Metode moderne de determinare a calitatii cremelor dermato cosmetice

1. Metoda spectrometrica cu cromatografie de gaz pentru determinarea agentilor de albire din cremele dermatocosmetice

Pentru identificarea agentilor de albire din cremele cosmetice s-a utilizat metoda spectrometrica de masa cuplata cu cromatografie de gaze . Ca si agenti de albire au fost identificati acidul Kojic , acidul azelaic si arbutina care sunt agenti de albire permisi . Agentii de albire restrictionati sunt :resorcinolul si hidrochinona

Metoda permite ca cei doi compusi restrictionati sa fie detectati prin intermediul spectrelor de masa. Avand in vedere volatilitatea redusa a acestora , analitii tinta sunt derivati ai N,O-bis-trifluoroacetamida (BSTFA) cu un continut de 1% trimetilclorosilan inainte de injectarea in sistemul cromatografic .Acuratetea si precizia metodei de determinare a fost evaluata prin compararea rezultatelor cu probele etalon care contin cantitati cunoscute din cei 5 compusi tinta

Metoda poate fi aplicata de producatori in controlul calitatii produselor proprii si de asemenea de catre autoritatile de control pentru a preveni operatiunile frauduloase , fiind protejata astfel siguranta consumatorilor .

Pentru efectuarea analizelor s-a utilizat un cromatograf de gaze , echipat cu sistem de autoprelevare a probei, cuplat la un sistem de detectie .S-a folosit si o baie de apa cu ultrasunete pentru a rezolva eventualele probleme cauzate de solubilitate .

Cromatograful de gaze este echipat cu un ansamblu Al 3000 de autoprelevare a probei , cuplat la un sistem de detectie tip DSQ II produs de Therma Fischer Scientific(Austin, Texas, USA ) .Coloana utilizata este de tip TR-5MS (.95% dimetil-5% fenilpolisiloxan, 30 m, 0.25 mm cu 0.25µm grosimea filmului).Debitul de injectie al probei a fost de 1 ml min^-1 .Palierul de temperatura a fost stabilit la 280 ⁰ C .Spectrometrul de masa functioneaza cu ionizare de electroni cu o energie de ionizare de 70 eV.Sursa de temperatura a spectrometrului a fost setata la 255 ⁰ C.

Reactivi :

Sol .Resorcinol (95%)-RS;

Sol arbutina > 95%-ARB;

Sol .Acid Kojic (99,2%)- KA;

Sol .Hidrochinona>99%- HQ;

Sol .Acid azelaic >99%-AZA;

Sol .Pentaclorobenzen (99,8%) -folosita ca standard intern (IS);

Sol.N,N -dimetilformamida (DMF) -folosita ca solvent la prepararea solutiilor standard si a probelor ;

Sol . N, O -trifloracetamida cu 1% sol trimetilclorsilan (BSTFA) folosit ca reactiv de derivatie pentru analiza cromatografica ;

Cremele supuse analizei contin diferite cantitati de agenti de albire , respectiv:0.6%,1.01%,1.07%,17% si 31% pentru RS, HQ,KA,AZA si ARB.

Solutia stoc contine 50 µg ml^-1 solutie pentaclorobenzen preparata in solutie DMF.Solutiile standard contin 5 µg ml^-1 solutie RS si HQ , 15 µg ml^-1 de solutie KA si AZA ,si 10 µg ml^-1 de solutie ARB preparate in solutie DMF.Probele de 40, 80, 120, 160 si 200 µl au fost transferate in 5 flacoane de injectie in care solutia de DMF a fost adaugata pana la semn .Ulterior, pentru solutiile standard s-au adaugat cantitati care variaza de la 1 la 5 µg ml^-1 pentru RS si HQ, de la 3 la 15 µg ml^-1 pentru KA si AZA si de la 2 la 100 µg ml^-1 pentru ARB .La final se adauga 50 µl solutie de pentaclorobenzen si 100 µl solutie. Probele sunt injectate in sistemul GS-MS.

In concluzie aceasta metoda a fost aplicata cu succes pentru determinarea celor 3 agenti de albire permisi de legislatie dar si a celor doi compusi restrictionati, avand o limitade detectie buna.Metoda este exactasi precisa, acest lucru reiesind si din rezultatele obtinute .

Metoda poate fi aplicata cu usurinta atat de catre producatori pentru a efectua controlul de calitate al produselor , dar si de catre autoritati cu scopul de a evita operatiunile frauduloase .[8]

In tabelul nr.9 sunt prezentate rezultatele obtinute in urma studiului efectuat.

Tabelul nr. 9. Rezulatatele de laborator obtinute in urma analizei GC-MS

Determinarea fenolilor din cremele cosmetice si/sau din emulsii similare

Pentru determinarea fenolilor din cremele cosmetice s-a utilizat o noua metoda ce are la baza extractibilitatea compusilor fenolici din astfel de emulsii.

Metoda consta dintr-o extractie de tip solid-lichid cu ultrasunete, urmata de determinarea cromatografica a fenolilor din exctractele rezultate .

Drept agenti de extractie au fost utilizate solutii de hexan, metanol si apa.Acesi agenti permit dezemulsionarea cremelor si ulterior extractia fenolilor .Pentru extractie s-au folosit amestecuri hexan/metanol/apa in rapoarte de de 60:20:20, 40:40:20 si 30:50:20 .A fost utilizata analiza fractionata pentru a se putea stabili influenta in procesul de extractie a 4 variabile :

Infiltrarea de ultrasunete ;

Temperatura ;

Volumul extractului ;

Ciclul si amplitudinea ultrasunetelor;

Prin aceasta metoda , compusii fenolici pot fi extrasi si din cremele pe baza de Si in numai 10 minute , la o temperatura de extractie de 50 ⁰ C.

Pentru proba de analizat s-a preparat o crema pe baza de Si de 200 g , prin procedul utilizat si la nivel industrial, iar in proba au fost incorporati produsi fenolici dupa cum urmeaza :

Acid galic -50.3 mg ;

Catechina-50.2 mg ;

Acid cafeic -50.6 mg ;

Epicatechina- 50.4 mg ;

Acid ferulic- 50.9 mg ;

Acid Galic Acid Cafeic Acid Ferulic

Catechina Epicatechina

Fig .4.Structura chimica a compusilor fenolici din cremele cosmetice

Extractiile probelor au fost efectuate pe un sistem tip UP 200S Dr. Hielscher , Germany la o intensitate ridicata de ultrasunete , respectiv 200 W si 24 KHz, sistemul fiind echipat cu 2 cavitati de 2 si 7 mm .Amplitudinea vibratiilor de ultrasunete poate varia de la 20% la 100% din puterea nominala a sistemului .Extractiile au fost realizate la temperatura constanta , asigurata de un regulator de temperatura cuplat la o baie cu ultrasunete .Toate determinarile s-au efectuat in dublu exemplar .La extractie s-a folosit 0.1 g crema in 25-50 ml solvent de extractie , pentru 10 minute .

Analizele extractelor au fost efectuate pe un ansamblu HPLC cu sistem de apa , avand ca detector o foto-dioda folosind o coloana de tip RP-18 (LiChrospher 100, 5µm , Merk, Germany) si drept gradient de aciditate apa si metanolul .Debitul de injectie in sistem a fost de 0.3 ml/min .S-a monitorizat si absorbanta de la 200 la 400 nm.Spectrul UV a fost inregistrat pentru fiecare zona si pentru fiecare pic fenolic .Volumul esantionului injectat a fost de 10 µl .Identificarea fiecarui compus fenolic a fost facuta prin compararea timpilor de retentie cu standardele precum si cu spectrele UV-VIS .

Avand in vedere scopul acestei metode , si anume ,extragerea compusilor fenolici din cremele cosmetice, prin aceasta metoda au fost detectati 5 compusi fenolici diferiti, cu polaritati diferite si din familii diferite asa cum se poate observa si in fig 4.[3]

Rezultatele relative ale extragerii copusilor fenolici din mixturi sunt prezentate in tabelul nr .10.

Tabelul nr.10.Continutul de compusi fenolici extrasi din cremele cosmetice supuse analizei

3. Determinarea Vitaminei C din produsele cosmetice prin metoda HPLC folosind glutionul si metabisulfitul de Na drept antioxidanti

Vitamina C cunoscuta si sub denumirea de acid ascorbic este des folosita la prepararea produseolr cosmetice si farmaceutice drept protectie impotriva agentilor oxidanti .Activitatea ridicata a Vitaminei C este legata si de capacitatea organismului de a reduce potentialul oxidativ.

Acidul ascorbic are o stabilitate rezonabila la diferite conditii de depozitare, protejand substantele active fata de umiditate , caldura si luminozitate .

Acidul ascorbic neutralizeaza speciile de oxigen active, incluzand anionul peroxid, oxigenul monoatomic si radicalul hidroxid. Aceste specii de oxigen sunt stimulate de radiatiile UV si, de asemnea, survin normal in timpul metabolismului.

Chiar si cel mai bun ecran solar nu protejeaza total impotriva radiatiilor UV. Antioxidantii sunt si, probabil, vor continua sa fie, adjuvanti esentiali in produsele de protejarea a pielii. Studii recente au demonstrat ca ecranele solare care nu contin antioxidanti esueaza in a oferi protectie adecvata impotriva radiatiilor UV. Vitamina C in forma stabila este cea mai buna protectie impotriva radicalilor liberi si, de asemenea, este esentiala in constructia ecranelor solare. Vitamina C topica, pura si stabila, isi exercita efectul prin neutralizarea radicalilor liberi produsi prin interactiunea radiatiilor solare cu membranele celulare sau alte componente ale pielii (chiar si in cazurile cind sunt folosite ecrane solare cu filtru de protectie maxim).

Fig .5.Structura chimica a acidului ascorbic

Determinarea Vitaminei C din produsele cosmetice prin metoda HPLC , este o metoda de analiza precisa. Aparatul HPLC foloseste o coloana tip C18 250 mm x 4,6mm . Drept faza mobila se foloseste o solutie de 0.2% acid metafosforic/metanol/acetonitril (90:8:2 ) si detectie la 254 nm . Acizii ascorbic si nicotinic sunt folositi ca standarde , ambii avand o puritate de 99%.Linearitatea a fost stabilita pentru concentratiile acidului ascorbic . Timpul de retentie pentru acidul ascorbic a fost de 3,5 min la un debit de injectie de 12 µg ml^-1 .

Ansamblul HLPC Shimadzu tip LC-10AD este integrat cu un sistem de detectie UV Class-LC 10 .Pentru stocarea datelor se foloseste un soft SPD-10A Shimadzu.

Avand in vedere simplitatea metodei si specificitatea mare a acidului ascorbic, chiar si in prezenta unor excipienti cum ar fi acidul oxalic care poate conduce la degradarea sa, metoda este eficienta pentru determinarea acidului ascorbic in emulsii de tip U/A si emulsii apoase sau in alte produse similare cum sunt dermato-cosmeticele .[4]

4. Determinarea unor agenti de parfumare din produsele cosmetice prin indepartarea particulelor folosind SEC (size exclusion chromatography), urmata de cromatografie de gaze cuplata cu spectrometrie de masa (GC-MS)

Determinarea alergenilor din produsele cosmetice folosind SEC urmata de cromatografie de gaze cuplata cu spectrometrie de masa , se efectueaza avand drept scop cuantificarea a 24 de agenti de parfumare care sunt restrictionati in produsele cosmetice .Acesti agenti restrictionati sunt :alcool aminocinamic,aldehida aminocinamica, p-anisil alcool ,alcool benzilic , benzoat de benzil, cinamat de benzil, salicilat de benzil, 2-(4-tert-Butilbenzil)propionaldehida,alcool cinamic,aldehida cinamica, Citral, Citronelol,Coumarina,Eugenol,Farnesol, Geraniol,aldehida hexilcinamica, hidroxicitronelal ,Lyral, Iso-eugenol ,Limonel, Linalool, 2- metil - octionat , α-isometilinona.

In UE si Elvetia exista restrictii legale cu privire la utilizarea in produsele cosmetice a 26 de agenti de parfumare care pot provoca reactii cutanate .Limitele admise sunt de 0.1% (100mg/kg) pentru sapunuri si de 0.001% (10 mg / kg ) pentru produsele cosmetice .Prin urmare, o analiza de rutina este necesara pentru a avea asigurari ca reglementarile sunt respectate .

Separarea particuleor s-a efectuat cu sistemul SEC tip Waters 600 MS , USA. Beneficiul metodei SEC consta in flexibilitatea comparatiei cu alte metode si permite determinarea unei game largi de compusi din matrice dificile.

Identificarea compusilor tinta s-a realizat prin GC-MS(PolarisQ , Thermo Finnigan, USA) cu o coloana DB-35 de 60 m. Analizele s-au efectuat pe mai multe tipuri de creme cosmetice de pe piata din Basel , Elvetia.

In acest scop, s-a cantarit 1 g de proba proaspata intr-un balon cotat de 10 ml, s-au adaugat 5 ml de acetona care contine 10 mg /l colorant, s- a adus la semn. Separarea s-a realizat prin metoda SEC, si ulterior s-au colectat aproximativ 5 ml de fractie care au fost supusi analizei GC-MS .Solutia stoc pentru cei 24 de analiti a fost preparata in acetona (10 mg/l pentru fiecare compus ). Din aceasta solutie "mama" au fost preparate solutiile de calibrare intermediare in solutie de acetat de propil 0.63-10.00mg/l.Solutiile au fost diluate ajungandu-se la o concentratie de 0.06.-1.00 mg/l pentru fiecare compus .

Beneficiul acestei metode este dat de cuantificarea rapida a celor 24 de agenti de parfumare interzisi , din matrici extrem de complexe.[1]

5. Metoda HPLC pentru determinarea simultana a 26 de agenti de parfumare din produsele cosmetice

Legislatia Europeana privind produsele cosmetice prevede declararea a 26 de compusi (24 substante chimice volatile si 2 extracte naturale), pe eticheta produselor finale atunci cand depasesc nivelele prevazute in lege .

Produse care contin agenti de parfumare fac parte din viata noastra de de zi cu zi. Majoritatea produselor de ingrijire corporala de pe piata, contin arome.In produsele cosmetice sunt utilizati frecvent acesti agenti de parfumare pentru a oferi consumatorului un sentiment de bunastare si pentru a masca mirosul de ingrediente chimice.

Aproximativ 3000 de substante chimice si uleiuri esentiale sunt utilizate in mod obisnuit pentru acest domeniu de aplicare .

Aparitia tot mai frecventa a dermatitei alergice o prezinta folosirea acestor compusi in produsele cosmetice .De aceea Comitetul Stiintific al Produselor Cosmetice si al produselor nealimentare a identificat 26 de agenti de parfumare periculosi .

Conform Directivei 15/2003/EC concentratia agentilor de parfumare din produsele cosmetice a fos limitata la un maxim de 0.001%.

Cei 26 de agenti parfumati sunt: hidroxi-citronellal ,anisil alcool ,benzil alcool,cinnamil alcool, coumarina, cinnamal ,lyral,eugenol, iso-eugenol,geraniol,linalol,citronelol ,citral ,methilheptin-carbonate, amil,cinnamil alcool ,benzil benzoate ,benzil salicilate, benzil cinnamat ,lilial, farnesol, alpha-isomethl inona, amil cinnamal , hexil cinnamaldehide, limonene ,p-anisaldehida.

Reactivi

Acetonitril-gradient pentru analiza HPLC ;

Apa deionizata

Filtre ;

Analiza HPLC

Analizele cromatografice au fost efectuate pe un sistem HPLC Hewlett-Packard HP1100,dotat cu o pompa cuaternara cu degazare continua si injector manual tip Rheodyne 7125, cu volum de injectie de 20µl.Sistemul este cuplat la un ansamblu UV-vis cu DAD(diode array detector).

Separarile cromatografice s-au facut pe o coloana de tip Li-Cr (250mmX4.6mm).

Eluarea gradientului a fost efectuata cu o faza mobila de acetonitril (MeCN) si apa (H₂O). Cele mai bune teste cromatografice s-au efectuat la temperatura camerei in urmatoarele conditii:

Fig.6.Cromatograma pentru un amestec standard de 24 de agenti de parfumare si standardul intern la 210nm

Concluzii

Facand o comparatie intre cele 2 metode descrise mai sus , respectiv intre determinarea unor agenti de parfumare din produsele cosmetice prin indepartarea particulelor folosind SEC (Size Exclusion Chromatography), urmata de cromatografie de gaze cuplata cu spectrometrie de masa (GC-MS) si metoda HPLC , GC-MS poate fi considerata o tehnica cromatografica de analiza eficienta pentru substantele chimice volatile, cum ar fi lotiunile de corp sau amestecuri de parfumare. Procedura HPLC este capabila , sa analizeze matrici complexe cum sunt cremele cosmetice.[5]

6. Stabilitatea diferitelor produse cosmetice ce contin esteri ai vitaminelor E si A

Stabilitatea produselor cosmetice se bazeaza pe determinarea cantitativa componentilor activi la temperaturi diferite de depozitare .

Determinarea stabilitatii chimice si fizice a produselor cosmetice s-a efectuat prin metoda cromatografica HPLC. De asemnea au fost efectuate si masuratori reologice , folosind drept model un sistem care contine palmitat de retinil si acetat de tocoferil .

Probele au fost preparate prin adaugare de apa deionizata la urmatoarele componente pentru urmatoarele produse in urmatoarele concentratii:5.0% Sol Spiegel 305,4.0% solutie NET FS , 0% solutie glicerina , 0.8% solutie Phenova .

Preparatele care contin vitaminele A si E au fost depozitate in vase din PVC (37 mm in diametru x 29 mm adancime ) la 45 ⁰C,37 ⁰C si 25 ⁰C , cu o umiditate de 75% , timp de 120 de zile .Cuantificarea cantitatii de vitamine din probe s-a realizat printr-o metoda HPLC .Sistemul HPLC utilizat este format dintr-un cromatograf model LC-10AD (Shimadzu,Japonia ), dotat cu un detector UV (SPD-10A) conectat la un PC .Separarile cromatografice s-au facut pe o coloana de tip Li-Cr (125,4 mm).Metanolul degazat a fost folosit ca faza mobila, la un debit de 1.5 ml min ^-1 .Volumul de injectie a fost de 20µl, iar analizele s-au efectuat la 2 lungimi de unda :326 nm pentru vitamina A si 254 nm pentru vitamina E .Vitamina K₁ a fost analizata la 254 nm .

Rezultatele si calcularea termenului de valabilitate s-au facut prin ecuatia lui Arrhenius, ce caracterizeaza stabilitatea chimica a produsului .

O cromatograma HPLC reprezentativa pentru extractul de vitamine din probe este reprezentata in Fig 6. unde sunt prezentate pic-urile pentru vitamina A si E cu timpi de retentie de 4.6 si 10.5 minute .[7]

Fig.7. Cromatograma HPLC a Vitaminelor A, E si K din crema cosmetica.

7. Evaluarea procesului de degradare emulsiilor cosmetice prin metoda: FTIR

Prezenta metoda are drept scop utilizarea spectroscopiei FTIR pentru analizarea stabilitatii produselor cosmetice de tip U/A avand ca variabile tipul de ulei dar si adauagarea de NaCl .Cele 5 emulsii studiate, au fost depozitate pentru o perioada de 12 luni, la temperaturi diferite: 0⁰C, 25⁰C, 40⁰C si 50⁰C .

Emulsiile au fost analizate prin metoda FTIR si prin metode clasice ( conductivitate , vascozitate , pH, analiza texturii) avand drept scop estimarea stabilitatii chimice. In timpul procesului de degradare, modificarile proprietatilor chimice (structurale) sunt masurate prin metoda FTIR (folosind indici spectrometrici ).Aceste modificari au indus : o scadere a indicelui de nesaturare si o crestere a indicelui de carbonil .

S-au preparat 5 emulsii tip U/A cu compozitii diferite(C₁, C₂, E₁, E₂, E₃) .Pentru a testa stabilitatea acestor emulsii si pentru a accelera procesul de degradare , au fost stocate 4 loturi din fiecare emulsie la temeperaturile mentionate mai sus .S-au efectuat analize la 24 de ore dupa preparare, apoi lunar.Astfel poate fi apreciat procesul de degradare si ulterior rezultatele comparate .

Tabelul.nr .11 Compozitia emulsiilor supuse procesului de degradare

Analizele s-au efectuat pe un sistem FTIR compus din spectrometru Protege 460 cuplat cu un microscop IR (Nicolet Nic-Plan) echipat cu un suport motorizat .Rezultatele au fost stocate cu ajutorul unui soft .S-au efectuat in medie 64 de scanari iar spectrul a fost calculat la o rezolutie spectrala de la 4000 la 650 cm^-1.Conductivitatea pentru fiecare emulsie a fost masurata folosind un conductometru la 25⁰C .

Emulsiile C₁ si C₂ au fost stabile pe parcursul celor 12 luni de depozitare la toate temperaturile studiate .In ceea ce priveste emulsiile E₁, E₂ si E₃ s-a observat o destabilizare in timpul procesului de degradare numai la esantioanele depozitate la 40⁰ C si 50⁰ C .Emulsia E₁ s-a destabilizat dupa 10 luni la temperatura de 50 ⁰ C, E₂ s-a destabilizat dupa 4 luni la 50⁰ C si dupa 8 luni la 40⁰ C.

Fig.8.Spectrul FTIR al tipului de emulsie intre 4000 si 650 cm^-1

Avand in vedere aceste rezultate, metoda FTIR este singura analiza care poate caracteriza functiile chimice ale unei emulsii precum si evolutiile lor in cursul unui proces de degradare termica.

Degradarea termica , permite formarea de acizi grasi liberi .Hidroliza emulsiei induce probabil eliberare de acizi grasi liberi .Cel mai important aspect al metodei este ca permite intelegerea mecanismelor chimice care au loc in timpul oxidarii .Cu toate acestea , nu se permite o predictie a procesului de degradare , doarece in aceasta metoda la temperaturi de 40 ⁰C sunt masurate doar cateva proprietati fata de alte tehnici de analiza .Conductimetria pare a fi cea mai sensibila tehnica pentru a evalua modificarile fizice din timpul procesului de degradare si deci poate preciza stabilitatea emulsiei .[2]

8. Analiza simultana a antioxidantilor si conservantilor din produsele cosmetice prin extractie , combinata cu cromatografia de lichide cuplata cu spectrometrie de masa (LC-MS)

Multi antioxidanti sintetici, cum ar fi butilhidroxianisol (BHA) , hidroxitoluen butilat (BHT),tocoferolul si α-tocoferolul sunt folositi in produsele de ingrijire a pielii. Parabeni , precum metilparaben (MP), etilparaben (PE), propilparaben (PP), butilparaben (BP),sunt aditivi importanti care sunt folositi in produsele cosmetice pentru a inhiba dezvoltarea microorganismelor .Acesti parabeni sunt folositi in aproape toate tipurile de produse cosmetice .

(BHA) Tocoferol(vitamina E)

(BHT) α-tocoferol acetat

Metilparaben  Etilparaben

Butilparaben  Propilparaben

Fig.9. Structura moleculara a antioxidantilor sintetici si a principalilor conservanti

S-a determinat procedura optima pentru separarea simultana si determinarea a antioxidantilor si conservantilor din produsele cosmetice, prin utilizarea SFE (supercritical fluid extraction) combinata cu LC-MS (cromatografie de lichide cuplata cu spectrometrie de masa ). Extractia cu lichid supercritic (SFE) este o tehnica care fuzioneaza valorile de izolare a substantelor dizolvate din probe solide. Studii recente au aratat ca folosirea fluidelor supercritice ca masa de extractie ofera o alternativa puternica la metodele traditionale de extractie si a fost utilizata pentru izolarea Vitaminei E si vitaminei A din cremele cosmetice dar si pentru parabeni[10] .

SFE ofera multe avantaje in comparatie cu procedeele de extractie care folosesc solventi conventonali. Acestea folosesc cantitati mai mici de solventi organici periculosi, se reduce forta de munca in laborator,esantionul de analizat are un debit mai mare, confera un mediu delicat pentru analiti (fara oxigen si temperatura relativ scazuta).

Dioxidul de carbon (CO₂), este lichidul supercritic cel mai frecvent utilizat in SFE, este non-inflamabil, non-toxic si este disponibil la costuri rezonabile.

Reactivi

Toti antioxidantii (butilhidroxianizol, hidroxitoluen butilat, -tocoferol,si acetatul de tocoferol) precum si conservanti (metilparaben etilparaben, propylparaben si butylparaben) au fost achizitionati de la Sigma (St. Louis, MO,USA).

Solutiile stoc ale analitilor(1000mg/l fiecare) au fost preparate in metanol .Inainte de utilizare, toate solutiile au fost filtrate prin filtre de nylon de 0.22µm.

Extractia cu lichid supercritic

Pentru a izola patru conservanti si patru antioxidanti din produsele cosmetice inainte de analiza cantitativa, s-a folosit extractia cu CO₂ drept lichid supercritic la 14.000 kPa si 65 ⁰C. Metanolul a fost folosit ca solvent de colectare iar ca material de umplutura a fost utilizat nisipul de mare.

SFE a fost efectuata prin utilizarea unui sistem de extractie tip SFX-220 (ISCO, Lincoln, NE, SUA), care consta dintr-un extractor, un controlor, o seringa si o pompa tip DX si dioxid de carbon (CO₂) sifonat adus la presiunea de lucru .

S-au luat din proba de analizat 3 g care a fost adusa la un volum corespunzator prin adaugarea de solutie standard , omogenizata si congelatala -4⁰C. Ulterior 0.05 g din esantionul astfel preparat a fost adus in celula de extractie din otel inoxidabil .

Conditiile optime de extractie au fost obtinute prin varierea secventiala a unui parametru experimental in timp ce toti ceilalti parametri au ramas ficsi.

Dupa extractie, esantionul a fost evaporat pana la sec sub un curent de azot.

Analiza HPLC

Analiza HPLC a fost efectuata pe un ansamblu tip Prostar 210 LC cu pompa (Varian, CA, USA).Separarea cromatografica a avut loc pe o coloana tip C 18 (5µm) 4.6mmX250 mm , dotata cu un filtru liber de 0.2µm.Solventul A a fost metanol 100% iar solventul B a fost apa 100%.Faza mobila a fost preparata zilnic , folosind o linie de degazare si a fost introdusa la un debit de 0.9 sau 1.25 ml/min la temperatura camerei .

Concluzii

Metoda a fost utilizata cu succes pentru a determina continutul de conservanti si antioxidanti, inclusiv: metilparaben (MP), etilparaben (PE), propilparaben (PP), butilparaben (BP), butilhidroxianisol (BHA), -tocoferol (-T) si - acetat de tocoferol (-TA) din produsele cosmetice.[6]