STAHIBOTRIOTOXINELE

STAHIBOTRIOTOXINELE

Din culturile de S. alternans s-au extras doua fractiuni toxice: stahibotriotoxina A si stahibotriotoxina B

Cunoscand lucrarile autorilor Sarchisov (1954) si Palyusik (1970), Mitroiu (1971) a elaborat, pentru prima data in tara noastra, o metoda de extragere a stahibotriotoxinelor.

In acest scop, se pregatesc culturi de S. alternans, de preferinta pe uruiala de orz sterilizata in autoclav de doua ori la temperatura de 120⁰C. Culturile se macina dupa ce au fost uscate timp de 24 ore 1a temperatura de circa 60°C. Din pulberea rezultata se face un "cartus" de 100 g care se supune extragerii, timp de 7 ore, in aparatul Soxhlet cu eter etilic. Urmeaza evaporarea extractantului de la volumul initial de 400 ml pana 1a 50 ml pe o baie de nisip cu temperatura de aproximativ 80°C.

Mai departe, se precipita stahibotriotoxina din cei 50 ml eter etilic cu ajutorul a 250 ml eter de petrol care se toarna, picatura cu, picatura, intr-un pahar Berzelius peste, cei 50 ml extract eteric concentrat. In acest pahar, extractul eteric se agita uniform cu un agitator magnetic pe care se aseaza paharul cu extractul eteric peste care se toarna eterul de petrol cu ajutorul unei biurete.

Se obtine o emulsie opalescenta de culoare cenusie. Aceasta se filtreaza imediat prin hirtie de filtru pe care ramane o substanta vascoasa care, dupa uscare la temperatura camerei, se racleaza de pe hartia de filtru si se tritureaza, obtinandu-se stahibotriotoxina A sub forma de pulbere.

Pentru obtinerea stahibotriotoxinei B, extractul eteric concentrat se redizolva in eter etilic dupa circa doua saptamani de pastrare la frigider si se filtreaza prin hartie, de filtru. In urma operatiei de filtrare, stahibotriotoxina A trece prin filtru, in timp ce pe acesta raman niste cristale - stahibotriotoxina B.

Determinarea gradului de toxicitate a stahibotriotoxinei se poate face pe animale de 1aborator, pe culturi celulare sau pe protozoare.In tara noastra, Mitroiu si colab. (1972), cunoscand rezu1tatele obtinute de Pa1yusik (1970), au determinat gradul de toxicitate a stahibotriotoxinelor extrase din 14 tulpini de S. alternans, dintre care:

5 tulpini izolate din focare de stahibotriotoxicoza la cabaline;

1 tulpina izolata dintr-un focar de stahibotriotoxicoza la ovine;

2 tulpini izolate din focare de stahiboiriotoxicoza 1a porcine;

3 tulpini primite de la Institutul de cercetari al Academiei Ungare de Stiinte.

3 tulpini primite de la Instiutul de biologie Bucuresti.

Find insolubile in apa, cele 14 stahibotriotoxine au fost dizolvate, initial, in a1cool etilic. Dupa aceea s-a adaugat apa si s-a evapora complet alcoolul. Substanta ramasa in apa sub forma de emulsie a fost inoculata i.p. la soareci si la pui de gaina.

Aceste cercetari au condus la concluzia ca stahibotriotoxinele studiate omoara, in 24 ore, soarecele in varsta de 30 zile si cu greutatea de 18 g, in doze care variaza de la 8 pana la 20 mg substanta activa.

Cercetarile privind determinarea DL₅₀ (metoda Karber) pe pui de gaina in varsta de 3 zile si cu greutatea de 10 g, efectuate cu 2 stahibotriotoxine, extrase din tulpini izolate din focare de stahibotriotoxicoza la cabaline, au permis determinarea unor DL₅₀ de 1,25 mg pentru o tulpina si 7,5 mg pentru cea de a doua tulpina in 48 ore.

Aceste cercetari scot in evidenta ca intre diferitele stahibotriotoxine exista diferente in ceea ce priveste gradul de toxicitate, de unde rezulta necesitatea determinarii toxcicitatii tulpinilor incriminate in etiologia stahibotriotoxicozei.

Palyusik (1970) stabileste urmatoarele DL₅₀, raportate la 100 grame greutate corporala, in cazul inocularii stahibotriotoxie pe cale intraperitoneala:

4,45 micrograme pentru sobolanul cu greutate de 100 grame;

6,24 micrograme pentru cobaiul cu greutatea de 225 grame;

5,16 micrograme pentru soarecele cu greutatea de 18,6 grame;

9,20 micrograme pentru puiul de greutatea de 42,7 grame;

13,60 micrograme pentru soarecele cu greutatea de 26 grame.

Pentru embrionul de gaina in varsta de 6 si 10 zile, inoculat in sacul vitelin, acelasi autor a stabilit DL₅₀ de 35,90 si, respectiv 175,5 micrograme

In scopul gasirii unui test mai rapid si mai ieftin pentru determinarea gradului de toxicitate al stahibotriotoxinei, Iftimovici (1972) au cercetat citatoxicitatea a 6 din cele 14 stahibotriotoxine studiate in prealabil pe soareci sau pe pui de gaina. S-a ajuns la concluzia existentei unei concordante perfecte intre rezultatele care se obtin pe animale de experienta si pe cu1turi celulare.

Incercarile efectuate de noi in scop de determinare a toxicitatii stahibotriotoxinei pe protozoare dupa metoda elaborata de Spesivteva (1960) si Pa1yusik (1970) au fost pozitive. Procedeul consta in amestecarea culturilor de Paramaecium caudatum cu diferite dilutii de stahibotriotoxina si urmarirea la microscop a miscarilor protozoaru1ui pana in momentul mortii, marcata de spargerea capsulei acestuia.

Actiunea stahibotriotoxinei asupra organismului animal a fost studiata experimental. de Mitroiu si col. (1973) in cercetari histologice si histoautoradiografice.

Cercetarile histologice, efectuate pe soareci in varsta de 3 zile (18 g), au condus la concluzia ca mecanismul patogenetic al intoxicatiei stahibotriotoxinice corespunde cu cel descris de alti autori (Citoler si Maurer, 1963; Gerhard si col., 1970) pentru intoxicatia cu tetraclorura de carbon.

Este vorba de constatarea in lobulii hepatici ai soarecilor, la 3 ore dupa administrarea i.p. a stahibotriotoxinei, a doua zone distincte intre ele: o zona centrala necrotica cu dezintegrarea nucleilor si degenerarea granulara sau grasoasa a citoplasmei si o zona periferica practic nemodificata histologic.

In ficat, s-au mai observat si alte leziuni: hiperemii, ectazii, hemoragii, infiltratii perivasculare, focare necrotice.

Cercetarile histoautoradiografice, efectuate pe pui de gaina in varsta de 3 zile (40 g), au dovedit ca stahibotriotoxina are efecte inhibitoare asupra ritmului normal de proliferare a hepatocitelor, a celulelor pancreasului endocrin si a celulelor musculare netede si striate. Acest fenomen isi are originea in blocarea sintezei acidului deoziribonucleic.

STAHIBOTRIOTOXICOZA PORCINELOR

La porcine, stahibotriotoxicoza a fost semnalata pentru prima data de Kosevoi (1962).

Negru si col. (1967) descriu stahibotriotoxicoza in doua unitati de porcine amplasate in zona de vest.

Semne de boala, in circa 20% din boxele cu purcei in varsta de cateva zile, au fost traduse clinic prin stranut, disfagie, congestia mucoasei bucale, congestie si edem palpebral, aproape simultan aparand pe rat zone congestive si hemoragice cu mortificare uscata, superficiala a pielii.

Tegumentul aparea, in aceasta zona, acoperit cu o foita de culoare galbena-bruna, cu aspect pergamentos si cu extindere apreciabila. Orificiile nazale au devenit stenozate, determinand respiratie zgomotoasa. La nivelul mucoasei bucale, s-au constatat zone congestive care, adeseori, deveneau ulcerative, iar la nivelul limbii au aparut modificari marginale, uneori si pe partea dorsala.

S-au mai intalnit, destul de frecvent, zone de culoare albicioasa, amplasate periocular si peribucal, mai rar la baza urechilor si pe partea inferioara a abdomenului.

Starea generala s-a modificat la scurt timp dupa aparitia semnelor externe, observandu-se diminuarea sau absenta apetitului, somnolenta si, mai rar, stari de excitatie. Temperatura s-a mentinut in limite normale.

Curand purceii au prezentat decubite laterale si respiratie ampla, adeseori bucala. Dupa o evolutie a bolii de 4-8 zile, o parte dintre purcei s-au redresat clinic, o alta parte (in special cei cu vitalitate redusa) au murit.

La scroafele mame, nu s-a constatat afectarea starii generale, insa in jurul mameloanelor s-au observat zone congestive, apoi dermonecroza superficiala usor sensibila.

Aceste leziuni, care au disparut spontan dupa doua saptamani, au determinat o diminuare reflexa a secretiei lactate.

Examenul necropsic a mai evidentiat aspectul de carne fiarta al miocardului, ficat degenerat cu aspect argilos, rinichi palizi cu pete si cu puncte hemoragice in parenchim.

In stomacul purceilor, s-a observat mucoasa inflamata si uneori, necroze si ulceratii.

Examenul histologic a evidentiat o necroza a epiteliilor de acoperire la nivelul pleoapelor si ratului. Pe limba, zonele de necroza au fost circumscrise si au cuprins epiteliul in totalitate, uneori mergand pana la muschii limbii.

Rinichiul si ficatul au prezentat grave modificari alterative de tipul distrofiilor hidropice. Epiteliul tubilor renali au prezentat vacuolizare, unificarea celulelor tubulare intr-o masa deplasata spre centru, ocupand lumenul tubilor. Unii nuclei erau disparuti, altii in diverse faze de necrobioza. Glomerulii erau atrofici, capsula lui Bowman ingrosata, iar nucleii celulelor endoteliale din capilarele glomerulare picnotici. In ficat, s-a constatat o ectazie a capilarelor sinusoide, picnoza nucleilor celulelor lui Kupfer, iar celulele hepatice au prezentat degenerescenta vaculoar-granulara.

La examenul micologic al paielor folosite ca asternut pentru purcei si pentru scroafele mame, s-au identificat urmatoarele ciuperci: Stachybotrys alternans, Fusarium graminearum, Fusarium roseum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus versicolor, Scopulariopsis brevicalis, Absidia ramosa, Mucor, Penicilium si altele. Proba dermala pe iepure, efectuata cu extracte de F. graminearum, F. roseum si S. alternans a fost pozitiva.

Discutand rezultatele obtinute, autorii arata ca tabloul clinic, anatomopatologic, datele epizootologice si probele de laborator pledeaza, in favoarea diagnosticului de micotoxicoza in care actiunea principala au avut-o ciupercile din genurile Stachybotrys si Fusarium. Ingestia micotoxinelor s-a facut prin actul sugerii de pe tegumentul contaminat cu ciuperci al scroafelor mame si prin inhalatie din asternutul mucegait.