INVESTIGAREA ACTIVITATII FAGOCITARE GLOBALE 'IN VITRO' FOLOSIND TESTUL DE ÎNGLOBARE

INVESTIGAREA ACTIVITATII FAGOCITARE GLOBALE 'IN VITRO' FOLOSIND TESTUL DE ÎNGLOBARE

A PARTICULELOR DE CARBON

In circulatie sau in diferite tesuturi (ficat, splina, pulmon, ganglionii limfatici) exista populatii de celule capabile de a ingloba materiale straine de organisme (particule inerte sau vii-bacterii, virusuri, fragmente proteice, etc.) sau componente proprii modificate. Aceste celule alcatuiesc sistemul fagocitar si pot fi departajate in doua mari categorii: celule polimorfonucleare (granulocitele neutrofile) si celule mononucleare (macrofagele). Utilizandu-se capacitatea acestor celule de a fagocita elementele mentionate in organismele vii, s-au pus la punct diferite teste prin care se poate, in conditii experimentale, evalua functionali­tatea sistemului fagocitar.

Suspensia de particule de carbon reprezinta un cumul de particule fine intr-un mediu lichid izotonic, particule care pre­zinta dimensiuni favorabile fagocitarii. Activitatea fagocitara se poate aprecia, folosindu-se aceasta suspensie atat in vitro cat si in vivo

Tehnica in vivo (utilizata de obicei la animale mici), presupune inocularea suspensiei de carbon intravenos intr-una din venele periferice (safena, brahiala) si ulterior canularea venei opuse si recoltarea de sange la diferite intervale de timp. Cu cat activitatea fagocitara se presupune a fi mai intensa, cu atat timpul de contact va fi mai scurt. Pe masura inglobarii particulelor de carbon acestea sunt indepartate din sange si supernotantul unui centrifugat dintr-un astfel de sange va fi mai limpede. Metoda este destul de laborioasa pentru ca uneori,mai ales la animalele foarte tinere, este dificil de canulat venele membrelor sau de mentinut canula un timp mai indelungat la nivelul acestora.

Tehnica 'in vitro' evita aceste inconvenientele re­colteaza de la animal sange venos care este apoi transferat in tuburi de sticla neutra si se pune in contact cu suspensia de carbon, urmand dozarea activitatii fagocitare.

1.1. Material si metoda

Testul se efectueaza, asa cum s-a aratat, in afara organismului, pe probe de sange. Sangele se recolteaza in mod obisnuit dimineata, inainte de furajarea sau adaparea animalului, prin punct venoasa. Recoltarea se face in seringi sterile, cu ace individuale, utilizand ca substanta anticoagulanta heparina, in cantitate de 50 UI/ml. Dupa omogenizare, sangele se trece cantitativ in tubul din sticla neutra avand o capacitate de 10 ml. In mod obisnuit, de la fiecare animal se recolteaza cate 4 ml sange. Testele efectuate pe cantitati mai mici de 2 ml dau rezultate variabile. Este preferabil in aceste cazuri sa se aplice alte metode de dozare a activitatii fagocitare sau chiar testarea in vivo.

Din proba de sange prelevata se scad 0,15 ml care se trec cu ajutorul pipetei automate in 3 ml ser fiziologic sau s tie tampon,in functie de specie. Amestecul 3 ml ser fiziologic ml sange va reprezenta martorul pentru testare.

La sangele ramas in tub se adauga suspensia de parti de carbon in cantitate de 0,02 ml.

Obtinerea suspensiei de carbon se face prin centrifugarea la 8000 rpm timp de 30 minute a tusului de China. Supernatantul astfel obtinut contine un numar suficient de particule de carbon, de dimensiuni potrivite pentru a se putea realiza procesul de fagocitoza.

Dupa adaugarea suspensiei de tus si omogenizare probele de sange in amestec se introduc la termostat la 37°C (temperatu­ra poate varia in functie de specie) si se mentin aici pana la incheierea testarii.

La diferite intervale (stabilite experimental pentru fiecare specie: 5_f10,15,20,30,40,45,60,120 minute sau mai mult) din amestec se preleva cate 0,150 ml care se trec cantitativ in­tr-un tub cu 3 ml ser fiziologic sau solutie tampon. Dupa ce toate prelevarile au fost realizate, toate tuburile continand cei 3 ml ser fiziologic + 0,15 ml amestec (sange+tus) si deasemenea tubul martor (initial) se centrifugheaza 5 minute la 800 rpm. Apoi se citeste densitatea optica a martorului fata de serul fiziologic sau solutia tampon la lungimea de unda de 535 nm si drum optic de 1 cm. Citirea probelor prelevate la intervalele de timp stabilite se face fata de martor, aducandu-l pe acesta la O. In aceste experi­mente citirile s-au facut la spectofotometrul Specol 10, Karl Zeiss, Yena.

Rezultate

Valorile obtinute s-au exprimat in unitati de densitate optica. S-au calculat valori medii si deviatii standard pentru fie­care din timpii de incubare investigati.

Datele obtinute au putut fi folosite pentru stabilirea relatiei matematice care defineste dependenta densitatii optice de timpul de incubare pentru fiecare specie.

Discutii

Testarile efectuate prin folosirea acestei tehnici au demonstrat utilitatea ei in stabilirea activitatii fagocitare la diferite specii. Rezultatele obtinute (vezi capitolul II,III,IV) sunt reproductibile si pot fi utilizate in continuare pentru sta­bilirea unei relatii matematice definitorii pentru activitatea fagocitara in functie de timp.

Testul este usor de efectuat. Nu presupune probe biologi­ce a caror recoltare este dificila si nici aparatura complicata. Se cuantifica concomitent activitatea micro- si macrofagelor cir­culante, amintindu-se insa din calcul activitatea fagocitelor fixe hepatice, splenice sau pulmonare.