-toxina) care apar in porumb sub influenta fuzariilor si care nu au fost identificate inca, din punct de vedere chimic.

In practica, cele trei forme clinice nu evolueaza ca entitati morbide strict separate una de alta din cauza ca in furajele, care stau la baza etiologiei lor, se gaseste un complex de fuzariotoxine in asociatie cu alte micotoxine.