Biotehnologii de conversie a deseurilor vitivinicole sub forma de biomasa proteica

Conform legislatiei Uniunii europene, "biomasa re­prezinta fractia biodegradabila a produselor deseurilor si reziduurilor din agricultura (inclusiv substantele ve­getale si cele animale), domeniul forestier si industriile conexe acestuia, precum si fractia biodegradabila din deseurile municipale si cele industriale"

Biomasa reprezinta resursa regenerabila cea mai abundenta de pe planeta. Aceasta include absolut toata materia organica produsa prin procesele metabolice ale organismelor vii. Biomasa este prima forma de energie utilizata de om, odata cu descoperirea focului.

"Prin ''deseu'' se intelege orice obiect sau substanta [] pe care proprietarul acesteia il/o arunca sau intentioneaza sa il/o arunce" [Directiva 75/442/EEC - definitei juridica]

Oenologia are ca obiect studiul tehnologiei de preparare a vinului, incepand cu strugurii, ca materie prima si terminand cu livrarea produsului finit. Ca stiinta, oenologia are ca scop sa ofere practicii vinicole cele mai avansate metode si procedee pentru realizarea unor vinuri de calitate superioara, calitate care sa se mentina pana la masa consumatorului.

Oenologia cuprinde doua parti, care se interconditioneaza reciproc:

Oenologia generala - se ocupa cu studiul materiei prime, a proceselor de ordin fizico-chimic si biochimic care se petrec in timpul prelucrarii strugurilor, fermentatiei mustului, maturarii si invechirii vinului;

Oenologia speciala - se ocupa cu tehnologii de preparare a diferitelor tipuri de vinuri si bauturi speciale (vinuri spumante, vinuri spumoase, distilate, etc.), precum si cu valorificarea produselor vinicole secundare (deseuri vinicole : drojdie, tescovina, seminte, tartrati, etc.).

In majoritatea tarilor, cu industria vinicola dezvoltata, prelucrarea resurselor secundare ale vinificatiei capata o importanta tot mai mare, deoarece aceasta problema tine si de lupta impotriva poluarii mediului inconjurator.

In tara noastra vinificatia este una din principalele ramuri ale economiei nationale,

anual acumulandu-se in continuu diverse tipuri de deseuri. Pana in prezent persista ideea poluarii minime a mediului de catre industria vinicola comparativ cu alte ramuri. Conform datelor existente, o intreprindere de prelucrare a strugurilor cu un volum de 10 mii tone, arunca anual impreuna cu apele reziduale substante organice- 19,9 t, , substante nedizolvate -15,6 t, substante minerale - 7,4 t, compusi ai fosforului - 0,2 t. Conform calculelor acest prejudiciu corespunde cu unul al orasului cu 37 mii locuitori, iar pagubele de pe urma poluarii mediului sunt enorme.

Tratarea si valorificarea deseurilor vinicole sunt redate in multiple surse bibliografice, deoarece se pune accentul pe aplicarea tehnologiilor fara deseuri si pe prelucrarea rationala a lor in scopul obtinerii unor produse de o valoare economica ridicata . Tratarea deseurilor vinicole este bine venita atat pentru sfera industriala, cat si ecologica, deoarece din cantitatea totala a strugurilor prelucrati se obtine doar 65-69% vin, restul revenind deseurilor vinicole.

Gestionarea corecta a multor deseurilor ar permite nu numai protejarea mediului inconjurator, totodata ar putea duce la obtinerea unui venit economic si rezolvarea partiala a problemei sociale - crearea locurilor de munca suplimentare. Prelucrarea rationala a produselor vinicole secundare ofera posibilitatea obtinerii unor produse cu valoare apreciabila pentru o serie de industrii (alcool etilic, acid tartric, polifenoli, ulei din seminte, colorant alimentar, aminoacizi, furfurol etc) .

VALORIFICAREA REZIDUURILOR VINICOLE

Din industria vinului rezulta o serie de reziduuri vinicole, din care enumeram:

tescovina rezultata la presarea strugurilor si la presarea bostinei fermentate (in cazul vinurilor rosii);

ciorchinii, care se separa inainte de presare;

drojdiile care se depun pe fundul vaselor dupa fermentarea vinului;

sedimentele care se formeaza dupa alcoolizarea vinului si a mustului;

tirighia care se depune pe peretii vaselor in timpul fermentarii mustului si depozitarii vinului;

borhotul care rezulta de la distilarea vinului pentru coniac.

VALORIFICAREA TESCOVINEI

Prin tescovina se intelege subprodusul rezultat de la presarea strugurilor si a mustuielii dulci sau fermentate. In constitutia sa intra ciorchinii, pielitele, semintele si resturile de must sau vin neextrase la presare. Datorita componentilor ei valorosi, glucide, alcool etilic, saruri tartrice si ulei de seminte, tescovina poate fi valorificata obtinandu-se furaje proteice, acid tartric, alcool, ulei alimentar, ulei tehnic, tanin. Astfel, din 100 kg tescovina se pot obtine circa 3 litri alcool etilic pur, 3 kg acid tartric, 4 kg ulei, 1,5 kg tanin, iar reziduul ramas poate constitui un material valoros pentru furajarea animalelor.

Din tescovina proaspata, nefermentata rezultata de la presarea strugurilor rosii, intens colorati, se pot extrage substante colorante prin difuziune, iar solutia obtinuta este concentrata si apoi folosita drept colorant alimentar.

Actualmente, in tara noastra tescovina se valorifica in vederea recuperarii alcoolului si intr-o proportie foarte mica pentru obtinerea tartratilor si uleiului.

Pentru obtinerea rachiului de tescovina se folosesc instalatii discontinue incalzite la foc direct (tescovina imersata) sau indirect (tescovina neimersata) sau incalzite cu abur direct sau indirect.

La procedeele moderne de prelucrare a tescovinei intervin urmatoarele operatii:

extractia zaharurilor (alcoolului) si a tartratilor;

precipitarea tartratilor sub forma de tartrat de calciu;

separarea si uscarea tartratului de calciu;

fermentarea solutiei de zaharuri, in cazul tescovinei dulci;

recuperarea alcoolului;

uscarea tescovinei utilizate;

separarea semintelor si a pielitelor.

Extractia substantelor solubile din tescovina se realizeaza in extractoare continue de tipul celor utilizate in industriile extractive, insa construite din materiale antiacide, iar in cazul prelucrarii tescovinei fermentate trebuie sa fie si etanse pentru a preveni pierderile de alcool. Ca solventi se folosesc:

apa demineralizata, cu temperatura de circa 60⁰C sau supraincalzita la circa 110⁰C, care este ieftina si necorosiva, insa nu solubilizeaza tartratul de calciu;

solutie de HCl (pH circa 3) preparata cu apa demineralizata. Desi este mai scump ca acidul sulfuric, prezinta urmatoarele avantaje: la neutralizare se formeaza CaCl₂ solubila, ce nu impurifica tartratul de calciu;

solutie de H₂SO₄, care nu necesita la preparare apa demineralizata si este mai ieftina, insa la neutralizare formeaza CaSO₄ care impurifica tartratul de calciu;

solutiile alcaline, mai putin corosive, care sunt mai scumpe ca solutiile acide si pH-ul ridicat favorizeaza infectiile microbiene si impurificarea tartratului de calciu cu saruri minerale si coloizi.

APA

TESCOVINA PROSPATA

 

Cantarire

Maruntire

Spalare

Filtrare

Tescovina spalata Solutie de difuzie

Presare Filtrare

Precipitare

Uscare Separare precipitat Solutie bogata in

glucide

Separare Uscare

Fermentare

Tartrat de calciu

Seminte Pielite

Distilare

Presare Extractie Macinare

Alcool

Acid tartric

Ulei alimentar

Ulei tehnic

Tanin

Faina furajera

Furaje proteice

Turte, sroturi

Fig.Schema valorificarii complexe a tescovinei proaspete

Din literatura de specialitate se desprind urmatoarele conditii optime la extractia tescovinei:

prelucrarea imediata a tescovinei dupa operatia de presare a bostinei;

afanarea tescovinei, astfel ca particulele sa aiba dimensiunile de 3÷7 mm;

apa de extractie trebuie acidulata cu H₂SO₄ la pH de circa 3 si incalzita la temperatura de 75÷80⁰C; in extractor temperatura se va mentine la circa 60⁰C;

durata procesului de extractie 40÷50 minute;

numarul treptelor de extractie sa nu fie mai mic de patru;

viteza de spalare a tescovinei intr-un strat de circa 150 mm, care va fi de 0,001÷0,0016 m³/s·m² si hidromodul intre 0,7÷1;

tescovina epuizata trebuie sa contina maximum 0,7% zaharuri, 0,4% alcool si 0,15% tartrati;

in cazul tescovinei dulci, sucul de difuziune trebuie imediat prelucrat dupa una din schemele: precipitare acid tartric - fermentare - distilare sau fermentare - distilare - precipitare acid tartric.

Precipitarea tartratilor din solutia de difuziune se face dupa filtrarea acesteia (filtre cu site de panza), cu ajutorul laptelui de var (8%) sau a carbonatului de calciu, la temperatura de circa 60⁰C, in reactoare prevazute cu pH-metre. Cand la extractie se utilizeaza apa dedurizata este necesara tratarea in prealabil a solutiei cu clorura de calciu (0,2÷0,3%); se formeaza, pe langa tartrat de calciu, acid tartric ce se precipita cu lapte de var pana la pH = 5,5; neutilizarea clorurii de calciu conduce la micsorarea randamentului cu circa 40%, deoarece se formeaza tartratul neutru de potasiu care ramane in solutie.

Solutia neutralizata se supune operatiei de separare si spalare a cristalelor de tartrat de calciu cu ajutorul hidrocicloanelor si centrifugelor continue. In continuare, cristalele se usuca la maximum 3% umiditate in instalatii clasice de uscare, incalzite cu gaze de ardere sau calorifere.

Fermentarea solutiei de difuzie cu un continut de 6÷8% zaharuri se realizeaza prin procedee continue sau discontinue, la temperatura de circa 28⁰C, insamantarea cu maia de drojdie in proportie de 10% si o durata de circa 48 de ore.

Distilarea solutiei se efectueaza, de regula, cu instalatii continue cu una sau doua coloane de distilare. Tescovina epuizata este dirijata la instalatia de uscare tip toba, folosita la uscarea cerealelor si plantelor furajere, ce cuprind doua pneumocicloane care separa semintele si pielitele. Curatirea finala a semintelor se face cu ajutorul trioarelor. In cazul in care nu se urmareste valorificarea pielitelor, tescovina epuizata si presata este supusa operatiei de afanare si separare a semintelor umede, dupa care urmeaza uscarea acestora.

Semintele, in mod obisnuit, sunt separate ca mai sus, insa calitatea si cantitatea uleiului si a taninului se reduc simtitor. Pentru obtinerea uleiului si taninului de calitate se recomanda urmatoarele:

separarea semintelor sa se efectueze din tescovina dulce, proaspata;

uscarea semintelor sa se faca la o temperatura de maximum 110⁰C;

umiditatea, pe toata durata conservarii, sa fie de 11÷12%;

dezvoltarea bacteriilor acetice si a mucegaiurilor conduce la degradarea substantelor extractibile.

Pentru obtinerea uleiului alimentar, caracterizat ca ulei dietetic datorita continutului ridicat de acizi esentiali, se aplica schemele cunoscute din industria uleiurilor vegetale, cu urmatoarele particularitati: maruntirea semintelor sa asigure particule de circa 1 mm, temperatura de extractie sa fie in jur de 35⁰C; solventul optim este amestecul benzina de extractie-acetona (3:2); decolorarea si purificarea se fac cu carbune activat adaugat chiar la extractie (0,25% fata de macinatura) pentru a evita oxidarea grasimilor.

Uleiul de seminte poate fi folosit in: industria de lacuri si vopsele (ulei semisicativ); parfumerie; industria farmaceutica si la fabricarea sapunurilor.

Turtele rezultate dupa eliminarea solventului sunt supuse extractiei cu alcool etilic de concentratie 40÷60% vol., la temperatura de 70⁰C, minimum 3 ore. Solutia tanica se distila pentru recuperarea alcoolului, se concentreaza la consistenta pastoasa, se usuca si se macina, obtinandu-se enotanin pulbere. Turtele epuizate in grasimi si taninuri sunt supuse prajirii, maruntirii si eliminarii fibrelor, obtinandu-se un furaj bogat in proteine (circa 26%).

Obtinerea enocolorantului din tescovina de struguri negri se bazeaza pe solubilitatea substantelor colorante, in special antociani, in mediu acid, alcoolic si sulfitic. Pentru extractia substantelor colorante se utilizeaza, de regula, solutii sulfitice care contin 0,2% SO₂, avand urmatoarele avantaje: protejeaza antocianii de oxidare, este ieftin, se elimina usor din enocolorant, este un aditiv alimentar acceptat de toate legislatiile tarilor vitivinicole. Dioxidul de sulf, pe de alta parte, reclama instalatii etanse, construite din otel inox, iar extractele de antociani sunt in mare masura impurificate cu substante necolorante.

Ca materie prima pentru obtinerea enocolorantului se foloseste tescovina rosie fermentata, cu un continut de minimum de 1,5 g/kg antociani, si tescovina rosie dulce, obtinuta de la vinificarea in alb a strugurilor negri. Pentru a evita oxidarea si polimerizarea antocianilor, tescovina trebuie prelucrata imediat dupa presare, eventual depozitarea sa nu depaseasca 2 luni, tescovina fiind imersata in solutie de SO₂ 0,2%.

Pentru obtinerea enocolorantului brut se utilizeaza procedeul Carpantieri (Italia) - Sefcal (Franta) care consta in urmatoarele:

separarea sau nu a semintelor;

extractia prin difuziune cu solutie de 0,2% SO₂ la 60⁰C;

desulfitarea sucului sub vid la 40÷45⁰C;

fermentarea sucului dulce si limpezire;

concentrarea sub vid, la 30÷40% s.u., cu recuperarea sau nu a alcoolului;

centrifugarea pentru separarea tartratilor.

Se obtine un enocolorant brut, cu un continut de antociani ce variaza in limite largi (cateva grame÷50 g/kg), functie de continutul de antociani al materiei prime. Enocolorantii se utilizeaza in colorarea produselor alimentare acide, in industria farmaceutica si cosmetica, inlocuind colorantii rosii de sinteza. Un produs asemanator enocolorantului brut se poate obtine din tescovina nefermentata din struguri albi, denumit concentrat de tescovina, ce poate fi utilizat la corijarea culorii galbene si la bonificarea bauturilor racoritoare si a bauturilor alcoolice (Bulancea, M., Ana, Al., 1999).

Ciorchinii separati prin desciorchinare contin: 1-1,5% zahar (umiditatea 8%); sub 0,1% acid

tartric; 1,27 - 3,17% enotanin (in ciorchinii copti) si pana la 5% (in ciorchinii verzi) [10]; substante tanante 6%; substante minerale 2,0%. La unele intreprinderi ciorchinii umezi se preseaza adaugator, obtinand dintr-o tona de ciorchini 1dal must de ciorchini, care se foloseste pentru obtinerea alcoolului. La unele unitati, pentru recuperarea resturilor de zahar, se foloseste spalatorul de ciorchini care functioneaza in flux in cadrul liniei tehnologice de prelucrare a strugurilor. Apa extractiva, dupa fermentare este supusa distilarii, iar ciorchinii sunt valorificati ca furaj sau ingrasamant.

Dupa cum se constata din tabelul . .. compozitia ciorchinelor si a altor parti ale strugurelui

de poama este destul de variata

VALORIFICAREA DROJDIEI DE VIN

Drojdiile separate prin pritocire contin cantitati importante de vin, care se extrage in filtre presa. Cantitatea de drojdie ce se obtine in vinificatie este functie de calitatea strugurilor si modul de obtinere a mustului (presarea). Astfel, in conditii normale, drojdia reprezinta 5÷8% cand se utilizeaza presele discontinue si poate sa ajunga la 12÷15% cand se folosesc presele continue.

Drojdia rezultata este diluata cu apa si pompata in instalatiile de distilare pentru recuperarea alcoolului etilic continut. Prin distilare se separa rachiul de drojdie. Borhotul ramas de la distilare poate fi folosit pentru extragerea tartratului de calciu, prin urmatoarele operatii: dizolvarea compusilor tartrici prin precipitare, separarea solutiei lor din amestecuri insolubile, neutralizarea solutiilor, precipitarea tartratului de calciu, spalarea si uscarea lui.

Drojdiile ramase de la filtrarea borhotului pot fi utilizate ca hrana pentru animale, atat in stare umeda cat si uscate. Pentru prepararea furajelor uscate, borhotul de drojdie este spalat pana la un pH minim 4,5÷5, apoi este presat si uscat in uscatorii cu valturi sau alte tipuri de uscatoare.

	DROJDIE DE VIN

Filtrare

Diluare

Fermentare

Distilare

Filtrare

Filtrat Precipitat de drojdii

Precipitare Uscare

FURAJ PROTEIC

Spalare precipitat

Centrifugare

Uscare

	VIN DE DROJDIE						RACHIU DE DROJDIE

Fig.. Schema de prelucrare complexa a drojdiei de vin

Dupa uscare drojdia are urmatoarea compozitie:

umiditate, max. 12%;

pH, min. 4,0;

proteine, max. 25%;

cenusa, max. 14%.

Pentru obtinerea de biomasa proteica sau de diversi metaboliti primari si secundari folositi in biotehnologii sunt preferate de multe ori drojdiile, deoarece pot fi mai usor separate din mediul de cultura datorita dimensiunii mai mari a celulei (5 μm) si continutului scazut in acizi nucleici (5 - 9%). In acelasi timp pH scazut la care se dezvolta drojdiile reduce pericolul de contaminare.

            Incriminarea componentelor peretelui celular bacterian ca avand propietati antigenice constituie un argument in plus pentru utilizarea drojdiilor in diferite procese biotehnologice, dar si in experimente genetice care vizeaza productia unor hormoni, medicamente si proteine heteroloage alte substante biologic active.

Conceptele descrise mai sus relateaza cateva exemple de obtinere de tulpini de Saccharomyces cerevisiae cu propietati noi sau imbunatatite prin inginerie genetica si metabolica. Ideea de baza in utilizarile tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae este aceea de a satisface din ce in ce mai multe scopuri biotehnologice. Deoarece secventa completa genomica a drojdiei este cunoscuta, schimbarile genetice tinta sunt mai usor de obtinut prin tehnologia ADN recombinant, ceea ce faciliteaza si accelereaza studiile de inginerie metabolica.. Totusi, rigiditatea Saccharomyces cerevisiae privind alterarea functiilor ei metabolice poate limita anumite abordari ale metabolismului ingineresc, acest microorganism are cu siguranta un potential marit pentru caile energetice. Un numar de noi aplicatii bazate pe Saccharomyces cerevisiae vor aparea in viitor, iar acestea, impreuna cu exemplele mentionate, vor ilustra clar potentialul tulpinii Saccharomyces cerevisiae, ca  fabrica celulara in procesele biotehnologice.

Saccharomyces cerevisiae izolata din vin sau din sedimentele de drojdie rezultate in urma fermentatiei vinului, dupa cultivarea pe extract de malt timp de 3 zile, se prezinta sub forma unor celule sferice, elipsoidale, cilindrice, alungite, dispuse izolat sau in perechi si ocazional formeaza lanturi si aglomerari. Celulele de S. cerevisiae se incadreaza in 3 grupe de dimensiuni: in prima grupa sunt incadrate celulele cu dimensiuni 4,5 - 10,5 × 7 - 21 mm, cele din grupa a doua au dimensiuni de 2,5 - 7 × 4,5 - 11 - 18,5 μm, iar ultima grupa, a III - a, cuprinde celulele cu cele mai mici dimensiuni, 3,5 - 8 × 5 (11,5) - 17,5 μm .

Se intalnesc si celule filamentoase care ajung la 30 μm lungime. In mediu lichid formeaza sediment si ocazional un inel incomplet. Prin conjugarea a doi spori de tip de imperechere diferit se formeaza zigotul diploid α/a, care in urma meiozei se poate transforma intr-o asca cu unul pana la patru ascospori. Drojdiile din acest tip fermenteaza glucoza, galactoza, zaharoza, maltoza, 1/3 din rafinoza si dextrinele. De asemenea ele asimileaza alcoolul etilic, glicerina si acidul lactic. Saccharomyces cerevisiae suporta bine aciditatea si alcoolul si se dezvolta optim intre 25 si 30⁰C. Datorita capacitatii lor de a produce alcool (pana la 14%). Drojdiile din acest tip prezinta interes pentru industria fermentativa si in laborator pot fi crescute la 30⁰C, pe mediu complet (extract de drojdie 1%, peptona 2%, glucoza 2% sau K₂HPO₄ 0,2%, MgSO₄ 0,1%, (NH₂)SO₄ 0,1%, autolizat de drojdie 1%) si sunt utilizate in productia de proteine heteroloage.

Producerea de proteine heteroloage

            De-a lungul studiilor efectuate asupra comportamentului Saccharomyces cerevisiae, ca si a importantei capacitatii acestei drojdii de a exprima gene straine in combinatie cu aparatul ei secretor, face din Saccharomyces cerevisiae un organism-gazda atractiv pentru producerea de anumite proteine heterogene.

            Numeroase proteine heterogene care au fost folosite in scopul de a diagnostica sau ca agenti terapeutici umani si vaccinuri au fost produse cu succes de Saccharomyces cerevisiae.

            Interferonul uman a fost prima proteina recombinanta produsa de Saccharomyces cerevisiae in 1981, iar in anul urmator a fost produs primul vaccin obtinut prin intermediul ingineriei genetice .Productia industriala de insulina de catre Saccharomyces cerevisiae, acopera aproape jumatate din nevoia de insulina a 154 de milioane de diabetici din intrega lume .In ultimii ani secretia de insulina a Saccharomyces cerevisiae a fost imbunatatita prin ingineria proteinelor secventei leader, iar de imbunatatirile realizate va beneficia nu numai farmaciile si diabeticii, ci si potentialul de organism-gazda al Saccharomyces cerevisiae pentru producerea, de alte proteine heterogene.

            Saccharomyces cerevisiae are o cale secretorie multipla si este capabila de a produce modificari posttranslationale ale proteinelor heterogene, cum ar fi maturarea proteolitica a prohormonilor si formarea legaturilor bisulfidice.. Aceste trasaturi se aseamana cu cele ale celulelor mamiferelor, iar unele proteine ale mamiferelor active biologic pot fi exprimate prin urmare cu succes si secretate de Saccharomyces cerevisiae. In plus, transformarea Saccharomyces cerevisiae cu ADN strain si binescunocuta tehnologie de fermentare a acestui organism, face din Saccharomyces cerevisiae o gazda buna pentru producerea de proteine heteroloage. Cu toate acestea, Saccharomyces cerevisiae prezinta unele dezavantaje, cand este folosita pentru producerea unor anumite proteine recombinante heterogene. Astfel de probleme au fost observate ca rezultat al instabilitatii plasmidiale ducand la hiperglicozilarea proteinelor heterogene secretate, ceea ce poate cauza efecte de imunogenitate nedorite. Pentru a depasi astfel de modulari nedorite ale proteinelor recombinante de interes, au fost investigate tulpini alternative, pentru a fi folosite ca organisme gazda .

            Celulele haploide de imperechere de tip α ale Saccharomyces cerevisiae, secreta feromonul factor - α, printr-o combinare eficienta a celulelor haploide a si α. Factorul - α al Saccharomyces cerevisiae prepro - leader este cel mai folosit ca sistem de exprimare secretorie pentru proteinele heterogene in numeroase si diferite tulpini, incluzand si Saccharomyces cerevisiae. Fuziunea intre secventa prepro - leader cu o gena heterogena, permite ca Saccharomyces cerevisiae sa secrete proteine heterogene, deoarece secventa leader mediaza translocarea cotranslationala (Figura 10) a fuziunii proteinei in eucariote. Preregiunea secventei leader este separata de o peptidaza semnal, iar in aparatul Golgi endoproteaza Kex2 separa preregiune in partea C-terminala a maturarii dibazice Kex2. Inainte de secretie, peptida spatiatoare a maturarii Kex2 de la extremitatea C-terminala este inlaturata prin actiunea dipeptidil - aminopeptidazei, codificata de gena STE13 si proteina heterogena este eliberata in mediul extracelular .

De-a lungul timpului au fost efectuate studii pentru a imbunatati secretia de insulina prin folosirea factorului α prepro - leader al Saccharomyces cerevisiae; intregul α - factor prepro - leader al Saccharomyces cerevisiae a fost folosit pentru studiile initiale in secretia de insulina cu o peptida spatiatoare avand o secventa Glu - Ala Glu- Ala, care rezulta prin fuziunea proteinelor aratate in Figura 10 .

Figura 10. Ilustrarea unui α factor prepro-leader fuzionat cu un precursor al insulinei.

In acest studiu, peptida spatiatoare a fost indepartata cu greu de dipeptidil -aminopeptidaza, obtinandu-se in principal un precursor al insulinei Glu - Ala Glu - Ala,  deci spatiatorul a fost indepartat prin mutageneza directa asupra locului. Aceasta modificare a factorului α al secventei leader a relevat cu succes exprimarea si secretia a numerosi precursori insulinici. Alte studii au aratat avantajul unui spatiator, deoarece poate fi atinsa o imbunatatire a procesarii Kex2p, ceea ce in cazul insulinei este de preferat deoarece procesarea insuficienta a Kex2, poate cauza o hiperglicozilare si o depreciere a productiei de insulina.

Cand spatiatorii potriviti si creati in asa fel incat sa poata fi indepartati de tripsina sau de Achromobacter lyticusce cu o proteaza specifica Lys1, au fost introdusi intre Kex2 dibazic si precursorul insulinic, productia de precursor al insulinei a fost imbunatatita. Prezenta unui spatiator nu numai ca s-a dovedit a fi un succes pentru secretia secventei leader a factorului α fuzionata cu precursorul insulinei, dar si glicozilaza N lincata a celor doua parti a α-factorului propeptidglicozilat, localizate aproape de precursorul insulinei, joaca un rol de pivot in procesul de secretie, deoarece lipsa acestor doua glicozilaze micsoreaza semnificativ secretia precursorului insulinei .

            O alta exprimare a fost recent demonstrata la Saccharomyces cerevisiae sub designul secventelor prepro - leader obtinute prin combinarea unei abordari rationale si a unei optimizari treptate .Daca liderii sintetici au fost folositi intr-un context spatiator potrivit, productia de precursor de insulina a depasit productia obtinuta cu α - factori prepro leaderi, si mai departe liderii sintetici au facilitat secretia nu numai a insulinei, dar si a altor proteine heterogene. Experimentele pulsatorii au aratat un timp de transmisie prelungit al liderului sintetic al proteinei de fuzionare a precursorului insulinei la Eucariote cu fuziunea proteinelor ce contin α - factor prepro leader, fapt ce ofera o extindere a timpului pentru impachetarea corecta a precursorului insulinei si deci productie marita. Cand prepro - leaderii sintetici lipsesc din glicozilaza N lincata, partile fuzioneaza cu proteina precursoare a insulinei obtinandu-se o productie mai mare a precursorului de insulina impachetat corect in comparatie cu cea obtinuta datorita secventelor leader cu α - factori. Totusi, lipsa de legaturi N glicozilate ale prepro leaderilor, nu a avut un impact asupra capacitatii de secretie, ceea ce contrasteaza cu ceea ce a fost pentru prepro leaderii α - factori, dupa cum s-a mentionat mai sus .

Inlocuirea partii de maturare Kex2, cu o alta parte procesata enzimatic, apartinand prepro - leaderilor cu legaturile N glicozilaza lipsa, a dus la o secretie a precursorului insulinei neprocesat, iar acest precursor neprocesat ar putea fi purificat din mediul de cultura si maturat in vitro prin adaugarea de lysyl proteaza specifica produsa de Achromobacter lyticus Inlocuirea situsului de maturare Kex2 cu un alt situs proteolitic poate fi potrivita pentru secretarea de proteine heterogene, ce au secventa de maturare Kex2 in structura lor, deoarece o anume proteina poate fi scindata de endoproteaza Kex2, ceea ce cauzeaza o descrestere a productiei de proteine heterogene. Deci, prin alegerea unei enzime proteolitice a carei secventa de procesare nu este prezenta in proteina heterogena de interes, aceasta proteina poate fi secretata ca o proteina de fuziune neprelucrata intr-o tulpina mutanta kex2 si treptat maturarea se poate induce in vitro. In continuare, secretia unei proteine heterogene neprelucrate ce are un pro - leader sintetic poate fi comparata avantajos cu secretia unei proteine heterogene prelucrate, deoarece acest pro - leader induce o stabilitate si o solubilitate a proteinei de fuziune, ceea ce este de preferat inainte de inceperea purificarii si maturarii proteinei de fuziune. Noua descoperire a secventei sintetice prepro leader s-a demonstrat a fi o parghie extrem de puternica pentru exprimarea si secretia de insulina, iar aceste secvente leader pot activa exprimarea si secretia proteinelor heterogene, ceea ce nu este posibil cu factorul α - prepro - leader folosit in mod traditional.

            Conceptele descrise mai sus relateaza cateva exemple de obtinere de tulpini de Saccharomyces cerevisiae cu propietati noi sau imbunatatite prin inginerie genetica si metabolica. Ideea de baza in utilizarile tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae este aceea de a satisface din ce in ce mai multe scopuri biotehnologice. Deoarece secventa completa genomica a drojdiei este cunoscuta, schimbarile genetice tinta sunt mai usor de obtinut prin tehnologia ADN recombinant, ceea ce faciliteaza si accelereaza studiile de inginerie metabolica. Totusi, rigiditatea Saccharomyces cerevisiae privind alterarea functiilor ei metabolice poate limita anumite abordari ale metabolismului ingineresc, acest microorganism are cu siguranta un potential marit pentru caile energetice. Un numar de noi aplicatii bazate pe Saccharomyces cerevisiae vor aparea in viitor, iar acestea, impreuna cu exemplele mentionate, vor ilustra clar potentialul tulpinii Saccharomyces cerevisiae, ca  fabrica celulara in procesele biotehnologice.

Aplicatii biomedicale

           Pentru descoperirea de noi agenti terapeutici umani, celulele de drojdie au fost utilizate ca modele experimentale in cercetarile biomedicale referitoare la oncologie, farmacologie, toxicologie, virologie si genetica umana. Pentru studiile fundamentale din aceste domenii au fost utilizate doua tulpini de drojdii: Saccharomyces cerevisiae si Schizosaccharomyces pombe (Tabelul 2)

Tabelul 2. Cercetari biomedicale cu drojdii.

           Studierea proteinelor ABC din drojdie (caseta de legatura - ATP) a creat perspective de a se patrunde in biologia moleculara fundamentala a catorva afectiuni umane, care sunt definite ca functii de transport ale unui ABC deficient si includ fibroza chistica, adrenoleukodistrofia, sindromul Zellweger, hiperinsulinemia infantila, sindromul Dubin - Jonson, sindromul limfocitar Tip1, diabetul insulino - dependent si scleroza multipla. In termenii practici cunoasterea structurii genomului de drojdie si homologia cu genomul uman poate duce la noi descoperiri (medicamente specifice sau terapie genica) in tratamentul acestor afectiuni umane.

Organizatia Mondiala a Sanatatii, recomanda folosirea concentratelor proteinico-vitaminice obtinute cu tulpini de drojdii in conditii strict controlate, ca cea mai eficienta sursa de vitaminizare a alimentelor pentru copii. Aceeasi biomasa uscata este folosita ca adaos in concentrate de supe, budinci sau in compozitiile din care se prepara pastele fainoase. De exemplu, in ultimul caz biomasa adaugata confera pastelor un gust mai bun si o culoare mai placuta decat concentratele din soia.

           O directie noua de utilizare a biomasei obtinuta prin cultivarea drojdiilor este in terapeutica, sub forma de medicament-aliment, destinat prevenirii si tratamentului unor afectiuni cu incidenta crescuta.

           Comparativ cu medicamentele clasice, medicamentul -aliment prezinta o serie de avantaje notabile:

- pot fi utilizate timp indelungat fara a provoca reactii secundare;

- sunt acceptate de bolnavi fara a induce reactii psihologice adverse;

- au un rol deosebit in reglarea metabolismului perturbat in bolile de nutritie (in special in cazul dereglarilor aparute in urma tratamentelor indelungate cu antibiotice).

           Drojdia-medicament se poate administra sub doua forme:

- drojdie viabila, obtinuta prin liofilizare, care isi pastreaza toate principiile active;

- drojdie inactivata, obtinuta prin plasmoliza sau autoliza al carei principal atu il reprezinta valoarea nutritiva, aportul de vitamine si microelemente furnizate organismului uman sub o forma usor asimilabila.

Printre recomandarile terapeutice ale drojdiei medicament se numara:

- prevenirea si tratamentul accidentelor digestive (diaree, candidoze) ce apar in urma tratamentului cu antibiotice;

- tratamentul gastroenteritelor acute;

- tratamentul diareelor ce apar datorita colonului iritabil.

            Biomasa de S. cerevisae obtinuta in urma procesului de liofilizare a fost utilizata ca produs probiotic sub forma de capsule gelatinoase.[Ex. de probiotic de uz uman -Ultralevure-produs in Franta (liofilizat de S. cerevisiae)- ce contine 5x10⁹ celule de drojdie/capsula termenului de valabilitate al produsului (3 ani)].

Expertii FAO(Food and Agriculture Organisation) si OMS(WHO - World Health Organisation) au definit probioticele ca ,,microorganisme vii care administrate in cantitati adecvate sunt benefice pentru gazda"

Probioticele in produse alimentare si farmaceutice au aparut pe piata in cursul ultimilor 20 de ani.

Sunt definite ca niste culturi individuale sau mixte de microorganisme vii sau nepatogene, susceptibile sa influenteze favorabil sanatatea fiintei umane sau animalului care le ingereaza. La om probioticele isi manifesta efectele in cavitatea bucala sau in tubul digestiv (sub forma de alimente sau capsule), in caile respiratorii (ca aerosoli) sau in cele genito -urinare (prin aplicatii locale).

           Pentru utilizarea de catre om, probioticele trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii:

1.      sa fie de origine umana;

2.      sa reziste procedeelor de fabricatie a produselor, aciditatii gastrice, secretiei biliare si pancreatice;

3.      sa se fixeze pe celulele epiteliale ale intestinului pentru a rezista peristaltismului si sa colonizeze, cel putin temporar, intestinul;

4.      sa produca substante antimicrobiene eficace fata de bacteriile cariogene si patogene.

In  plus  ele  trebuie  sa  fi  fost  supuse  unor  teste  clinice recunoscute care au dovedit propietatile lor favorabile pentru sanatate.

           Explicatia exacta a modului de actiune a drojdiei-medicament nu este inca cunoscuta, fiind propuse mai multe modele de actiune:

- efectul de antagonism ``in vivo`` a fost demonstrat de Ducluzean pentru tulpini din genul Saccharomyces contra unor tulpini din genul Candida (albicans, krusei, pseudotropicalis). Procesul a fost descris ca:``primul exemplu al unui antagonism microbian exercitat "in vivo" de microorganisme care nu fac parte integranta din ecosistemul tubului digestiv, dar pe care il tranziteaza in numar ridicat fara a-si pierde viabilitatea .

- modularea efectului de producere a toxinelor bacteriene: la administrarea preventiva de probiotic obtinut cu tulpini de Saccharomyces se observa reducerea mortalitatii soarecilor infectati cu Clostridium difficile, la soarecii supravietuitori constatandu-se diminuarea citotoxinei si scaderea numarului de Cl. Difficile;

- activitatea imunomodulatoare datorata prezentei in peretele celulelor de drojdie a unui glucan denumit ``stimulent cu larg spectru al mecanismelor de aparare``;

           Drojdiile viabile pot interveni favorabil in mentinerea microflorei intestinale normale, atat prin actiunea antagonica cat si prin produsii de metabolism care stimuleaza microflora lactica.

In prezent cercetarile privind probioticele cunosc noi directii de dezvoltare.Astfel , firme renumite din SUA(All-Tech-INC) ,Japonia(Toya Co. LTD), Franta(Santel),Anglia(Probiotics-INU),Germania(Chevita-GmbH) au reusit sa obtina preparate eficiente continand agenti de tip probiotic, destinati industriei alimentare, farmaceutice si pentru zootehnie.

Pe plan mondial,inca din 1980, existau peste 20 de produse probiotice de uz zootehnic si veterinar, avand la baza biomasa microbiana apartinand genurilor Saccharomyces, Lactobacillus,Bacillus,Pedioccocus.

Administrarea acestor probiotice in zootehnie are urmatoarele efecte benefice:

-creste rezistenta animalelor la microorganismele patogene prin reducerea ph-ului si creearea de conditii nefavorabile dezvoltarii acestora;

- imbunatatirea ratei de crestere datorita aportului suplimentar de vitamina si enzime existent in drojdiile din preparat;

-reduce efectele datorate stresului;

-tulpinile de drojdii imbunatatesc fermentatia de la nivelul rumenului;

-mentinerea apatitului, stabilizarea digestiei,optimizarea programelor de nutritie;

Exemple de produse probiotice de uz zootehnic:Gener-Gel Bovine Pro55(Bio-Vet);Rumen Aider Jr.(Bio-Vet);Gener-Gel Equine Microbial Paste(Bio-Vet).

VALORIFICAREA TIRIGHIEI

Tirighia sau piatra de vin este constituita din cristale de tartrat acid de potasiu (circa 80%), cristale de tartrat de calciu (circa 5%) si impuritati (drojdii, bacterii, substante colorante si tanante). Ea se formeaza pe peretele interior al vaselor, fiind mai abundenta pe suprafetele cu asperitati (butoaie si cisterne de beton).

Indepartarea tirighiei trebuie facuta anual sau cel mult la doi ani, deoarece depozitul constituie un focar de infectie cu bacterii si mucegaiuri.

Desprinderea tirighiei se face mecanic (ciocaniri si razuire, cand stratul este mai gros), prin dizolvare cu abur sau apa fierbinte sau pe cale chimica (solutie fierbinte de soda sau acizi minerali).

Tirighia poate fi utilizata ca atare la prepararea acidului tartric, iar solutiile utilizate pentru extractie chimica se neutralizeaza cu clorura de calciu si lapte de var, obtinandu-se tartrat de calciu.

Compusii tartrici in tescovina se gasesc sub forma de saruri tartrice de potasiu sau de calciu.

Continutul sarurilor de calciu al acidului tartric uneori ajunge pana la 10-20% din

compusii tartrici ce se afla in tescovina. Literatura de specialitate a oferit numeroase informatii despre compozitia tescovinei

Compusii tartrici din drojdiile vinicole sunt alcatuiti in general din hidrogenotartratul de potasiu si tartratul de calciu. In drojdiile de vin uscate se regasesc 22-33% compusi tartrici, substante pectice, coloranti, tanini si substante azotice, substante proteice, fosfati de calciu si bariu, sulfati si alte impuritati .

Acidul tartric se utilizeaza pe scara larga in industria alimentara (conserve vegetale, produse zaharoase, panificatie, bauturi racoritoare, vinificatie), farmacie, medicina si in industria chimica.

Prelucrarea deseurilor vinicole in scopul obtinerii acidului tartric(AT)

Producerea industriala a acidului tartric din DV include un sir de tehnologii ce constau dintr-o serie de operatii tehnologice complicate cu consumuri mari de materiale si energie

Procesul tehnologic de obtinere al AT consta din urmatoarele etape principale: trecerea compusilor tartrici (KHC4H4O6, CaC4H4O6) din forma insolubila in cea solubila, precipitarea sub forma de saruri de calciu ale acidului tartric si eliberarea lui prin adaugarea acidului sulfuric, urmat de un sir de etape de purificare, concentrare a solutiei si cristalizare a produsului finit.

Obtinerea tartratului de calciu(TC)din sedimentele de drojdii vinicole

Extragerea TC din borhotul de drojdii rezultat la distilarea alcolului poate fi efectuata prin

trei metode neutra, acidasi bazica.

In tara noastra TC se obtinea prin metoda acidasi bazica. Peste hotare se practica mai mult

metoda neutra, utilizand ca agenti de sedimentare a TC carbonatul si sulfatul de calciu. Specialistii in domeniu considera , ca metoda neutra nu necesita prelucrarea sedimentelor de drojdii cu acizi minerali, deoarece hidrogenotartratul de potasiu se dizolva total in timpul distilarii alcoolului.

Solutia fierbinte (70-750C) ce contine compusi tartrici se purifica, se prelucreaza cu reactivi chimici in rezultatul caruia se obtine TC.

O alta metoda de obtinere a TC utilizata in tara, consta in prelucrarea sedimentelor de drojdii

cu lapte de var si clorura de calciu. De mentionat, ca acesti reactivi chimici sunt mai scumpi .

Metoda acida de obtinere a TC este bazata pe proprietatea tartratilor de a se dizolva in acizi

minerali de concentratie medie cu formarea acidului tartric liber. Resturile de celule de drojdii si

alte impuritati mecanice nu se dizolva. Extragerea AT din solutie consta in sedimentarea lui in

forma de TC la adaugarea laptelui de var si a cretei, care apoi se separa de lichid, se spala cu apa si se usuca.

Sedimentarea tartratului de calciu se efectuiaza prin adaugarea clorurii de calciu. Tartratul

de var, obtinut la prelucrarea cu soda calcinata, are continutul de acid tartric de 50% si este de o calitate buna.

Sedimentul obtinut dupa spalarea si extractia tartratului de calciu se foloseste ca furaj pentru

vite.