Micropopagare "in vitro" la freesia

Micropopagare "in vitro" la freesia

Dupa Bajaj si Pierrik (1974) un cultivar nou de fresia poateb fi multiplicat in cca. 8-10 ani intr-un numar de exemplare suficient de mare pentru comercializare, o planta producand, anual, aproximativ 5-6 tuberobulbi.

Bajaj si Pierik (1974), Petru si coleb, (1976) au multiplicat "in vitro" Freezia cv. "Ballerina" porind de la calusul provenit din : meristem, tulpina, bulbi, flori etc. Branta si Vermeuleu (1965) si apoi Branta (1968) au obtinut plante de freesii, devirozate, prin culturi de meristeme. Reproducand metoda descrisa de Pierik si Steegemans (1975), Cachita si Lazar (1983) si Mirghis si Lacatus (1983) realizeaza multiplicarea "in vitro" a fresiei, utilizand boboci.

Pentru studierea capacitatii regenerative a explantelor de freculiisii, functie de natura acestora si de faza de dezvoltare in care se afla plantele in momentul recoltarii, rrespectiv ai inocularii,a fost intreprins un experiment comparativ . Intr-o prima etapa au fost recoltate expante nodale, prelevate de la nodul imediat inferior inflorescentele, fasonate astfel incat sa cuprinda o portiunede cca.2 mm de deasupra si de desubtul nodului; in paralel sau prelevat boboci din apexul inflorescentei, respetiv bobocul terminal si primul boboc subiacent. Intrucat la inoculiiprovenind din bobocul terminal al inflorescentelor, aflate in plina anteza, capacitatea regenerative a fost mai mare intr-un al doilea experiment sau recoltat boboci de la baza inflorescenteu prezentau cca. 4-5 mm lungime dew 3-3,5cm. Bobocii de la baza infllorescentei prezentau cca. 4-5 mm lungime si 2-3 mm latime, corolla nefiind inca evidenta. La inoculare sa tinut seama de pozitia ocupata de boboc pe axul inflorescentei.

Materialul biologic a fost dezinfectat timp de 30 minute in solutie de hipociorit de calciu 5%, cu adaos de Tween 20. Dupa spalari repetate in apa distilata sterile, sa trecut la prelevarea si dimensionarea explanteor.

In comparatie cu indicatiile lui Pierik si Bajaj (1975) in experientele noastre au fost efectuatebmodificari cantitative si calitative in ceea ce priveste au fost effectuate modificari cantitative si calitative in ceea ce priveste reteta mediului de cultura microelementele, vitaminele, FeEDTA sa scazut concentratia de agar si de zaharoza, totodata, nu sa folosit hidroliza de caseina si a fost modificata, radical, balanta hormonala. Reteta de mediu conform recomanarilor lui Pierik si Bajaj, avea pH-ul 6 si contine, ca auxina sarea de potasiu a acidului beta indolilacetic (AIA) si citocina ( 6-(benzilamino)-9(2-tetrahidropiranii)-9H Purina (PBA).

Substratul de cultura, de compozitie originala, la un prim experiment, a constat din: mediu de baza macroelemente (Murashige-Skoog, 1962), microelemente ( Heller), FeEDTA43 mg/l

, vitamine ( piridoxina si acid nicotinic, cate 1 mg/l si tiamina 10 mg/l, mezzo-inozitol 100 mg/l, zaharoza 20g/l Difco Bacto Agar 7 g/l). Nivelul pH-ului a fost de 5,8. La mediul  de baza sau adaugat urmatorii reglatori de crestere: mediu de baza lipsit de hormoni (Vo); acid &naftilacetic (ANA), 1 mg/l, plus benziladenina (BA), 10 mg/l (V1); ANA 1mg/l , plus BA 5 mg/l (V2); ANA 0,1 mg/l , plus BA 5 mg/l (V3); acid B indolilacetic (AIA), 1 mg/l, BA 1 mg/l, plus acid giberelic (GA3) 1 mg/l (V4).

Intr-un al doilea experiment, mediul de baza a fost constitut din macro, microelemente si FeEDTA dupa Murashige-Skoog (1962), vitamine ( tiamina 0,4 mg/l, acid nicotinic si piridoxina cate 0,2 mg/l), glicina 0,8 mg/l, mezo-inozitol 100mg/l, zaharoza 30 g/l si agar 6 g/l. Ca hormoni sa folosit BA 2,5 mg/l, iar pH-ul a fost ajustat la valoarea de 5,6.

In primul experiment au fost respectate conditiile de cultura recomandate in literatura

(timp de 8 saptamani constand din boboci au fost mentinuti la intuneric, la temperatura de 23 C, dupa care au fost trecuti la lumina continua); in cel de al doilea experiment, dupa 8 saptamani de intuneric au urmat 2 saptamani de lumina si (apoi un regim de 16 ore lumina/24 ore.

Din experientele noastre a reiesit ca explantele nodale de freesia au diferentiat, de regula cate un lastaras. Sporadic s-a observat si formarea a cate 1-2 radacini. Regenerarea a 2-3 lastarasi per un inlocul s-a obtinut mai ales in varianta V 2. Capacitatea regenerative a axplantelor cultivate cu A/A plus BA si GA3 (V4) a fost scazuta, sub nivelul registrat la inoculi crescuti pe mediu de baza (V₀),lipsit de reglatori de crestere.

Bobocii terminali,situati in apexul inflorescentelor si cei sub apicali , au dovedit o diferentiata capabile regenerative si de organogeneza, dependenta de pozitia ocupata de boboc in substratul de culcura. Pe mediul de baza , lipsit de hormonii (V₀), bobocul a crescut mult dar nu a diferentiat. In cazul in care substratul de cultura a continut BA,dupa trecerea eprubetelor la lumina,procesul de diferentiere si de orgageneza s-a desfasurat cu multa rapiditate. Atat timp cat boboci au fost tinuti la intuneric florile au crescut, ovarul s-a marit si pe suprafata lui s-au format escrescentele etiolate. Dupa trecerea inoculilor la lumina continua,escrescentele formate pe ovar s-au inverzit,s-au alungit si ,treptat,au luat crestele formatiunii cu aspect pergamentos. Ulterior, din interiorur acestora au aparut frunzele. In partea bazala a inculilor s-au diferentiat radacinite. Bobocii apicali au prezentat o capacitate regenerative net superioare celei remarcata la inocilii constand din boboci subapicali ( funcita de gradul de avansare a procesului de anteza) .

In cazul in care s-au prelevat boboci din intreaga generatie au prezentato bobocii din treimea superioara a inflorescentei . De regula, la inflorescentele care nu au avut boboci in faza avansata de anteza, pozitia 3 si 4 de sub apexul inflorescentei au prezenta cea mai ridicata capacitata organogena.

Bobocii prea tineri sau cei avansati in faza prea avansata de anteza,au o scazuta capacitate de diferentiere, generand lent,eventual 1-2 tulpinite. Mediul de cultura este cel descries anterior cu 2.5 mg/l BA . Inoculii constand din boboci (respective butonii florari) trebuie pastrati o perioada la intuneric, (cca. 8 saptamani) dupa care vor fi trecuti la lumina continua ,sau in regim de 16 ore lumina/24 ore.

Procedeu de multiplicare "in vitro" la Saintpaulla Ionatha

In 1837, Naylor si Jonson au obtinut plante din saintpaulla prin cultivarea pe hartie de filtru umectata,asezata in capsule Petrii,a unor fragmente de frunza Kukulc-Zanka si Suszynska (1972) au regenerat plante de saintpaullia pornind de la explante ilsulare si foliare,crescute "in vitro" : observatiile morfoanatomice au reliafat faptul ca neoformatiunile culinare au provenit din celule epidermale. Rao (1977) si Rao si Morel (1974 ) au publicat studii detaliate cu privire la procesele de morfogeneza,observate la nivelul explantelor saintpaullia,prelevante din lamina frunzei sau din petiol . Vasquez si colab. (1977) abordeaza din mai multe unghiuri de vedere aspectele legate de propagarea "in vitro" la saintpaullia,pornind de la discuri cu diametru de 1 cm, prelevate din frunze,sau pornind de la flori(sepale, ovare,petale ) . Autorii, subliniaza faptul ca neoformarea de mugurasi s-au semnalat numai la explantele prelevate de la plante aflate in plina anteza ; inoculii prelevati din organe detasate de la plante tinere sau constand din frunze tinere ori prea batrane,nu diferentiaza mugurasii. Organogeneza a putut fi remarcata abia dupa 35 de zile de la inlocuire. Un mediu adecvat,sub raportul balantei hormohale,trebuie sa cuprinda ANA 1ml/l si BA 1ml/l. Dacob si colab, (1980) utilizand un explant foliar de 1 cm² prelevat de la plante aflate in plina anteza, crescut pe mediul de balanta hormonala sus amintita, obtinut cca, 105 mugurasi. Prin transplantarea mugurasilor neoformati pe medii lipsite de reglatori de crestere s-a reusit "in vitro" find , inradaginarea acestora si generarea de plante, complet conformate. Plantele neoformate "in vitro" infloresc la cca 6 luni din momentul operarii inoculilor initiale. Prin munca unei singure personae in decursul unui an, se pot obtine in jur de 8000 de plante.

In conditiile laboratorului in cultura de tesuturi de la Centrul de Cercetare Biologic din Cluj-Napoca s-a obtinut plante de saintpaulla, atat din inoculii constand din fragmente de limbfoliar sau din petiol -diferentiandu-se colonii de plante care umpleau intreaga cavitate a recipientelor de cultura, cat si din bobocii inoculati "in vitro" , cand aveau dimensiunea cca, 3 mm diametru . Diferentierea de mugurasi la nivelul explantelor constand in petiol sau facut lent, fiind mai putin recomandat ca inoculi pentru multiplicarea saintpaulliei

Propagarea " in vitro" a saintpaulla am realizat-o cu bune rezulate, prin detasarea de propaguli (fragmente de colosali) ori confectionand minibutasi din limbi de petioli, recoltate din masa de frunzite, prezente in colonie. Limbul foliel,comparativ cu petiolul ( fragmente de cate 1 cm), a diferentiat mai repede noi colonii de propagulii

In concluzie, consideram ca cea mai efecienta metoda de multiplicare la Santpaulla Ionantha consta in prelevarea si cultivarea "in vitro" a unor fragmente de cca 1 cm, recoltate din lamina frunzei ori de boboci; din colonia de plantute generate din aceasta (prin detasarea de propaguli) regenerarea unei noi colonii se face folosind propagulii,sau prin fragmentarea acestora in minibutasi. Inradacinarea plantelor de saintpaulla se realizeaza ,cu usurinta, in conditiile transferarii propagurilor pe mediul de cultura anorganic, consolidat cu perii sau nisip. Stropirea saptamanala a substratului de cultura cu 1ml/l ANA, accelereaza procesul rizogen .

Micropropagarea "in vitro" a orhideelor

Metoda de imultire "in vitro" a orhideelor a fost stabilita de catre Morel, care prelevand maristema culinare de la plante virozate, s-a reusit sa obtina orhidee libere de viroze. Din maristemul inoculat pe medii aseptice la nastere o formatiune numinta prolocorm, sub forma unui tubercul de cativa mm,de culuoare verde( uneori de forma biliforma) asemanator ca organizarea cu protocormul de orhidee, generat din samanta. Asa cum a precizat Morel protocolmul poseda o deosebita de ridicata capacitate regenerative. Prin multiplicarea celulelor protocormul se produce diferentierea de noi protocoli la inceput mici, care cresc pana la atingerea dimensiunii protocormului normal; protocormii noi formati ,raman atasati,o perioada de timp de protocormul mama; treptat se ajunge la formarea unui glomerul (constituind din mai multi protocormi) cu diametrul de cca 1mm. Prin desprinderea si separarea fiecarui protocorm care alcatuieste glomerului, se poate realiza o extraordinara de rapid multiplicarea si propagarea vegetative, clonta, a orhideelor. In plus, pe aceasta calea, se pot multiplica exemplare divirozate. Dupa care a aratat Morel au protocorm poate fi si sectionat in 4 fragmente ; fiecare din fragmentele respective, cultivate "in vitro" vor genera cate un nou protocorm si ulterior un glomerun . Capacitatea prevazuta cormului de orhidee, de a se imultii printr-o perpetua repicare "in vitro" a protocormilor neoformati, a fost mult exploatata practice. In momentul de fata , in tari cu o horicultura avansata ( Olanda, Belgia,Franta etc. ) multiplicarea "in vitro" a orhideelor se face pe cale industriala. Pentru sustinerea proceselor de multiplicare a protocormului, protocormul neoformat din maristemul cultivat pe mediul solid, trebuie transferat pe un mediu lichid de compozitie foarte simpla : macro si micro elemente Knudson , FeEDTA ( MS) si 20 g/l zaharoasa ; deci, in acest caz mediul de cultura este lipsit de agar si de reglatori de crestere. In decurs de 1 luna si jumatate , glomerulul se imulteste si se poate trece la subcultivarea acestuia. Pentru introducerea procesului de organogeneza este recomandabil sa se dezmembreze glomerului in protocol mii componenti si acestea sa fie subcultivati pe medii solide, cu agar, de compozitie similara cu mediul mentionat anterior . Procesele de organogeneza la orhidee se desfasoara in conditii optime si pe medii lipsite de hormoni , cu conditia ca protocormul sa fie scos din starea submersa, in atmosfera respective sa fie cultivat pe substrat agarizat.

In literature de specializate sunt mentionati o serie de fapte care favorizeaza sau inhiba procesele de organogeneza la orhidee. In general , la orhidee mugurasii apar mai repede decat radacinile. Dupa Freson, Vanseren-Van Espen si dupa Homes si Vanseren -Van Espen concentratia glucidului in mediul de cultura poate directiona morfogeneza la nivelul protocormilor.

Astfel , pentru multiplicarea protocormilor este recomandabila prezenta in mediu a zaharozei, in concentratie de 20 g/l .

Dupa Freson, prezenta in mediu a glucozei ca sursa de carbon organic conduce la stagnare proceselor de multiplicare vegetative a protocormilor si induce declansarea fenomenelor de caulogeneza. Homes si Vanseveren-Vanespen (1973) sunt de parere ca zaharoza in concentratii suboptimale- peste 16 g/l favorizeaza organogeneza.

Procesele de organogeneza par sa fie influnetate si de grosimea stratului de lichid de deasupra glomerulelor protocormiale, atunci cand acestea sunt cultivate submers , pe medii statice. Daca stratul de mediu, de deasupra glomerulelor este mai subtire se constata propenderent, procese de organogeneza. Daca stratul de mediu este mai gros,protocormii fiind submersati in profunzimea lichidului, sunt favorizate procesele de multiplicare vegetative a protocormilor. Din experientele noastre a reiesit ca protocormul de Cymbldium poate fi stimulat sa genereze tulpinite,iar mai apoi radacinitele. In conditiile in care glomerului sau protocormul , crescut cca. 1 luna de mediu agarizat, este submersat, acoperindul cu un start de lichid ( apa distilata sterila sau solutie nutritiva) , astefel incat lichidul sa depaseasca cca 1mm partea superioara a protocormului. Din acest experiment a reiesit ca la Cymbldium este stimulata organogeneza atunci cand se altereaza trecerea protocormului din starea de submersie a fost subcultivati repetat, replicand fragmente de colonie- constanda dintr-o zona bazala cu calus pe care erau inserate 2-3 frunzulite pe un mediu de cultura similar celui din cultura primata.

Multiplicaera "in vitro" a gerberei se realizeasa usor prin acest procedeu, cu conditia ca mediul sa existe o concentratie scazuta de auxina (ANA 1-0,1ml/l ) si o concentratie ridicata de citochimica,respective 2ml/1 BA.

Cultivarea "in vitro" a propagulilor de gerbere pe medii lipsite dereglatorii de crestere,coduce la o slaba capacitate organogena.

Daca se urmareste realizare,in scurt timp, a cat mai multe neoplanturi, subcultivarea propagurilor se recomanda a fi facuta pe medii lipsite de citochimine, dar cu 1ml/l ANA, pentru a stimula procesele de rizogeneza.

Plantele generate "in vitro" in general, se acomodeaza fara pierderi la conditiile mediului septic, iar in cca 6 luni de la transferarea platelor in mediul natural, acestea infloresc.

O alta cale pentru multiplicarea "in vitro" a gerberei este acea elaborata de Pierych si colab. (1973-1975) in care se foloseste calatidiul fragmentat. In acest scop se aleg inflorescentele care prezinta, in anteza completa, numai doua - trei circumferinte din inflorescente,respective cele situate in exteriorul calatidiului; florile batrane si cele foarte tinere sau imbobocite, diferentiaza slab. Sezonul potrivit pentru recoltarea inflorescentelor este din martie pana in octombrie, desi se remarca un declin regenerative in lunile iunie si iulie. Pierych si colab recomanda utilizarea inflorescentelor de culoare rosie, Noi,(Cachita si Colab 1983), au constatat ca florile trebuie sa fie proaspete.

Inflorescentele sunt fasonate prin indepartatea florilor de pe calatidium si scurtarea brateelor involucrului. Pedunoului se scurteaza la cca 1.5 cm pentru o desifectare eficienta,calatibiile fasonate se introduc intr-un bac din material plastic perforat care se scufunda in alcool etilic 70% , timp de 30 de secunde apoi acestea se transfera in hiplocorit de sodium (1.5%) , timp de 95 de minute (interval in care are loc de cateva ori golirea si umplerea vasului de dezinfectie) , in final materialul vegetal se spala de cateva ori, cu apa distilata ,sterile (timp de 45 de minute) . In procesul de dezinfecatare , se produce un fenomen de inchidere a calatidiilor. Se actioneaza apoi calatidiile in conditii aseptice . Planul de sectionare este perpendicular pe suprafata receptacului, sectiunea trecand prin petiol. Explantele rezultate, sferturi de calatidiu sunt introduce in mediul de cultura, astfel amplasate , incat inoculul sa fie cufundat in mediul de cultura, astfel amplasate,incat inoculul sa fie cufundat in mediul de cultura cu suprafetele sectionate,iar partea externa convexa , a inflorescentei sa fie situata in aer. Mediul de cultura, este cel utilizat de Pieryc si Colab (1973) cu adaos Ga₃ in concentratie de 0,1MG/l sau 0,1 MG/l, pH-ul mediului fiind de 5,7. S-au folosit epubrete de 20 cm/2,5 cm obdurate cu dopuri de vata si folii de aluminium.In primele 30 zile epubretele cu inoculi au fost tinute la intuneric, in dulapuri termostate la temperatura de 27 ^oC , apoi au fost trecuta la lumina continua de 3,300 1x,timp de 30 de zile. Temperatura camerei climatice a fost de 25-27^oC iar noaptea de 22-23^oC. Lotul de inoculi pe mediu lipsit de giberelina au aparut dupa 30 de zile cate 2-3 neoplantule (75%) la doua luni neoplantulele au fost pasate pe mediu rizogen (Pieryc si Colab 1973) . Prezenta giberelinei in mediul de cultura a inhibat procesul de neoformare a plantutelor.

Procedeu de multiplicare "in vitro" din muguri caulinari

Pregatirea materialului. Se aleg plantele donatoare,se fasoneaza rizomii de la plantele adulte, dupa pargurgerea fazei de anteza. Se indeparteaza total dupa rizoni, frunzele cu petioli si florile si precum o parte din radacini, apoi rizomii sunt plantati in ghivece cu perlit, in sera.. Dupa cca 3 saptamani, se declanseaza,cresterea mugurilori caulinari. Se recolteaza in vederea prelevarii ,lastari juvenili

Dezinfectia lastarilor. Se face timp de 25 min cu o solutie de hipoclorit de calciu 5% cu adaos de Tween 20,0,1(1ml) dupa care se procedeaza la spalarea repetata

Inocularea: se preleveaza apexuri de 1mm, care sunt inoculate in epubrete de 12 cm/ 1,6 cm

Mediu de cultura. Cu adaos de chiotina 10ml/l si auxina 0,5 mg/l (anA) si ph de 5.7.

Conditiile de cultura. 16 ore lumina de 2500 1x temperatura 24^oC

Dupa o saptamana apexurile incep sa prolifeze, iar la 4 saptamani se formeaza colonii de plantute. La 6 saptamani plantutele aveau 6cm inaltime,cu frunzulite lungi si petiolate.

Sub cultivarea se face de cateva ori, pe aceleasi medii cu o concentratie de auxina de 0,1 mg/l (ANA) si 2mg/l : cresterea dozei de AIA la 10 mg/l nu amplifica procesul de rizogeneza.

Din propagulele inradacinate s-a reusit sa se obtina plantutele complet conformate, care au suportat cu success transferarile din vitro in mediu septic de viata. In continuare plantutele au vegetat in conditii naturale, asigurand multiplicarea clonala.

Microinmultirea "in vitro" la zambile

Inmultirea zambilelor este dificila, deoarece majoritatea solurilor valoroase produc un numar redus de bulbi. Cu toate ca se aplica unele metode de sporire a numarului de bulbi prin taieri la nivelul disculuibazal sau prin extirparea mugurelui floral, nu se reuseste sa se faca fata cerintelor de bulbi pe plan intern si la export, cat si in productia de plante fortate.

Multiplicarea "in vitro" a zambilelor ofera posibilitatea producerii rapide pe cale clonala a unui material valoros, in cantitati mari. In acelasi timp, acesta tehnica asigura si obtinerea unui material liber de boli si de calitate superioara.

Hussey (1975) , Sanlewski (1975), Kim si colab, (1981), au studiat natura, marimea si orientarea pe mediu a explantelor. Pierik si Ruibing (1973) au adus precizari asupra epocii de prelevare si inlocuire, iar Pierick si colab, (1973, 1975), au adus , contributii referitoare la mediile de cultura, conditiile la cultura si de lumina precum si referitor la actiunea reglatorilor de crestere asupra morfogenezei "in vitro"la zambile.

Tehnica culturii "in vitro"

Descrierea tehnicii de cultura folosita cu bune rezultate de catre Osvath si Cachita ( 1983).

S-a lucrat cu cv, Carnegie, cu bulbi de cca, 4 cm recoltati in luna iunie si mentinuti la temperatura camerei pana in septembrie.

Inaintea de prelevarea explantelor, bulbii se spala in apa de robinet, timp de o ora;

Bulbii sunt apoi submersati in alcool etilic 70^OC, timp de 20 secunde;

Se actioneaza bulbii in lungime, radial, in 4 sferturi desprinzandu-se solzii de pe discul bazal. Solzii cei mai mici sunt indepartati, cei mijlocii mentinuti ca atare, iar solzii mari- aflati la periferia bulbului- sunt sectionati in jumate, in 2 bucati de cca, 1 cm latime. Discul bazal este si el sectionat in 8 parti si apoi fragmentat in 16 explante, prin taiere in plan langetial al fragmentelor ramase dupa detasarea solzilor

Fragmentele de solzi si de dic se lasa sa se svanteze 30 minute , dupa care se trece la operatiunea de sterilizare, scufundandu-se cateva secunde intr-o baie de hipoclorit de cca, 10 % ( cu 5% clor activ ) cu adios de Tween 20,20 minute , apoi sunt supuse unor spalari repetate cu apa distilata sterile.

Inocularea solzilor sau a frgmetelor de solzi si disc se face cu parte apicala in jos, pana la 1/3 din lungimea lor;

Se recomanda un mediu de cultura constituit din: macroelemente Knop ( in dilutie 1/2 ) , microelemente Heller, Na, Fe EDTA 25 ppm, glucoza 2 %, agar-agar 6 %, acid indolilacetic 10 ppm, iar pH-ul = 5,8. Ca vase de cultura se folosec epubrete de 22 x 17 mm, cu 10 ml mediu, sterilizarea lor s-a facut in autoclav la 12 ^O C, timp de 30 minute.

Incubarea culturilor a fost facuta la 25^o ± 2^o la lumina tuburilor fluorescente, la 2400 lx, cu o fotoperioada de 12 ore lumina/ 23 ore.

Aplicand tehnica de dezinfectie a materialului supus prelevarii, s-a redus procentul de infectare a inoculilor la numai 2%.

Dupa inocularea solzii isi ingroase marginile si formeaza local un strat de calus, subtire, de culoare violacee; suprafetele solzilor se inverzesc foarte usor.

Dupa 4 saptamani de la inoculare, pe suprafata interna cat si pe cea externa a majoritatii solzilor apar 1-6 mici proturberante albe, pe potiunea de solz aflata in afara mediului de cultura cat si pe portiunea cufundata in mediu.

Dupa 8 saptamani, din primordiu cresc bulbii de culoare alba, de cca, 3-6 mm inaltime, din portiunea centrala se inalta o tulpina verde, cu crestere rapida; in portiunea bazala a solzului se formeaza una sau mai multe radacinite lungi.

Inoculii proveniti din placa bazala fomeaza lozete cu frunzulite mici, verzi.

Rata regenerarii per bulb este de 50-60 soli/bulb cu cate 4-5 bulbi/inoculi poate fi aproximata la 200-300 viitoaare plante.

Desigur, nu totii bulbii generati "in vitro" supravietuiesc, cu ocazia transplantarii lor in conditii naturale, totusi, marea majoritate suporta foarte bine transferul in sol afanat atunci cand tulpinita are cca 2-3 cm si cand sunt prezente radacinile.

Calusul la Liliac este initiat si intretinut in prezenta unor mari concentratii de auxine. In cele mai multe cazuri se include si o citochinina, 1-10 uM chinetina.

Reducerea de auxine si cresterea concentratiei in citochinine induce regenerarea lastarilor din culturi de calus la Liliac.

Regenerarea lastarilor este favorizata de cultivarea la intuneric. Instabilitatea cromozomiana nu se constata daca regenerarea de plantute are loc direct din explante

Sheridan (1975), a mentinut un calus haploid de Lolium longiflorum peste 6 ani, fara nici o scimbare in numarul de cromozomi sau in capacitatea de regenerare.

Microinmultirea "in vitro" la Ciclamen

Cultura Ciclamenului ocupa un loc propenderent intre diferitele Pirimulaceas cultivate in sere. Ciclamen persicum este specia cea mai cultivata gratie polimorfismului culorilor si gigasiei florilor, iind supusa unor intese programe de ameliorare.

Dificultatile pe care le intampina acesta cultura sunt marcate de marile suprafete de sere pe care le ocupa plantele mame pentru producerea de seminte.

Avantajele multiplicarii clonale vegetative la acesta specie sunt:

►producerea unui mare numar de plante, plecand de la o cantitate redusa de material;

►conversarea caracterelor unui individ valoros ( care s-ar putea pierde prin reproducerea sexuala);

►obtinerea de plante riguros sanatoase.

In 1975, Morel a obtinut embrioni somatici, dar din pacate, el nu a putut reproduce descoperirea sa.

Geler (1977-1979) a pus in evidenta, plecand de la tuberculi, existenta unui potential organogenetic la Ciclamen. Folosirea tuberculiilor prezinta, totusi, inconvenientul sacrificarii plantei furnizoare.

Fersing (1982) a verificat potentialul regenerativ al tesuturilor juvenile ale tuberculilor, hipocotilelor sau cotiedoanelor, provenite din samanta de Ciclamen, germinata in conditii aseptice. Ele au produs calus din care s-au diferentiat "tufe" de frunze. In majoritatea cazurilor, plantele obtinute formeaza spontan un tubercul. Cresterea acestor plante neoformate este, in general buna chiar superioara plantelor din seminte.

Utilizarea tesuturilor juvenile prezinta, insa, inconvenientul ca nu se cunosc caracteristicile holticule ale individului care a furnizat explantele. Acestea se pot rezolav, utilizandu-se plantule obtinute din saminte de la hibrizi F_1.

La Ciclamen tesuturile adulte se preteaza la cultura " in vitro"; in special organelle aeriene. Tubercul: manifesta o slaba capacitate organogeneza. In plus, sterilizarea sa este foarte dificila, necesitant folosirea antibioticilor. La toate acestea se mai adauga faptul ca foloirea tuberculului antreneaza pierderea plantei donatoare.

Antera : dupa Geϊer (1978) din antere se poate obtine calus, din care apar produsi particulari, ce seamana cu petalele, pigmentate sau nu precum si antere rudimentare. Acesti produsi numiti petaloizi sau anteroizi, constituie un material pentru studii de morfogeneza florara, dar nu prezinta Interes pentru poductie.

Petiolul si pedunculul florar: petiolul are cea mai slaba capacitate organogenita, iar pedunculu florar da nastere la formati organogene curioase, de origine epiderma sau subepidermica, care evolueaza foarte greu in frunze.

Frunzele : limbul foliar la Ciclamen, reprezinta un material excelant, caci, pe de o parte, prelevarea de explante nu afecteaza viata plantei iar, pe de alta parte, are potential organegenitic foarte ridicat.

Calusul care se formeaza din explant genereaza numeroase frunze, isolate sau in tufe.

Separate unele de altele, aceste productii organogene sunt capabile sa se inradacineze si sa formeze un tubercul dupa transferarea unui sol.

Totusi, acest mod de inmultire nu poate fi aplicat de metoda industriala de multiplicare vegetative, caci necesita multe manipulari cu toate acestea metoda poate fi luata in consideratie, cand dorim sa clonam rapid plante foarte valoroase.

Trebuie remarcat ca Ciclamenul are tulpina tuberizata,pe care sunt inserate frunzele, originea lor fiind meristematica.

Meristemele sunt incluse in calus. Se considera deci ca meristemele fac parte din tuberculi aparuti si cufundati in masa tesuturilor si deci " in vitro" nu este greu de ai individualiza.

Tentativele facute in acest sens de Fersing si colab, in 1982, a fost incununate cu success. Ei au descoperit ca strucura histological a tuberculilor necomformati era identica cu aceea tuberculilor obtinuti prin germinarea semintelor. Dupa inradacinare, acesti tuberculi au putut fii transferati in sol. S-au obtinut pana la 100 de tuberculi mici si albi intr-o epubreta, dupa examinarea se aseamana cu tuberculi embrionari si sunt numiti " tuberoizi".

Mediul de culura pentru Cicalamen ( Morel si Geϊer, 1977)

► macroelemente, microelemente, vitamina M.S.

►AIA,ANA, 2,4 D, BAP= 0,1-5mg/l

Mipropropagarea "in vitro"la trandafiri

Multiplicarea unei varietati de trandafiri este total dependenta de numar de altoi (muguri apti pentru altoire) pe care il putem preleva de la fiecare planta mama,intre 20 si 50 muguri altoi pe an. Actualmente in franta utilizand tehnici " in vitro" se obtin 200.000-400.000 plante plecand de la un singur mugure; plantele generate "in vitro" pot fi generate si pot, deasemenea, furniza un numar mare de muguri altoi care pot srvi in inmultirea clasica. Cercetari privind microinmultirea "in vitro" la trandafiri au fost initiate de hill in 1967.

Iacobs si colab, (obtin rezulate satisfacatoare folosin pentru culturi "in vitro", muguri axilari.

Davies si Wilkowska (1981) a scos in evidenta sensibilitatea soiurile de trandafiri la cultura "in vitro" si reactia diferita in raport cu concentratia citochininei si auxinei folosite.

Bader si Cachita (1981,1985) au cultivat "in vitro" explante aplicale de trndafiri si muguri axilari.

Coman (1983) a inteprins cercatari pentru testarea capacitati regenerative a 21 soiuri cultivate in conditi de camp pe diferite medi de cultura. Experientele au scos in evidenta urmatoarele elemente pentru tehnica de cultura "in vitro" la trandafiri.

Sursa de explante: plante viguroase,sanatoase autentice.

epoca de prelevare a explantelor: Pentru trandafiri de camp toamna in lunile lui septembrie sau in timpul verii dupa eliminarea lastarelor cu flori.

Variabilitatea cresteri "in vitro" a trandafirului in raport cu data prelevari si originea explantelor- la soiul Roz urcator, dupa Coman, (1983).

Natura explantelor: Muguri subcutanati ( muguri axilari, in formare) dau cel mai ridicat procent de regenerare; muguri apicali, in majoritatea cazurilor ( in functie si de epoca), sant florigeni. Atunci cand se excuta taierea varfului lastarilor, la foarte multe soiuri, acestia se transforma foarte repede in muguriflorigeni.

Specificitatea soiurilor: Soiurile de trandafiri au potential regenerativ diferit. Astfel, soiurile urcatoare: Roz urcator, Pentru Pace, Leipzig, prezinta cel mai mare procent de plantule organizate, cu o comportare buna in subculturi.

Exista, de altfel, si o mare variabilitate in ceea ce priveste forma meristemelor, marimea primordiilor foliare si numarul lor, de asemenea si varsta mugurilor subcutanati este diferita.

Aceasta variabilitate provine si din variatia foarte mare a caracterelor genetice, timpul si ritmul de crestere, perioada de inflorire, colortul petalelor, forma florilor etc.

Aceasta variabilitate genetica induce si o comportare diferentiala a solurilor in conditiile cultivarii meristemelor " in vitro".

In general, solurile cu cresteri slabe si aspect decil, prezinta o capacitate de regenerare si o crestere mai slabii.

Procentul de crestere " in vitro" a explantelor de trandafir ( dupa Coman, 1983).

Mediul de cultura

Se constata ca pornirea explantelor, la majoritatea soiurilor se face pe medii lipsite de auxine, sau cand acestea sant in cantitate mica ( 0,004-0,1 mg/l ANA ).

Medii nutritive folosite la cultura " in vitro" a trandafirului (dupa Coman, 1983)

La cantitati mai mari de auxine, se remarca formarea de calus la baza explantelor si se produce o innegrire a primelor frunzulite care apar dupa initierea cresteri mugurasului.

Benzilamino-burina este un factor limitat in pornirea explantelor. Concentratiile maxime, recomandate sint de 1,0-2,0 mg/l. Concentratia mai mare, produc deformari foliare si o incetinire a cresteri plantelor.

In faza de inradacinare, cele mai bune rezultate sau obtinut pe mediile la care concentratia sarurilor minerale a fost redusa la jumatate si cand sa folosit ca stimulator al rizogenezei, acidul naftilacetic, in concentratie de 0,05-0,1 mg/l.

Aproape in toate cazurile radacinile au fost neramificate subtiri si cu putini perisori absorbanti, trecere in conditi naturale facandu-se greu, cu 40% pierderi.

Coman (1983) propune inradacinarea plantelor obtinute "in vitro", in amestec cu turba sau mranita cu perlit, dupa o prealabila inmultire in Radistim. Pentru a reusi supravietuirea plantelor sunt necesare masuri foarte atente de aclimatizare, mentinand umiditatea relativa la 90-100 %. Folosind acesta metoda, s-a obtinut un procent de reusita corespunzatoare la 85-92%.Dupa ce platele sau inradacinat si-au inceput sa cresca au fost trase la ghivece si trecute in conditi obisnute.

Martin au pus la punct o tehnica industriala pentru inmultire "in vitro" a trandafirului care consta in urmatoarele etape.

1.Prelevarea unui mugure sau meristem (cand este necesara eliminarea virusurilor) de pe lastari tineri, in plina crestere, recoltati din sera in luna ianuarie.

2.Cultivarea explantelor timp de o luna pe mediu de baza (pana la sfarsitul luni februarie).

3.Plantulele generate din inoculi vor fi fragmentate in 4-5 microbutasi fiecare; acestea sunt repicati pe mediu proaspat cu citochinine, care provoaca aparitia a numerosi muguri noi.

Fiecare microbutasi furnizeaza din nou 4 descendenti, in interval de o luna. Acesti microbutasi pot fi pusi din nou pusi in culturi de mediu proaspat ori, parte din ei (excedentul) se pastreaza la frigider ( +4 +5 ° C ).

Dupa aproximativ 10 luni, sint produsi circa 200.000 microbutasi

4.Pe masura produceri lor, microbutasi sunt transferati pe mediu de cultura cu auxine, pentru rizogeneza.

5.Dupa cca. 30 zile, cand planta s-a inradacinat este scoasa din eprubeta si repicata in pietris si amestec nutritiv si pusa in sera.

6.Dupa inca 6 saptamani pana la 2 luni de crestere in sera, trandafiri care masoara 20 cm inaltime sunt plantati in camp. Ei infloresc 6 luni de la scoaterea din eprubeta si pot fi comercializati.

Acesta metoda permite sa se lucreze in tot timpul anului, microplantele fiind conservate in camere rece, asteptand conditi favorabile pana la plantare.