Biologia celulelor animale cultivate - Caracteristici de crestere

Modelul culturilor in vitro ca oglinda a realitatii dezvoltarii celulare in vivo este contestat din mai multe motive:

a) modificarea rapida a compozitiei mediului in care traiesc celulele, ce duce la expandarea, migrarea si proliferarea celulelor nespecializate si nu a celor diferentiate functional;

b) proliferarea celulara (inexistenta in vivo);

c) reducerea interactiunilor intercelulare datorita omogenitatii celulelor cultivate, a lipsei arhitecturii tridimensionale tisulare si/sau alterarii substratului nutritiv si hormonal.

Pentru obtinerea unei culturi stabile cu posibilitate de utilizare practica sau experimentala, celulele de diferite proveniente trec prin cateva etape clasice CCA, debutand cu initierea culturii si continuand cu pasarea succesiva pe subculturi, pana in momentul transformarii lor.

Initierea unei culturi celulare

In urma inocularii celulelor recoltate direct din tesutul animal intr-un recipient cu mediu de cultura se obtine o cultura celulara primara (CCP). O astfel de cultura poate fi alcatuita dintr-o varietate de tipuri de celule diferentiate. Cultura primara reprezinta primul pas al unui proces selectiv indelungat care poate da nastere in final unei linii celulare relativ uniforma. CCP este formata din:

a) celule care au capacitatea de a migra din explant

b) celule ce au capacitatea de a supravietui dezagregarii mecanice sau enzimatice

c) celule care fie se organizeaza ca monostrat fie traiesc in suspensie

Daca o astfel de cultura celulara primare este mentinuta mai mult de cateva ore, in cultura va avea loc fie cresterea numarului celulelor cu capacitate proliferativa, fie supravietuirea fara dezvoltare, fie moartea celulelor. Astfel, distributia celulelor pe tipuri se va modifica continuu, pana cand substratul disponibil este ocupat, celulele ajungand in contact direct. In acel moment se ajunge la asa-numitul punct de confluenta, care reprezinta un moment critic deoarece:

a) celulele sensibile la criteriul densitate vor involua;

b) celulele ce tolereaza densitatea vor evolua (celulele transformate viral sau spontan).

Pentru mentinerea in cultura a celulelor sensibile la criteriul densitate se fac pasaje pe subculturi, pastrandu-se astfel fenotipul normal (ex: fibroblastele au capacitate  transformatoare mare, iar celulele transformate se dezvolta rapid inhibandu-le pe cele normale). In punctul de confluenta, cultura de celule poate prezenta particularitati tisulare foarte apropiate celor existente in tesutul "parental".

Evolutia unei linii celulare

Linia celulara este o cultura celulara dupa primul pasaj si poate fi propagata in subculturi ulterioare multiple (fig. 2). La fiecare pasaj, celulele cu capacitatea cea mai ridicata de proliferare vor predomina treptat iar celelalte vor dispare. Evolutia ulterioara depinde si de rezistenta celulelor la traumele provocate de tripsinizare si transfer. Dupa al treilea pasaj, cu toate ca driftul fenotipic al selectiei continua, cultura devine stabila, fiind formata din celule tipizate, proliferative. De ex: in prezenta serului, fibroblastele si elementele figurate ale sangelui se dezvolta exploziv.

Astfel au rezultat linii celulare utile ca:

- fibroblastele din pulmonul embrionar uman WI38 - utilizate pentru izolarea unui spectru larg de virusuri, in special rinovirusuri;

- fibroblastele din rinichiul de transfer BHK21 - utilizate pe scara larga in multiplicarea unor virusuri pentru obtinerea vaccinurilor;

- fibroblaste subcutane de soarece L-M - utilizate in studii genetice si biochimice incluzand hibridarea celulelor somatice si transferul de gene.

O problema aparte a reprezentat-o mentinerea in cultura a diferitelor linii celulare ce prezentau o capacitate proliferativa limitata, ca de exemplu celulele parenchimatoase hepatice sau keratinocitele epidermale. In urma experientelor de tatonare in vederea gasirii solutiei, s-a ajuns la un prim succes. Astfel, utilizand medii si substraturi selective, la ora actuala se pot mentine in cultura multe linii celulare specializate.

Cultivarea celulelor normale

Integrarea cuvantului "normal" in terminologia de specialitate se bazeaza pe caracteristicile acestor celule animale cultivate. Astfel, se poate spune despre ele ca raman predominant euploide (spre exemplu fibroblastele umane), sunt dependente de ancoraj (cele provenite din tesuturi solide) si prezinta inhibitie de contact care este un indiciu al controlului cresterii. De asemenea, multe celule normale au o durata a vietii finita ce variaza in functie de specie, origine, tesut (intre 10-100 generatii). In urma pasajelor in subculturi, celulele normale ajung la asa-numitul momentul de criza. Acesta este momentul in care celulele din cultura fie se transforma in linii celulare continue, fie ajung la senescenta si mor. Spre exemplu linia WI38 are o capacitate de crestere finita si poate fi propagata in subculturi in mod continuu aproximativ 50 de ani (limita lui Hayflick).

Fig. 2. Evolutia unei linii celulare (dupa J. Freshney, 1987)

In timpul culturii, celulele pot suferi unele fenomene de dediferentiere sau deadaptare.

Dediferentierea este proprietatea celulelor diferentiate de a-si pierde aceasta capacitate in cazul culturii in vitro (suboptimale). Cauzele probabile ale aparitiei dediferentierii, sunt:

celulele nediferentiate din aceeasi linie celulara (susa) inhiba dezvoltarea celulelor diferentiate (proliferare);

absenta din culturi a unor inductori cum ar fi: hormonii, interactiuni intercelulare, etc.;

fenomenul proliferarii ce avantajeaza celulele nediferentiate, care in lipsa inductorilor nu se diferentiaza.

Implicatii: dediferentierea este un proces ireversibil de pierdere a proprietatilor specializate. Spre exemplu: hepatocitele isi pierd enzimele specifice (anginaza, aminotransferaza) si nu mai pot stoca glicogen sau sa secrete proteine serice.

Deadaptarea (readaptarea) implica faptul ca sinteza unui produs specific (sau activitatea unei functii specifice) fiind sub controlul reglator al hormonilor, interactiunii intra- si inter-celulare poate fi reindusa prin asigurarea unor conditii optimale.

Transformarea celulara in vitro

In microbiologie termenul transformare implica un proces de modificare fenotipica dependent de preluarea unui material genetic mare. Acest fenomen este frecvent definit si sub denumirea de transfectie. In ingineriei genetice termenul desemneaza incorporarea artificiala (de ex. prin tehnologia ADN-ului recombinat) intr-o populatie celulara a unor gene in vederea transformarii genetice a unui organism si este cunoscut sub denumirea de transgeneza.

In domeniul culturilor de celule animale, multe linii celulare pot fi propagate intr-o forma nealterata pentru un numar limitat de generatii, dupa care ele pot sa dispara sau pot da nastere unei linii celulare continue. Procesul prin care dintr-o linie celulara ia nastere o linie celulara continua spontan sau indus chimic ori viral poarta numele de transformare celulara. Transformarea presupune o modificare fenotipica care nu implica in mod necesar si incorporarea de catre celule a materialului genetic nou.

Linia celulara continua este caracterizata prin faptul ca: este de regula aneoploida; este heteroploida variatia numarului de cromozomi de la o celula la alta a aceleasi culturi; apare de regula tarziu in procesul cultivarii; are o instabilitate genetica ridicata; este nemuritoare. Nu se cunoaste daca exista o predispozitie a celulelor in a evolua spre linii celulare continue in momentul realizarii dezagregarii explantului.

Termenul TRANSFORMARE presupune:

a) modificari morfologice celulare

b) modificari ale cineticii dezvoltarii celulare

c) aparitia unui grad ridicat de tumorigenicitate

d) de multe ori se suprapune cu malignitatea

e) existenta (aparitia) unei anomalii

Desi celulele transformate sunt mai usor de crescut in cultura, a existat o oarecare impotrivire in a accepta utilizarea lor pentru productia pe scara larga a unor substante biologice in special a celor destinate consumului uman. Originea acestor celule a provocat ingrijorare cu privire la posibilitatea contaminarii produsilor cu agenti tumorali. Cu toate acestea, monitorizarea stringenta si controlul pericolelor cunoscute, precum si analiza imbunatatita a produsului final au dus la o diminuare a restrictiilor cu privire la utilizarea acestor celule.

Linii celulare utilizate frecvent

Senescenta si moartea celulara

S-a demonstrat ca dupa un anumit numar de generatii (diviziuni celulare) culturile imbatranesc si mor. Declinul celular este cea de-a patra faza evolutiva a unei culturi celulare dupa cele de "lag", de crestere exponentiala si stationara. Cauzele declinului sunt de natura genetica (programarea genetica a mortii celulare) si de natura externa (factorii dependenti de om si mediu). Pe langa moartea celulara data de senescenta, in ultimul deceniu se vorbeste mult si despre apoptoza, o moarte celulara comandata de catre sistemul biologic prin intermediul interactiunilor inter-celulare. Desi a fost evidentiata initial in vivo, apoptoza a fost demonstrata si in cazul culturilor celulare in vitro.