Impactele lui 17β-estradiol, incluzand concentratii relevante din punct de vedere a mediului, asupra reproductiei dupa expunere in timpul stadiilor de viata embrio-larvara, juvenila si adulta la pestele zebra (danio rerio)

IMPACTELE LUI 17β-ESTRADIOL, INCLUZAND CONCENTRATII RELEVANTE DIN PUNCT DE VEDERE A MEDIULUI, ASUPRA REPRODUCTIEI DUPA EXPUNERE IN TIMPUL STADIILOR DE VIATA EMBRIO-LARVARA, JUVENILA SI ADULTA LA PESTELE ZEBRA (Danio rerio)

Rezumat

Pestii zebra (Danio rerio) au fost expusi timp de trei saptamani la concentratii joase de estradiol incluzand concentratii relevante pentru mediu (5, 25 si 100 ng / l), cuprinzand fie stadiul lor de viata embrio-larvar (de la fertilizare pana in ziua 21 dupa fertilizare (dpf), juvenil (de tineret) (de la 21 pana la 42 dpf) sau adult (> 200 dpf) cu scopul de a investiga cel mai sensibil stadiu de viata a pestelui zebra la 17 β- estradiol (E2). La toate punctele de executare a mostrelor, au fost analizate concentratiile vitelogenine a intregului corp si dezvoltarea gonadala cu scopul de a investiga efectele expunerii estrogene asupra acestor puncte finale la pestele zebra. La stadiul de adult, au fost masurate punctele finale aditionale incluzand caracteristicile sexuale secundare (manifestarea papilei uro-genitale (UGP) la mascul), cresterea gonadelor (indicele gonado-somatic (GSI) si raportul sexual. Pentru toate expunerile in diferite stadii de viata, a fost apreciata performanta reproductiva a generatiei F0 (productia de oua) si supravietuirea si dezvoltarea F1 embrio-larvara. Expunerea la concentratii scazute de E2 a avut ca rezultat inductia vitelogenina indiferent de stadiul de viata expus, dar aceste efecte au fost reversibile dupa depurare. Concentratia efectiva pentru inducerea vitelogenina la stadiile timpurii de viata la pestele zebra a fost de 100 ng E2 / l, iar la masculul adult de peste zebra concentratia efectiva pentru inducerea vitelogenina (intre 5 si 25 ng / l) a fost mai scazuta decat pentru stadiile de viata mai timpurii ale pestelui. Expunerea la E2 inainte (de la fertilizare la 21 dpf) si in timpul diferentierii sexuale (de la 21 la 42 dpf) a cauzat de asemenea disruperi in procesul diferentierii sexuale (rezultand in formarea unei cavitati retrogonadale la prezumtivul mascul, dezvoltarea celulei germinale si conducand la o modificare semnificativa a raportului sexual inspre sexul femel la doza de 100 ng E2 /l pentru expunerea pestelui ca embrio-larva) si au alterat tiparele productiei de oua la adultii ulteriori. Expunerea pestelui adult la E2 a rezultat intr-o modificare a caracterelor sexuale secundare la masculi la 25 si 100 ng E2 / l cat si o inhibitie doza-dependenta a productiei de oua. Rezultatele din acest studiu arata ca natura si intensitatea efectelor reproductive ale E2 sunt dependente de timpul si concentratia expunerilor pestelui zebra la E2, unele din aceste efecte fiind permanente (efectul asupra diferentierii sexuale), in timp ce altele sunt reversibile (efectul asupra inductiei Vtg). Acest studiu a demonstrat ca stadiile timpurii de viata ale pestelui zebra sunt sensibile la concentratiile scazute de E2 si furnizeaza date relevante care pot fi folosite pentru adaptarea testului existent pentru stadiul timpuriu de viata a pestelui, pentru testarea in vivo a compusilor estrogenici. Datele prezentate ridica preocupari suplimentare despre efectele estrogenilor steroizi din mediu asupra sanatatii reproductive la peste.

Cuvinte cheie: 17β-Estradiol, Vitelogenin, dezvoltare gonadala, reproductie

1. Introducere

A fost stabilit cu claritate ca un numar de compusi chimici si substante naturale prezente in mediul acvatic sunt capabile sa disturbe fiziologia si endocrinologia normala a organismelor (Arukwe si Goksoyr, 1998; Sumpter, 1998). S-a aratat ca, printre ei, multe chimicale sintetice (denumite xenoestrogeni) interactioneaza ca agonisti cu receptorul estrogen (ER) si provoaca raspunsuri biologice similare celor ale hormonilor steroizi naturali (Tyler si col., 1998) Unii compusi disruptivi endocrini precum alkilfenolul polietoxilat, estrogenii steroizi naturali 17β-estradiolul (E2), estrona (E1) si, intr-o masura mai mica, estrogenul sintetic, etinilestradiol (EE2) au fost masurati in efluentii lucrarilor de tratare a canalizarii industriale si municipale (STW) si aceste descarcari reprezinta principala sursa a estrogenilor sintetici si naturali in mediul acvatic. De asemenea s-a realizat in ce masura scurgerile de suprafata reprezinta o alta posibila sursa a contaminarii estrogenice (Lai si col., 2002).

Estrogenii steroizi naturali 17 β-estradiol si estrona si, intr-o masura mai scazuta, estrogenul sintetic, etinilestradiol, au fost de asemenea masurati in efluentii de tratare a canalizarii (Desbrow si col., 1998). Originea estrogenilor steroizi naturali este predominanta de la oameni unde productia zilnica emanand din randul femeilor este de la zeci de micrograme pana la 30 mg la femeia insarcinata (Aldercruetz si col., 1994). O alta sursa de steroizi estrogeni este din folosirea estrogenilor conjugati din tratamentul cancerului, osteoporozei, menopauza si hipogonadism, cu o cantitate estimata folosita in USA de 1690 kg per an (Arcand-Hoy si col., 1998). Surse mai difuze de estrogeni steroizi vin din agricultura (Shore si col., 1993). Majoritatea acestor estrogeni steroizi sunt excretati in forme conjugate, totusi ei sunt rapid deconjugati in timpul tratarii apelor deseu in compusi parentali liberi (Ternes si col., 1999a). Concentratiile de E2 si E1 din efluentii din lucrarile de tratare ale canalizarii din tarile europene se insiruie de la joase in nanograme per litru, pana la sute de nanograme per litru (Desbrow si col., 1998; Ternes si col., 1999b; Baronti si col., 2000; Kuch si col., 2001; Rodgers-Gray si col, 2001). In Israel , concentratiile masurate de E2 si E1 din efluenti sunt de la 48 la 141 ng/ l (Shore si col. 1993). In SUA, concentratiile de E2 din efluentii din lucrarile de tratare a canalizarii au fost la concentratii de la cele care nu sunt detectabile, pana la 3,7 ng/l (Snyder si col., 1999). Concentratiile mai scazute de estrogeni steroizi din efluentii din lucrarile de tratare a canalizarii in SUA sunt probabil o consecinta a nivelului ridicat de tratare ce se produc la lucrarile studiate si / sau a nivelului ridicat de dilutie a efluentului . Intr-adevar, un studiu recent din UK a aratat ca procesul de tratare din lucrarile de canalizare are un efect semnificativ asupra activitatii estrogenice ulterioare a efluentului (Kirk si col., 2002). Ar trebui subliniat ca estrogenul steroid dintr-un efluent de canalizare tratat specific poate fluctua considerabil (Rodgers-Gray si col., 2000) Sunt disponibile putine date asupra producerii de estradiol in mediul acvatic- dar in general concentratiile masurate la apa de suprafata sunt de ordin sczut, ng per litru pana la 5,5 ng /l (Belfroid si col., 1999). Totusi, apele de suprafata adiacente la descarcarile din efluenti STW pot primi cantitati considerabile de estrogeni steroizi naturali (Lai si col.,2002). In raurile din UK, de exemplu, nu este neobisnuit pentru ca 50% din debitul raului sa cuprinda efluenti tratati, iar concentratia de estradiol din efluentii UK au fost masurati la mai mult decat 100 ng /l. Concentratia finala de estradiol dincursurile apelor de suprafata a STW-urilor vor depinde de distanta de la locul de descarcare - nivelul de dilutie a efluentului, activitatea microbiana pentru degradare, si variate trasaturi fiziochimice ale cursului de apa.

Estradiolul este principalul compus responsabil pentru activitatea estrogenica din lucrarile de tratare a efluentilor de canalizare (Desbrow si col., 1998), si fiind date aceste concentratii, cele gasite in apele de suprafata, si potenta sa estrogenica, E2 este acum considerat drept un contaminant important al mediului acvatic (Kramer si col., 1998; Routledge si col., 1999). In ciuda acestui fapt, se cunoaste putin despre efectele biologice ale expunerii la concentratii scazute de E2, sau sensibilitatea stadiilor de viata diferite ale pestilor la efectele disruptive ale lui E2. Pentru a cauta o rezolvare la aceste probleme, am condus o serie de experimente asupra pestelui zebra (Danio rerio) expunandu-l la concentratii scazute de E2 ( 5, 25 si 100 ng E2 /l). Aceste concentratii corespund celor gasite in mod comun in efluenti si pentru doza mai scazuta, o concentratie gasita la unele ape de suprafata ( Belfroid si col., 1999). D.rerio a fost selectat ca specie de studiu deoarece are multe avantaje pentru studiile de baza de laborator ce folosesc reproductia ca punct final, notabila fiind reproducerea sa rapida in laborator si faptul ca atinge rapid maturitatea sexuala (la in jur de 90 de zile varsta). In plus este membrul unei mari familii ecologic importante de pesti (Cyprinidae) si este o specie de peste larg folosita in multe teste ecotoxicologice standard din ghidurile OECD. In acest studiu, pestele zebra a fost expus la E2 in timpul stadiilor sale de viata embrio-larvara, de tineret sau de adult (cu scopul de a stabili cel mai sensibil stadiu de viata fata de efectele biologice a lui E2) si au fost evaluate efectele asupra plasmei vitelogenine, si cresterii si dezvoltarii gonadale. In plus fata de aceste puncte finale biochimice si histologice, au fost determinate efectele expunerii la E2 in timpul diferitelor stadii de viata asupra productiei lor reproductive ulterioare (productia de oua si supravietuirea embrionului la generatia F1)

Materiale si metode

2.1. Intretinerea stocului de crestere a pestelui

Masculul si femela adulta de peste zebra (D.rerio) au fost obtinuti dintr-o ferma comerciala de peste (Anthias, Franta si Bio-international, Nantes, Franta) . Saptezeci de pesti (raport de 2 masculi, 1 femela) au fost intretinuti in laborator in acvarii de 260 l aprovizionate continuu cu apa de robinet declorinata (25 ± 1⁰C, conductivitate 300 - 330 μS /cm, pH 7.0 ±0.5 si oxigen dizolvat >70%) la o rata de debit de 20 l/h. Pestii au fost hraniti de 4 ori pe zi cu Tetramin (Tetrawerke, Ulrich Baensch, GmbH, Germania) la o rata de 2% a biomasei pestelui per zi. Hrana a fost suplimentata cu crevete de apa sarata vie Artemia salina o data pe zi. Pestii au fost supusi unei fotoperioade de 15 h de lumina, 9 h intuneric.

2.2. Proiectul experimental general

Pestii zebra (D.rerio) au fost expusi timp de 3 saptamani la concentratii relevante pentru mediu ale estradiolului (5, 25 si 100 ng/l) cuprinzand fie stadiile lor de viata embrio-larvar (de la fertilizare pana in ziua 21 post-fertilizare (dpf), juvenila (de la 21 la 42 dpf) sau adulta (> 200 dpf; vezi fig. 1), au fost analizate concentratiile vitelogenine a intregului corp si dezvoltarea gonadala, cu scopul de a investiga efectele expunerii estrogene asupra acestor puncte finale la pestele zebra. La stadiul de adult , au fost masurate punctele finale inclusiv caracteristicile sexuale secundare, cresterea gonadala (indicele gonado-somatic GSI si raportul sexual). Pentru expunerile tuturor stadiilor diferite de viata, a fost evaluata performanta reproductiva a generatiei F0 (productia de oua) si supravietuirea si dezvoltarea embrio-larvelor F1.

2.3. Sistemul expunerii prin debit

In timpul expunerilor la E2, solutiile stocului de E2 au fost preparate odata pe saptamana dizolvand cantitatea adecvata de E2 (Sigma, St.Louis, MO, USA) in acetona care au fost apoi depozitate la intuneric la 4⁰ C. Fiecare solutie stoc de E2 a fost deversata intr-un vas de amestec la o rata a debitului de 75 μl/h folosind un aparat multi-seringi (Aparat Harward PHD 2000, Holliston, MA, USA) echipat cu 4 seringi de sticla de 10 ml (Poulten & Graf, GnbH, Wertheim, Germania). Dilutiile solutiei stoc au fost atinse prin diluarea apei de robinet declorinate sosita, varsata intr-un vas de amestec printr-o pompa peristaltica la o rata a debitului de 4 l/h. Solutia - la concentratia nominala dorita - a fost apoi deversata intr-un tanc de testare adecvat printr-o a doua pompa peristaltica la o rata a debitului de 1,3 sau 4 l/h depinzand de marimea tancurilor de testare. Solutia din vasul de mixare a fost reinoita tot la 15 minute. Orice exces al solutiei de testare din vasul de amestec a fost drenat printr-un orificiu de evacuare. Seringile au fost umplute in fiecare zi cu solutii stoc continand fie E2 fie doar solvent vehiculant (acetona). Concentratia finala a solventului la toate tancurile de testare a fost 0,001 %. Pentru toate experimentele un alt tanc de control a primit doar apa de robinet declorinata la aceeasi rata a debitului. Rata de reinoire pentru fiecare tanc de testare a fost de 8 ori per zi. In timpul tuturor experimentelor, temperatura, conductivitatea si pH-ul tancurilor au fost monitorizate o data pe zi. Pentru a evita depunerea coloniilor bacteriene excesive, materia organica reziduala (hrana, fecale) a fost inlaturata zilnic.

Fig.1. Diagrama proiectului experimental folosit pentru expunerea pestelui zebra (Danio rerio) la 17β-estradiol in diferite stadii de viata.

2.4. Masurarea concentratiilor de E2 din apa

Pentru toate experimentele, concentratiile de E2 au fost masurate prin spectrometrie cu gaz cromatografie de masa (GC-MS). In fiecare saptamana, 0,1 l de apa a fost recoltata din fiecare acvariu la interval regulat de-a lungul unei perioade de 24 h si constituite intr-un bazin (5 x 0,1 l). Au fost apoi extrase mostre de apa de trei ori cu 3 x 50 ml de diclorometan la perioade de 3 x 15 minute. Fazele organice ale fiecarui extract au fost constituite intr-un bazin si uscate cu sodiu sulfat anhidru. Dupa 30 minute, 50 μl de dodecan a fost adaugat la faza organica care ulterior a fost evaporata pana la uscare la 40⁰C. Extractul concentrat a fost apoi diluat in 2 ml de izo-octan. Pentru detectia GC-MS, extractele au fost apoi derivate dupa toate regulile. (Ternes si col., 1999b). Dupa derivatizare, solutia a fost evaporata pana la uscare sub un curent de nitrogen iar reziduul a fost re-dizolvat in 1 ml de izo-octan. A fost folosit GC HP 6890 cuplat la MS HP 5973 (Hewlett-Packard, Wilmington, DE, USA) pentru separarea si detectia analitilor. GC a fost echipat cu injector PTV (volumul injectiei = 5μl fara separare) cuplat la o coloana capilara HP-5MS (30 m x 0,25 μm x 0,25 μm). Programul egal de temperatura a fost de 50⁰C mentinut timp de 3 min, urmat de 25⁰C min^-1 impinsa la 250⁰C si in final 2⁰C min^-1 impinsa la 268⁰C. Parametri MS au fost: linia de trasfer de 280⁰C din cadrul sursei de ioni (model EI) a masei mentinuta la 230⁰C. Energia electronului a fost de 70 eV. Ionii de estradiol au fost monitorizati la m/z 416 (ion precursor), 326 si 285 (ioni produsi). Solutiile standard de estradiol (1, 2, 4, 5 si 10 μg/l) dizolvate in izo-octan au fost folosite pentru calibrarea metodei. Rata de refacere a fost determinata prin mostre de apa tinta cu diferite concentratii de E2 (1, 5 , 10 si 25 ng/l concentratii finale). Aceste mostre (n = 5 per concentratii) au fost supuse la aceeasi extractie, derivatizare si protocol GC-MS descrise mai sus. Au fost folosite mostre albe pentru detectia determinata si limitele de cuantificare.

Pentru fiecare experiment, mostrele de apa au fost luate pentru a masura E2 in zilele 2, 9 si 16 dupa inceperea incheierii (finalul) chimice.

2.5. Expunerile embrio-larvelor si tineretului la E2

Pentru expunerea embrio-larvelor, au fost colectate 2500 oua de la stocul de crestere a pestilor adulti, separate in 5 grupe de 500 si plasate in tancuri de 40 cm lungime x 12 cm latime x 15 cm inaltime. Expunerea la E2 a fost initiata in mai putin de 4 h dupa colectarea embrionilor, adica in stadiul de blastula. Dupa 24 h, au fost indepartate ouale nefertilizate, iar ouale fertilizate au fost in continuare expuse la E2 sub conditiile debitului (1,3 l/h). Larvele nou iesite din ou au fost hranite cu parameci pana la 7 dpf. Apoi au fost hranite cu Sera Micron si rotifere (Brachyonus sp.) pana la 10 dpf. Dupa aceasta perioada larvele au fost hranite cu paramecium, Tetramin® si A.salina pana la 21 dpf (adica finalul expunerii la E2). La 21 si 42 dpf, 45 de pesti per tratament au fost luati randomizat si anesteziati. Cincisprezece din toti pestii per tratament si per punct de mostra au fost fixati in 10% formol fixxT (Pittsburgh, PA, USA) pentru analize histologice, iar 30 procesati pentru analiza vitelogeninului. Pentru expunerea stadiului de viata juvenila, ouale au fost colectate si larvele crescute in apa curata sub conditii similare de temperatura, conductivitate, pH si rata a debitului ca si cele folosite pentru expunerea embrio-larvara. La 21 dpf, patru grupe de 200 larve au fost colectate si in continuare expuse la E2, sau doar la solvent. La 42 dpf, adica sfarsitul perioadei de expunere, 45 de pesti per tratament au fost selectati randomizat si anesteziati, iar restul de pesti au fost fie fixati in 10% formol fixxT pentru analiza histologica (n = 15 per tratament) sau folositi pentru masurarea vitelogeninului (n = 30 per tratament).

Proiectul experimental pentru evaluarea randamentului reproductiv la adultul de peste zebra dupa expunerea la E2 in timpul stadiilor de viata timpurii a fost acelasi pentru cele doua regime de expunere. La 85 dpf, grupe de n= 40 pesti per tratament au fost plasati in tancuri de 40 cm lungime x 20 cm largime x 25 cm inaltime. Marimea pestelui selectat pentru depunerea icrelor a fost aleasa sa fie reprezentativa pentru marimea pestilor din populatie, dintre care au fost luati dupa expunerile la E2. Raportul sexual in grupele de peste crescut nu s-a cunoscut a priori. Pestii pentru crestere nu au fost selectati bazat pe aspectul lor extern, intrucat s-a presupus ca expunerea la E2 ar fi putut modifica infatisarea exterioara a masculului conducand la o posibila determinare inexacta a sexului.

La initierea primului eveniment real de depunere a icrelor din fiecare tanc, performanta reproductiva a fost urmarita si inregistrata la toate tancurile de tratament pentru o perioada de 2 luni. In fiecare dimineata, evenimentele de depunere a icrelor au fost inregistrate, ouale colectate si numarate. Dezvoltarea embrio-larvare a fost urmarita pentru o perioada de 96 ore pentru a determina fertilizarea si rata de incubatie din generatia F1. Pentru acest scop, 30 de oua au fost plasate in containere umplute cu apa curata iar embrionii morti in 24 ore dupa fertilizare au fost numarati si indepartati. A fost apoi asigurat succesul incubatiei si supravietuirea noilor larve iesite din ou. Rata incubatiei este data ca un procentaj a oualor fertilizate.

2.6 Expunerile adultului la E2

Pentru a evalua efectele asupra reproductiei expunerii adultilor de pesti zebra la E2, pestii folositi au fost in varsta de 7 luni. Pentru fiecare grup de tratament (5, 25, 100 ng E2 / l, solvent de control si dilutie de apa control) a fost instalat un singur tanc continand 10 femele (lungimea 39,4 mm ±0,25; greutate 56 mg ±11,63) si 20 masculi (lungime 35,8 ±0,23;greutate 38 mg ±7,7). Tancurile de expunere au fost de 40 cm lungime x 20 cm latime x 25 cm inaltime. Performanta reproductiva la fiecare grup de tratament a fost urmarita pe o perioada de 3 saptamani anterior expunerii la E2 si timp de 3 saptamani in timpul expunerii la E2. Pestii au fost intretinuti in aceleasi tancuri ca pentru estimarea depunerii oualor anterior si in timpul expunerilor la E2 si de aceea, evenimentele de depunere a oualor inainte de expunere au fost desemnate drept controale pentru expunerile E2 urmatoare pentru fiecare regim. Succesul fecunditatii si fertilizarii din generatia F0 si incubatia din generatia F1 au fost evaluate zilnic pe aceeasi cale ca si cea descrisa mai sus pentru protocolul fazei reproductive.

2.7. Metodologii pentru masurarea variatelor puncte finale biologice

2.7.1. Biometria

La sfarsitul fiecarui experiment (adica, cand pestele a atins faza de adult), au fost masurate lungimea si greutatea pestelui. Factorul de conditie (K-factor) a fost calculat pentru fiecare peste dupa formula : K-factor = (greutatea (g) / lungimea (cm)³) x 100. Gonadele mascule si femele au fost indepartate si cantarite si a fost calculat indicele gonadosomatic [(greutatea gonadei / greutatea somatica) x 100]

2.7.2. Masurarea vitelogeninului

Concentratiile de vitelogenin au fost masurate la rezultatul omogenizarii intregului corp al pestelui folosind un test cu imuno-sorbent cu o enzima omoloaga competitiv legata de vitelogeninul pestelui zebra (zf-Vtg ELISA) dupa cum a descris Brion si col., 2002. Testul se bazeaza pe o reactie de competitie pentru anticorpii anti-vitelogeninului (anticorpii policlonali DR-264 s-au ridicat impotriva vitelogeninului pestelui zebra, zf-Vtg) intre vitelogeninul prezent in mostra si zf-Vtg purificat placat pe placuta de microtitrare. Calibrarea (etalonarea) testului a fost executata folosind zf-Vtg purificat ca si curba standard (curba standard cu o serie de la 0,1 la 125 ng/ ml). Seria de lucru a lui zf-Vtg ELISA a fost intre 1 si 30 ng/ ml (20 - 80 % legare), iar limita detectiei a fost 0,4 ng/ ml pentru zf-Vtg purificat cu o limita a detectiei practica in mostrele de omogenati ai intregului corp de 40 ng/ml (din cauza nevoii de a dilua mostrele de omogenat). Variatiile intra si inter-test au fost de 4,7 si respectiv 14 %. Studii anterioare au aratat ca omogenatii intregului corp ai femelelor si masculilor estrogenizati se dilueaza paralel cu zf-Vtg standard, indicand ca testul zf-Vtg ELISA este adecvat pentru cuantificarea zf-Vtg- ului din omogenatii intregului corp. (Brion si col., 2002). Pestii adulti au fost omogenizati individual in solutie tampon ELISA (PBS, 1% BSA, PMSF 1 mM, pH 7.3) intr-un raport de 1:2 (greutate : volum). Dupa centrifugarea omogenatelor (3000 x g, 15 min, 4⁰C), supernatantii au fost retrasi, alicotati si depozitati la -80⁰C pana la testare. Intrucat determinarea cu acuratete a greutatii pestelui nu a fost posibila la 21 dpf, pestii au fost omogenizati individual in 100μl solutie tampon ELISA folosind un micro-poter (Wheaton).

2.7.3. Histologie gonadala

Pentru pestii de 21 dpf, tot pestele a fost procesat pentru observatie histologica. Pestele a fost bagat in ceara parafinica si au fost sectionati longitudinal. Pentru pestii din care s-au facut mostre la 42 dpf, capul si coada pestilor zebra fixati au fost taiate iar sectiunea mijlocie a corpului a fost luata, parafinata si sectionata transversal la 4 μm. La pestele adult, gonadele au fost inlaturate, examinate la microscop pentru a determina sexul gonadal si indicele gonado-somatic calculat. Toate gonadele au fost conservate in 10% formalina, bagate in parafina si sectionate la 4 μm. Sectiunile au fost colorate cu hematoxilin si eosin si au fost examinate sub microscopie cu lumina pentru evaluarea diferentierii celulelor germice si investigarea dezvoltarii ductelor (conductelor) reproductive. Sectiunile gonadale la masculi au fost examinate pentru prezenta oocitelor din testicule, alteratii din structura testiculara si prezenta celulelor Sertoli. La gonadele femele, stadiile dezvoltarii oocitelor au fost de asemenea examinate si in acest scop au fost identificati si numarati 50 de foliculi per compartiment si per femela.

2.7.4. Caracteristicile sexuale secundare

In munca noastra pe pestele zebra, am observat ca femelele mature au papile uro-genitale bine dezvoltate (UGP) pe cata vreme la masculii maturi, UGP este saracacios dezvoltat. Scorul UGP atribuit la femele variaza depinzand de stadiul lor de maturitate. In studiile noastre legand dezvoltarea UGP de maturitatea sexuala la femele, au fost evaluate urmatoarele categorii: scor 0 (UGP ne vizibil, intalnit la femele cu GSI in jur de 1 - 2), scor 1 (UGP abia vizibil, intalnit la femele cu GSI in jur de 3 - 4), scor 2 (UGP clar vizibil, intalnit la femelele cu GSI in jur de 5 - 7) si scor 3 (UGP foarte bine definit, intalnit la femelele cu o medie a GSI de 13 ± 6). La medaka (Oryzias latipes), UGP este un caracter sexual secundar a carui dezvoltare este sub controlul estrogenilor steroizi (Yamamoto si Suzuki, 1955). Am condus un studiu pilot pentru a testa ipoteza ca expunerea la estrogen exogen stimuleaza dezvoltarea UGP la masculul de peste zebra. In acel studiu, adultii masculi de peste zebra au fost expusi la o concentratie ridicata de E2 (0.1, 1, 10, 100 μg/l) sub o conditie semi-statica de-a lungul unei perioade de 2 saptamani. Dezvoltarea unei UGP vizibile la masculul peste a crescut odata cu concentratiile in crestere ale lui E2 (7 din 9 si 6 din 7 masculi peste au avut o UGP bine dezvoltata la concentratiile de expunere de 10 si respectiv 100 μg E2 l). Ca baza acest experiment, s-a ajuns la concluzia ca UGP ar putea fi folosit ca un marker al expunerii estrogenice la masculul de peste zebra. In toate experimentele acestui studiu, pestii adulti au fost examinati pentru dezvoltarea UGP si clasificati in 4 categorii grupa (0 = nevizibil, 1 = vizibil, dezvoltat saptamanal, 2 = vizibil, destul de bine dezvoltat si 3 = foarte bine dezvoltat).

2.8. Analiza statistica

A fost folosita statistica software (Statsoft Inc., Tulsa, OK, USA) pentru toate analizele statistice. Datele Vtg au fost transformate logaritmic pentru a fi in acord cu testul normalitatii si pentru omogenitatea variantei (Testul Levene). Au fost calculate intervalele de confidenta 95% (CI 95%) pe datele transformate logaritmic folosind valorile critice ale distributiilor t student. Analiza cu sens unic a variantei (ANOVA) a fost executata pe datele Vtg transformate logaritmic, urmate de testul Dunett pentru comparatii post-hoc (speciale) ale grupelor. Testul chi-patrat a fost folosit pentru a testa ipoteza nula a ne-diferentei masculului: raportul de sex femel intre grupa de control si grupele tratate cu E2. Testul chi-patrat a fost de asemenea folosit pentru a compara distributiile scorurilor UGP intre controale si grupele tratate. Cand numarul de observatii a fost scazut (n < 20), metoda de extractie Fisher a fost folosita in locul testului Chi-patrat. Pentru a compara ratele de fertilizare si incubatie intre, inainte si in timpul expunerii la E2, a fost folosita o comparatie a ambelor parti (testul student t).

3. Rezultate

3.1. Concentratia de E2 din tancurile de testare

Regenerarile medii de 17 β-estradiol din mostrele ce contin 1, 5, 10 si 25 ng E2 /l au fost de 104, 118, 99 si respectiv 130 % (n = 5). Reproductibilitatea metodei a fost satisfacatoare cu coeficienti de variatie de la 5 la 15 %. La mostrele de apa cu 1 ng / l coeficientul de variatie a fost mai ridicat (CV 40 %). Metoda dezvoltata a permis o detectie a lui E2 pana la 0.5 ng / l si o cuantificare cu acuratete de 2 ng/l.

Concentratiile medii masurate de E2 din acvariile de testare sunt rezumate in Tab.1. Concentratiile medii masurate au fost apropiate de concentratiile nominale. Concentratia cea mai ridicata de E2 a fost nestabila de-a lungul perioadei de expunere din experimentele cu embrio-larve si tineret. In tancurile de control, au fost detectate concentratii joase de E posibil datorate dizolvarii de E2 din peste.

Tab.1. Concentratii medii ± deviatia standard (n = 3) a estradiolului masurat in acvarii in timpul a trei saptamani de expunere pentru fiecare experiment.

nm - nemasurat; <LD - sub limita de detectie

3.2. Efecte biologice la pestii zebra dupa expunerea la E2 la stadii variate de viata.

3.2.1. Mortalitate si crestere

Nu au existat efecte semnificative ale expunerii la E2 asupra supravietuirii pestilor pentru oricare regimuri de expunere, pentru toate experimentele. Pentru experimentele cu embrio-larve si tineret, supravietuirea pestelui a fost mai mare de 90%. O mortalitate ridicata si neasteptata s-a produs la grupele cu apa de control in timpul perioadei de expunere la E2 din experimentele de expunere in stadiul de viata timpuriu, dar motivele unei astfel de mortalitati sunt necunoscute. Pentru experimentul adultilor, nu a fost inregistrata nici o mortalitate in timpul perioadei de pre-expunere la E2, dar in timpul perioadei de expunere, 1 femela din 12 a murit la grupele expuse la 25 si 100 ng E2/l. Mortalitatea masculilor nu a fost relationata la doza de E2 intrucat cea mai ridicata mortalitate a fost observata in controlul solventului si grupele cu 5 ng E2/l (3 masculi din 20 din fiecare acvariu de testare).

In experimentul cu embrio-larve, cand pestele atinge maturitatea nu au existat nici o diferenta in greutatea si lungimea femelelor sau la masculi, intre cei de control si grupele expuse la E2. (Tab.2.) Factorul de conditie a femelelor din acest experiment din grupul cu 100 ng E2/l a fost semnificativ mai ridicat comparat cu grupul solventului (P<0.01, testul student t).

Lungimea si greutatea femelelor adulte din experimentul expunerii juvenile au fost semnificativ reduse la peste 25 si respectiv 100 ng E2/l. Factorul K al masculilor adulti (expusi la E2 ca tineret) din grupele cu 25 ng E2/l a fost semnificativ mai scazut decat la masculii de control (Tab.2.)

Pentru experimentul de expunere a adultilor, nu au existat diferente in greutate si lungime a femelelor sau masculilor intre cei de control si grupele expuse la E2, cu exceptia greutatii femelei din grupa de control a solventului care a fost semnificativ mai redusa comparativ cu grupa de control a apei (P<0.05, test student t) (Tab.2.) Nu au existat diferente in greutate, lungime si factor K a femelelor si masculilor de peste inainte si dupa tratamentul cu E pentru dozele individuale (p> 0.05, comparatie pereche prin testul t).

Tabelul 2. Lungimea, greutatea si factorul de conditie (factorul K) si indicele gonadosomatic (GSI)determinate la masculi si femele adulte de peste zebra expusi la concentratii gradate de estradiol cuprinzand fie stadiul de viata embrio-larvar (fertilizare - 21 dpf), tineret (21 - 42 dpf) sau cel de adult.

3.2.2. Inductia vitelogeninului

Dupa 21 de zile de expunere a embrio-larvelor la E2, nu s-a produs nici o inducere de vitelogenin la pestii expusi la concentratii nominale de 5 si 25 ng E2 /l. Din contra, dupa 21 de zile de expunere la o concentratie nominala de 100 ng E2 /l, a existat o inductie de trei ori a vitelogeninului (P< 0.05, ANOVA, fig 2A). In mod similar la expunerile pestelui tineret de la 21 la 42 dpf, la 42 dpf nu au existat diferente observate in concentratiile vitelogeninului pentru pestii expusi la 5 si 25 ng E2 /l in timp ce expunerea la 100 ng E2 /l a condus la o inductie marcanta (de 8 ori) (882 ng/ml (500 - 1540)) (fig.2B.) Pentru expunerile stadiului de adult la E2, a existat o inductie doza-dependenta a vitelogeninului la masculii de peste zebra (fig.2.C). Concentratia efectiva pentru inducerea vitelogeninului la masculi a fost intre 5 si 25 ng E2/l. Concentratia maxima de vitelogenin s-a produs la pestii expusi la cea mai inalta doza de E2 (811 x 10³ ng/ml ((410 - 1602) x 10³). La femele, concentratia efectiva pentru inducerea vitelogeninului a fost intre 25 si 100 ng E2 /l iar la femelele expuse la 100 ng E2 /l a existat o crestere de 100 de ori.

Concentratiile vitelogeninului din intregul corp (masurate la 160 dpf) la masculul si femela adulta expusi la E2 fie in timpul stadiului de viata embrio-larvar, fie de tineret au fost ne semnificativ diferite de concentratiile vitelogeninului de la masculii si femelele de control pentru orice doza de control (fig.3.). Trebuie notat ca nu a existat diferenta in concentratiile vitelogeninului la femelele de control adulte intre cele doua experimente, ceea ce este probabil o consecinta a marimii semnificativ mai mari a femelei din experimentul de tineret comparat celei din experimentul embrio-larvar (p< 0.001 si respectiv < 0.05 pentru lungime si greutate , respective testul student t).

Figura 2. Concentratia vitelogeninului la omogenatele de : (A) 21 zile varsta; (B) 42 zile varsta pesti zebra expusi la concentratii gradate de 17β - estradiol intre 0-21 si respectiv 21-42 dpf. (C) concentratiile vitelogeninului la pesti zebra expusi la concentratie gradata de E2 pentru 21 zile ca adulti. Valorile vitelogeninului , exprimate ca ng/ml de omogenati, sunt medii geometrice ± 95 interval de confidenta (^*p <0.01 si ^***p < 0.001, ANOVA)

Figura 3. Concentratiile vitelogeninului la pestele adult (160 dpf) dupa expunerea la 17β-estradiol in timpul stadiilor timpurii de viata: (A) de la fertilizare la 21 dpf si (B) de la 21 la 42 dpf. Valorile sunt medii geometrice ± 95 CI.

3.2.3. Dezvoltarea gonadala

La 21 dpf, analiza histologica a pus in evidenta ca gonadele nu erau diferentiate (fig.4.). Ele constau dintr-o structura mica elongata compusa din celule germice nediferentiate (gonocite), inconjurate de o patura de celule somatice. Au fost observate trasaturile morfologice ale gonocitelor (contractia celulara, condensarea nucleului fara nici un semn de reactie inflamatorie). La acest stadiu, gonadele erau in stransa asociere cu peretele cavitatii peritoneale.

Fig.4. Gonada nediferentiata timpuriu la 21 zile varsta la pestele zebra. Intregul peste a fost sectionat longitudinal la 4 μm (obiectiv 40 x). Go = gonocite, So = celule somatice, Ap = gonocit apoptotic.

La 42 dpf, diferentierea sexului femel a fost completa. Ovarele erau compuse din celule mari (oocite stadiul 2, 20 - 100 μm in diametru) cu o citoplasma compacta care se coloreaza bazofilic (fig.5.A.). Celulele foliculare erau aranjate intr-un singur strat inconjurand oocitele de stadiu 2. Celule mai mici (10 - 20 μm in diametru) cu o citoplasma clara si ocazional cu celule foliculare asociate au fost localizate la polii gonadei (fig.5B.) La acest stadiu, gonada femelei a fost bilateral atasata la cavitatea peritoneala, dand nastere la o cavitate retrogonadala (cavitatea ovariana). La 42 dpf, diferentierea celulelor germice nu a fost completa la toti masculii si gonada "mascula" a fost inca considerata a fi intr-o faza tranzitorie. Gonada masculului a fost adesea atasata unilateral cavitatii peritoneale dar atasarile bilaterale au fost aparente la cativa "prezumtivi" masculi din grupa de control (fig.6A si B). Testiculul putativ a aparut cu mult mai mic in marime decat ovarul la pestii din acelasi stadiu de viata si a protuberat in cavitatea peritoneala. Examinarea mai apropiata a pus in evidenta ca gonadele prezumtivului mascul erau compuse din numeroase celule eosinofilice caracterizate prin margini unghiulare si un nucleu cu cromatina hiperbazofilica (fig.6C si D). Astfel de celule au fost caracterizate ca apoptoze de trecere si indica ca o reorganizare profunda a gonadei are loc la acest timp cu degenerarea si pierderea populatiei celulare care a inclus stadiul nediferentiat. Unele celule sunt in forma de ciorchine cu o organizare precum a spermatocistului. Deci, principalele criterii care au permis sexelor sa fie distinse la 42 dpf au fost marimea gonadei, tipul de atasament peritoneal, prezenta oocitelor, activitatea apoptotica si organizarea asemanatoare spermatocistului. La 160 dpf, analiza histologica a aratat ca gonadele femelelor contineau toate stadiile de dezvoltare a oocitelor iar masculii erau caracterizati prin spermatogeneza activa (fig.7.)

Fig.5. Micrografie luminoasa a ovarului la 42 zile varsta a femelelor de peste zebra atasate la mezenter prin 2 puncte de atasament formand o cavitate ovariana (obiectiv 20 x). Oo = oocit stadiu 2; Fo = celula foliculara; Cl = celula clara; Oc = cavitate ovariana.

La grupele expuse la E2 in timpul stadiului de viata embrio-larvar sau de tineret, analiza histologica a aratat o crestere in proportia de masculi prezumtivi cu gonade cu 2 puncte de atasament la mezoderm. In experimentul de expunere a tineretului, proportia de masculi prezumtivi de peste cu cavitate retrogonadala precum la femele a fost relationata la doza cu un efect semnificativ la 100 ng E2 /l comparat la grupul de control a solventului (tab.3, p exact Fisher < 0.01 si Fig.8A). In timp ce nu au fost observate nici un testicul-ovar la nici un control, doi din cei trei masculi din grupa cu 100 ng E2 /l pentru expunerea juvenila au continut oocite de stadiu 2 (Fig.8B). Aceste gonade au aratat de asemenea importante semne de degenerare (corpi apoptotici), cavitatie intraovariana care ar putea fi atribuita populatiei de celule pierdute. Aceste gonade pot sa reprezinte doar stadii tarzii a unei dezvoltari protoginice timpurii.

Fig.6. Micrografie luminoasa a testiculului la 42 zile varsta la masculul de peste zebra. (A) Testicul atasat la mezenter printr-un punct de atasament si compus din celule in forma de ciorchine cu organizare precum a spermatocistului, obiectiv 40 x. (B) La un mascul de control atasamentul bilateral la cavitatea peritoneala a fost observat cu obiectiv 40 x. (C - D) testiculele au fost caracterizate printr-o reorganizare profunda cu degenerarea celulelor desemnate ca oocite apoptotice putative, obiectiv 100 x. Ap = oocit apoptotic; Spc = spermatocist; Ga = atasament gonadal.

Fig.7A. Ovar de la femela adulta de peste zebra aratand oogeneza activa. Au fost observate toate stadiile dezvoltarii oocitelor. (B) Testicul de mascul adult de peste zebra aratand spermatogeneza activa. Obiectiv 10 x. Po = oocit previtelogenic; Vo = oocit vitelogenic; So = oocit secundar; Spc = spermatocist.

Tabelul 3. Inductia cavitatii retrogonadale asemanatoare femelei la masculul de peste zebra din experimentele cu embrio-larve si tineret.

In experimentul in care pestele adult a fost expus la E2, nu au fost efecte la femele in termenii proportiei de oocite la stadii variate de dezvoltare (rezultate ne demonstrate, p > 0.05, testul Chi patrat). Spermatogeneza activa a fost observata la testiculele adultilor atat de control cat si expusi la E2 cu nici o diferenta evidenta intre grupe (si deci nici un efect evident a lui E2). Nici unul dintre testiculele examinate la acesti adulti nu a continut oocite.

GSI la pestii masculi si femele masurate la sfarsitul studiilor de reproductie sunt redate in tabelul 2. La femelele expuse la 100 ng E2/l ca adulte a existat o reducere in GSI. La toate celelalte grupe , nu au fost efecte relationate de doza a tratamentului estrogen asupra cresterii gonadei.

In experimentele embrio-larvare si de tineret, populatiile de control au fost compuse din 58% masculi si 42% femele si respectiv, 69% masculi si 31% femele. (Fig.9.)

Expunerea la E2 din timpul dezvoltarii embrio-larvare conduce la o crestere a proportiei de femele. Acest efect a fost doza- dependent si cu un efect semnificativ la 100 ng/l , cauzand un raport sexual schimbator comparativ cu populatia de control (p < 0.05, testul chi patrat). Expunerea la 100 ng/l in timpul stadiului de viata juvenila de asemenea pare sa conduca la o proportie crescuta a femelelor, dar acest efect nu a fost statistic semnificativ.

3.3. Caracteristici sexuale secundare

Expunerea la E2 fie in timpul stadiului de viata embrio-larvar sau de tineret, nu a condus la un efect cu remanenta lunga asupra dezvoltarii UGP la masculi. Din contra, dupa expunerea la E2 in timpul stadiului de de adult, inducerea dezvoltarii largite a UGP la masculi a fost doza-dependenta (p<0.05, test chi-patrat Fig10). Aparitia pestilor cu UGP bine dezvoltat a fost statistic semnificativa la concentratia E2 de 25 ng/l comparativ cu cea de la controlul solventului (p<0.05, testul chi-patrat), iar la concentratia E2 de 100 ng|l comparativ cu cea de la controalele solventului, cat si la apa de dilutie (test chi -patrat p<0.01).

3.4. Efecte asupra reproductiei

3.4.1. Efectele dupa expunere la E2 in timpul stadiilor timpurii de viata

Datele asupra produsului reproductiv al generatiei F0 pentru expunerile embrio-larvare si juvenile la E2 sunt rezumate in Tab.4. Primele evenimente de depozitare a oualor la grupele expuse la E2 s-au produs dupa grupurile de control. In experimentul in care a fost expus tineretul la E2, primul eveniment de depunere a oualor la grupul de tratament cu 100 ng E2/l s-a produs cu aproape 2 saptamani mai tarziu decat la grupul de control.

La grupele de control a existat o diferenta marcanta in productia de oua la femelele din experimentele de expunere embrio-larvara comparativ cu cele de tineret cu o productie de oua mai scazuta la femelele din experimentul embrio-larvar, un efect care poate fi atribuit concentratiilor mai scazute ale vitelogeninului gasite la femelele din expunerea embrio-larvara comparativ cu experimentul juvenil (Sectiunea 3.2.2.). Femelele expuse la 100 ng E2 /l in timpul dezvoltarii embrio-larvare au aratat o productie de oua crescuta.

Expunerea la E2 in timpul dezvoltarii embrio larvare conduce la o crestere a proportiei de femele. Acest efect a fost doza dependent si cu un efect semnificativ la 100 ng/l ,cauzand un raport sexual schimbator comparativ cu populatia de control (p < 0.05, testul chi patrat). Expunerea la 100 ng/l in timpul stadiului de viata juvenila de asemenea pare sa conduca la o proportie crescuta a femelelor, dar acest efect nu a fost statistic semnificativ.

3.3. Caracteristici sexuale secundare

Expunerea la E2 fie in timpul stadiului de viata embrio- larvar sau de tineret nu a condus la un efect cu remanenta lunga asupra dezvoltarii UGP la masculi. Din contra, dupa expunerea la E2 in timpul stadiului de de adult, inducerea dezvoltarii largite a UGP la masculi a fost doza-dependenta (p<0.05, test chi-patrat Fig10). Aparitia pestilor cu UGP bine dezvoltat a fost statistic semnificativa la concentratia E2 de 25 n /l comparat la controlul solventului (p<0.05, testul chi-patrat} si la concentratia E2 de 100 ng|l comparat atat la controalele solventului cat si la apa de dilutie (test chi -patrat p<0.01).

3.4. Efecte asupra reproductiei

3.4.1. Efectele dupa expunere la E2 in timpul stadiilor timpurii de viata

Datele asupra produsului reproductiv al generatiei F0 pentru expunerile embrio-larvare si juvenile la E2 sunt rezumate in Tab.4. Primele evenimente de depozitare a oualor la grupele expuse la E2 s-au produs dupa grupurile de control. In experimentul in care a fost expus tineretul la E2, primul eveniment de depunere a oualor la grupul de tratament cu 100 ng E2|l s-au produs cu aproape 2 saptamani mai tarziu decat la grupul de control.

La grupele de control a existat o diferenta marcanta in productia de oua la femelele din experimentele de expunere embrio-larvara comparativ cu cele de tineret, cu o productie de oua mai scazuta la femelele din experimentul embrio-larvar, un efect care poate fi atribuit concentratiilor mai scazute ale vitelogeninului gasite la femelele din expunerea embrio-larvara comparativ cu experimentul juvenil (Sectiunea 3.2.2.). Femelele expuse la 100 ng E2 / l in timpul dezvoltarii embrio-larvare au aratat o productie de oua crescuta.

Fig.8. Gonade feminizate de la mascul prezumtiv de peste zebra de 42 zile varsta. (A) Testiculele unui peste prezumtiv mascul care a fost expus la 100 ng E2/l in timpul stadiului de viata juvenila si aratand o cavitate retrogonadala precum a femelei (cavitate ovariana). (B) Gonadele unui prezumtiv mascul de peste zebra expus la 100 ng E2 / l in timpul stadiului de viata juvenila aratand trasaturi morfologice atat de la mascul si femela, cat si semnele unei profunde reorganizari sau degenerare. Acest testicul-ovar putativ este unilateral atasat la peritoneu cum se observa doar la gonadele mascule. Prezinta mai multe celule apoptotice de marime medie cu o citoplasma eosinofilica (cum se observa la animalele mascule), cat si o singura celula ovala mare (30 µm in diametru) cu citoplasma compacta consistenta, cu un oocit de stadiu 2. Obiectiv 20x. Ic =cavitatie intraovariana; *= corp apoptotic; Oc= cavitate ovariana; Oo= oocit stadiu 2.

Fig.9. Rapoarte sexuale ale populatiei de peste zebra expuse la estradiol (A) de la fertilizare la 21 dpf, sau (B) de la 21 la 42 dpf. Raportul sexual a fost determinat prin identificarea sexului gonadal la peste de 160 zile varsta (*p<0.05, test chi-patrat) N indica numarul total de peste folosit pentru a determina raportul sexual la fiecare grup.

Din contra, a existat o productie de oua scazuta odata cu cresterea concentratiei de E2 pentru expunerile din timpul stadiului de viata juvenila. Prin aceste studii productia de oua a fost relattonata la frecventa de depunere a oualor; diferentele din fecunditate au fost o functie a numarului de evenimente de depunere a oualor si nu alteratii din marimea lotului (fig.11).

Ratele de fertilizare si rata ulterioara de incubare din generatia F1 sunt prezentate in tabelul 4. Rata fertilizarii si incubatia generatiei F1 din experimentul embrio-larvar au fost semnificativ diferite comparativ cu experimentul juvenil (p < 0.05, testul student, t). Motivele acestor rate de fertilizare si incubatie scazute neasteptate nu sunt cunoscute, dar pot fi atribuite unei infectii fungice. Pentru ambele experimente, nu au fost vazute nici o diferenta semnificativa nici la rata de fertilizare nici la cea de incubare pentru nici un grup de tratament comparat cu grupul de control corespunzator.

3.4.2.Efectele dupa expunere la E2 in timpul stadiilor de viata adulta.

Figura 12 prezinta numarul total de oua depuse per femela si numarul total al depunerilor de oua in timpul unei perioade de 3 saptamani anterior si in timpul expunerii la E2. Depunerea de oua din perioada anterioara expunerii la E2 s-a produs la intervale regulate pentru toate tratamentele. Ratele medii de fertilizare au fost intre 81 si 93% iar ratele de incubare au fost de asemenea ridicate (rata medie de incubare intre 95 si 98 %). Fecunditatea a variat intre diferitele grupuri si a fost asociata cu numarul de evenimente de depunere a oualor; cea mai ridicata productie de oua a fost observata la grupul cu 100 ng/l pentru care s-au inregistrat 14 evenimente de depunere a oualor.

La grupele de control ale apei si solventului, numarul total de oua ouate per femela a fost chiar similar cu productia de oua inregistrata in timpul perioadei de pre-expunere (99 si respectiv 111 %). Din contra, expunerea la E2 a rezultat intr-o reducere aparent doza-dependenta in fecunditate. La femelele expuse la concentratii medii masurate de 16,5 ± 9,3 si 82 ±16,5 ng E2/l, numarul de oua ouate per femela au fost de 80 si respectiv 75 %, din cele inregistrate inainte de expuneri. Acest efect a fost o consecinta a reducerii numarului de depuneri a oualor; la grupele de control, numarul de depuneri a oualor a crescut in perioada expunerii (comparative cu perioada pre-expunerii) in timp ce la toate celelalte grupe expuse la E2, numarul de depuneri a fost redus.

Comparatii ale ratelor de fertilizare, si succesul incubarii la generatia F1, pentru fiecare grup de tratament, comparative la pre-expuneri si in timpul expunerii la E2, nu au prezentat efecte semnificative ale expunerii la E2 la aceste concentratii (p > 0.05, comparatie pereche prin testul t),(Fig.13.).

Fig.10. Scorul (inregistrarea) papilei uro-genitale mascule (UGP) determinat la masculul adult de peste zebra dupa expunerea ca adulti la E2: 0 nevizibil; 1 vizibil, dar slab dezvoltat; 2 vizibil, destul de bine dezvoltat; 3 vizibil, foarte bine dezvoltat.

4. Discutie

Acest studiu descrie deteriorarea gonadala si reproductiva la pestele zebra urmatoare expunerii variatelor stadii de viata la concentratii relevante mediului de E2. Concentratiile de E2 adoptate au inclus pe cele gasite in efluentii lucrarilor de tratare a canalizarii si apele de suprafata din tinuturile industriale.

Tabelul 4. Produsul (randamentul) reproductiv din experimentele cu embrio-larve si tineret.

4.1. Efectele expunerii la E2 asupra vitelogenezei

Expunerea de 3 saptamani a pestilor zebra la concentratii relevante mediului de E2 a condus la inductia vitelogenina pentru toate stadiile de viata expuse. Concentratia efectiva pentru inductia vitelogenina la aceste stadii de viata timpurii a fost de 100 ng E2/l. Aceste date sugereaza ca stadiul de viata timpurie a pestelui zebra este sensibil la estrogeni iar expunerea rezulta in inducerea anormala a vitelogeninului. Acest lucru este in concordanta cu studiul lui Legler si col., 2000, care a demonstrat ca subtipurile receptoare ale estrogenului α si β sunt expuse foarte timpuriu in dezvoltarea pestelui zebra (de la 1 dpf) si expunerea la E2 regleaza pozitiv expresia genelor ER. S-a aratat in mod similar, ca la Pimephales promelas (plevusca cu cap gras) sinteza vitelogenina se produce la pestele expus la E2 in timpul stadiilor de viata timpurii (Tyler si col. ). Magnitudinea raspunsurilor intalnite la plevusca cu cap gras in stadiile timpurii de viata a fost mai ridicata decat cea intalnita la pestele zebra (cu de 10 ori), dar acest lucru poate fi o consecinta a diferentelor timpului de expunere si/sau duratei de expunere, mai degraba decat alte diferente in sensibilitatea speciei.

La masculul adult de peste zebra, concentratia efectiva pentru inducerea vitelogenina (intre 5 si 25 ng/l) a fost mai scazuta decat pentru pestii cu stadiu de viata timpuriu si a fost in concordanta cu cea raportata anterior pentru aceasta specie (Brion si col., 2000). La femelele mature, concentratia efectiva pentru inducerea vitelogenina (100 ng/l) a fost mai ridicata decat cea pentru masculi, ceea ce este probabil o consecinta a concentratiilor vitelogenine bazice mai scazute la masculi comparative cu femelele. Acest lucru e sprijinit de munca noastra anterioara asupra efectelor lui E2 asupra inducerii vitelogenine la femele, unde concentratiile medii de vitelogenin au fost aproape de 30 si 60 ori mai scazute decat cele raportate in acest studiu, concentratia efectiva pentru inducerea vitelogenului a fost de 25 ng/l (Brion si col., 2000). La alte specii de pesti, cea mai mica concentratie efectiva pentru inducerea vitelogenina la tineret / adulti pentru un timp de expunere similar s-a situat intre 10 ng/l la salmonide (pastrav curcubeu (Onchorynchus mykiss); Thorpe si col. ) si 27 - 100 ng/l la alte ciprinide (plevusca cu cap gras, Kramer si col., 1998; Panter si col., 1998; babusca Rutilus rutilus, Routledge si col., 1998). La pestele cyprinodont (plevusca cu cap de oaie, Cyprinodon variegates), cea mai mica concentratie efectiva pentru inducerea plasmei vitelogenine a fost de 200 ng/l (Folmar si col., 2000).

Studii anterioare au demonstrat ca inducerea vitelogeninului prin (xeno)estrogeni la pestele mascul este reversibila dupa epurare in apa curata (Allen si col., 1999; Brion si col., 2000; Schultz si col., 2000; Rodgers- Gray si col., 2001). In lucrarea lui Rodgers-Gray si col., 2001, vitelogeninul indus la babusca dupa expunere la efluenti estrogenici in timpul vietii timpurii a fost partial (dar nu complet) curatat din circulatie dupa 100 zile de depurificare. Din contra, la pestele expus la E2 in timpul stadiilor timpurii de viata, dupa 118 - 139 zile de depurificare, a existat o limpezire (curatare) totala a vitelogeninului indus prin aceasta expunere. Acest lucru ar sugera ca inducerea vitelogeninului (cel putin la aceasta magnitudine) este improbabila sa aiba orice efecte pe termen lung in detrimentul sanatatii la mascul si femela.

4.2. Efectele expunerii la E2 asupra diferentierii sexual si dezvoltarii gonadale.

Dezvoltarea gonadala la pestii zebra din controale a demonstrat ca diferentierea sexului (definit histologic) are loc intre 21 si 42 dpf. Aceste observatii sunt in concordanta cu alte studii unde s-a gasit ca diferentierea sexului la masculi si femele incepe intre 21 si 28 zile post-incubatie (dpf) si este complet la aproximativ 40 dpf (Takahashi, 1977; Uchida si col., 2002; Orn si col., 2003; Hsioa si Tsai, 2003). Takahashi (1977) a fost primul care a descoperit ca toate gonadele trec printr-o forma asemanatoare ovarului indiferent de sexul lor genetic inainte sa se diferentieze fie in testicule, fie in ovare. Acest fenomen de a avea gonade nediferentiate asemanatoare ovarului in timpul perioadei juvenile a fost descris ca hermafrodism juvenil (Takahashi, 1977). In timpul acestei perioade de tranzitie a tesutului asemanator ovarului spre testicule care se produce intre 22 si 34 dpf (Hsioa si Tsai, 2003), sunt observate modificari majore in gonade cu apoptoza oocitelor, care a sugerat mecanismul diferentierii testiculare si ovariene la pestele zebra (Uchida si col., 2002, 2004). Analiza noastra histologica a dezvoltarii gonadelor a demonstrat clar ca expunerile la E2 de la fertilizare pana la 21 dpf au loc inainte de diferentierea gonadala si perioada de expunere de 21 - 42 dpf, in timpul diferentierii sexuale a masculilor si femelelor, chiar daca in studiul nostru gonadele mascule la 42 dpf nu erau complet terminate.

La alte specii de peste timpul diferentierii sexuale in sexe diferite, difera. La medaka japonez (O.latipes), diferentierea sexului femelei se produce inainte de iesirea din ou in timp ce la mascul, diferentierea testiculelor are loc cam la 13 zile dupa iesirea din ou (Yamamoto, 1953, 1975) La crap (Cyprinus carpio), diferentierea sexuala la femele se produce in mod normal intre 50 si 60 dpf in timp ce gonadele masculului raman nediferentiate pana la 90 dpf (Komen si col., 1995) La pestele zebra, rezultatul ca diferentierea sexului se produce simultan (sau cel putin de-a lungul unei foarte scurte perioade de timp) la masculi si femele poate fi de valoare cand se evalueaza impactul (xeno)estrogenilor asupra diferentierii sexului masculilor si femelelor.

La grupele de control, raportul sexual mascul : femela (determinat prin identificarea sexului gonadei la 160 dpf) pentru cele doua experimente ale stadiului timpuriu de viata au fost 58 : 42 si 69 : 31, ceea ce este in concordanta cu rapoartele sexuale raportate in alte studii pe pestele zebra (60 : 40) (Fenske si col., 1999), (68 : 32) (Orn si col, 2000), 56 : 44) (Vaughan si col., 2001, Hsioa si Tsai, 2003). Deci apare in mod tipic faptul ca raportul sexual normal pentru populatiile de peste zebra nu este de 1 mascul la 1 femela, ci este deviat spre o predominanta a masculilor. Acest lucru sugereaza ca determinarea sexului la pestii zebra poate fi polifactoriala.

Diferentierea sexului la peste este un proces puternic labil, iar expunerea pestelui la estrogeni exogeni in timpul perioadei labile sau critice de dezvoltare, care este specifica speciei, poate conduce la o reversie completa a sexului (Baroiller si col.,1999; Pifferer, 2001).

Fig.12. Produsul (randamentul) reproductiv la pestele adult pentru o perioada de 3 saptamani anterior expunerii si in timpul expunerii la E2. (A) numarul total de oua depuse per femela si (B) numarul de evenimente de depunere a oualor.

Fig.13. (A) Rata de fertilizare si (B) succesul incubatiei inregistrate inainte si dupa expunerea la E2 in experimentul de expunere a adultilor.

S-a demonstrat ca factorii de mediu precum temperatura afecteaza de asemenea diferentierea sexului la multe specii de pesti (Baroiller si col., 1999; Jalabert si col., 2000), inclusiv si pe a pestelui zebra (Vaughan si col., 2001; Uchida si col., 2004).

In studiul prezent, noi am aratat ca expunerea pestelui zebra la concentratii scazute de E2 inainte si in timpul perioadei de diferentiere sexuala (definite histologic) a rezultat intr-o alterare a procesului normal de diferentiere sexuala. Acest efect nu a fost datorat temperaturii, intrucat au fost mentinute regime de temperatura constante si identice in toate acvariile pentru experimente.

La pestii expusi la E2 anterior si in timpul diferentierii sexuale a existat un numar crescut de prezumtivi masculi avand o cavitate retrogonadala. Este important sa subliniem ca, pentru experimentul cu embrio-larve, ea s-a observant chiar dupa perioada de 21 zile de depurificare in apa curata, sugerand un efect persistent/permanent a lui E2 asupra dezvoltarii cavitatii retrogonadale asemanatoare femelei, la masculi. La alte specii de peste, s-a demonstrat ca expunerea crapilor toti masculi la concentratii ridicate de estrogen mimic 4-tert-pentilfenol pentru perioade anterior si in timpul diferentierii sexuale conduce la inducerea ductului reproductiv asemanator femelei. In mod similar, expunerea tineretului de babusca (R.rutilus) de la 50 la 100 dph (adica inainte de diferentierea celulei germinative mascule vizibila) la efluenti de canalizare tratati estrogenic a rezultat intr-o inducere doza-dependenta a ductului reproductiv asemanator femelei la masculii de babusca si acest efect nu a fost reversibil dupa 100 zile de depurare, din nou sugerand ca efectul era permanent (Rodgers-Gray si col., 2001).

In acest studiu pe pesti zebra, am demonstrat ca expunerile in stadiul timpuriu de viata la E2 par de asemenea sa afecteze diferentierea celulelor germice. Acest lucru este sprijinit de natura nesimetrica a raportului sexual inspre femele pentru pestii expusi la 100 ng E2/l din experimentul in care ei au fost expusi de la fertilizare pana la 21 dpf. La pestii expusi la 100 ng E2/l de la 21 la 42 dpf, doi pesti prezumtivi masculi au aratat caractere morfologice ale gonadelor atat de la female, cat si de la masculi si au fost considerati ca pesti intersex. Perioada de expunere 21 - 42 dpf corespunde stadiului in care gonadele masculului suporta modificari morfologice profunde precum apoptoza oocitelor. De aceea este posibil ca expunerea E2 in timpul acestei perioade sa conduca la o intarziere in instalarea diferentierii testiculelor care poate de asemenea sa explice intarzierea de 2 saptamani a timpului primei depuneri de oua observate la pestele ulterior adult (vezi efectul expunerii la E2 asupra reproductiei). Din contra, expunerea masculului adult de peste zebra la E2 nu a condus la o perturbare histologica si nu a rezultat nici un peste mascul intersex.

Aceste date indica faptul ca efectele lui E2 asupra diferentierii celulei germice sunt dependente de timpul (si doza) de expunere. Poate ca nu este surprinzator, intrucat in lucrari anterioare gonade nediferentiate s-au aratat a fi foarte responsabile la actiunea steroizilor exogeni, cu toate ca au fost folosite dozele foarte ridicate pentru a studia aceste efecte (Blazquez si col., 1998; Pifferer, 2001). Aceasta sensibilitate a gonadelor pare sa se descompuna ca progrese ale procesului ontogenic (Blazquez si col., 1998; Pifferer, 2001). In ce mod aceste efecte disruptive ale lui E2 asupra dezvoltarii sexuale la pestele zebra sunt mediatizate, nu este cunoscut. S-a aratat recent ca mult inainte ca semnele histologice ale diferentierii sexuale sa apara, genele ce codeaza enzimele steroidogenice care mediaza acest proces au diferite tipare de expresie la masculi comparativ cu femelele (Guiguen si col., 1999; Marchand si col., 2000; Liu si col., 2000). si ca expresia acestor gene poate fi afectata de tratamentele cu steroizi (Guiguen si col., 1999; Marchand si col., 2000; Liu si col., 2000; Scholz si Gutzeit, 2000; Govoroun si col., 2001).

4.3. Efectele expunerii la E2 asupra caracterelor sexuale secundare

Multe specii de pesti au caractere sexuale secundare care se dezvolta sub influenta steroizilor sexuali (Jalabert si col., 2000) Unele din aceste caracteristici morfologice sunt specific masculine si includ cresterea tuberculilor (ce apare la multi pesti ciprinizi), pernitei de grasime (la masculul matur de plevusca cu capul gras P.promelas) si o aripioara anala modificata (gonopodiu la pestele mosquito Gambusia Holbrooki si guppy , Poecilia reticulate). Expunerea pestelui la (xeno)estrogeni poate conduce la disturbarea (feminizarea) acestor caractere sexuale secundare, cum s-a aratat la masculul adult de plevusca cu capul gras (Miles-Richardson si col., 1999; Harries si col., 2000), pestele mosquito (Dreze si col., 2000) si guppy (Toft si Baatrup, 2001). La medaka (O.latipes), infatisarea papilei uro-genitale este o caracteristica sexuala specifica femelei care este sub controlul steroizilor din ovar (probabil estrogeni) (Yamamoto si Suzuki, 1955). Intr-un studiu pilot, care a stabilit ca expunerea pestelui zebra la concentratii ridicate de estrogeni exogeni altereaza dezvoltarea UGP la masculul de peste zebra, am folosit aceasta trasatura sexuala externa ca un biomarker pentru efectele lui E2 din studiile noastre. La pestele expus la concentratii relevante mediului de E2 la diferite stadii de viata, doar expunerile adultului au rezultat in efecte clar vizibile, in care masculul de peste zebra a dezvoltat un UGP proeminent, cu toate ca, chiar si la doza de expunere E2 cea mai ridicata (100ng/l), UGP nu a fost bine dezvoltat ca cel de la femela matura. Dat fiind ca aceasta dezvoltare a UGP depinde de estrogen (cu toate ca poate sa depinda si de alti factori), efectele expunerilor pe termen scurt la estrogen exogen sunt probabil sa fie tranzitorii. Totusi pentru lucrarea expunerii adultului, UGP ar parea sa ofere puncte finale folositoare pentru indicarea expunerii la estrogeni (si poate anti-estrogeni la femele, unde o inhibare a dezvoltarii UPG se poate produce). Sensibilitatea dezvoltarii UGP pentru folosire in acest scop trebuie sa fie stabilita pentru a cuantifica valoarea potentiala a acestui punct final pentru studiile asupra chimicalelor disruptive endocrine care mimeaza (anti-)estrogenii.

4.4. Efectele expunerii la E2 asupra reproductiei

Multe lucrari au studiat acum efectele estrogenilor steroizi asupra raspunsurilor biomarker la pesti individual, totusi, putine au incercat sa determine semnificatia fiziologica a acestor efecte. Pentru a ne deplasa de la nivelul individual spre efectele potentiale la nivel de populatie, este esentiala intelegerea efectelor asupra produsului reproductiv si acest lucru a fost obiectivul principal al acestor studii.

Expunerea pestelui de la 21 la 42 dpf la 100 ng E2/l a rezultat in 2 saptamani de intarziere a timpului primei depuneri de oua comparativ cu grupele de control si aceasta intarziere este probabil consecinta unei intarzieri in timpul necesar pentru a atinge maturitatea sexuala. O retardare a timpului de pubertate la pestele mosquito a fost documentata dupa expunerea stadiilor de viata timpurii la (xeno)estrogen, 4-nonilfenol (Dreze si col., 2000). In alt studiu pe peste zebra, o proportie crescuta de pesti zebra tineret a fost gasita dupa expunerea la EE2 in timpul stadiilor timpurii de viata (Petersen si col., 2000; Orn si col., 2003), iar frecventa pestilor nediferentiati a crescut odata cu durata expunerii (Petersen si col., 2000) Un studiu ulterior a aratat ca expunerea continua a pestilor zebra timp de 66 zile la 3.4 x 10^-5 µmol/l (aprox. 10 ng/l) a rezultat intr-o intarziere a dezvoltarii oocitului (Fenske si col., 1999). In fine, expunerea pestilor zebra la 10 ng EE2 /l de la 41 la 71 dpf a cauzat o intarziere semnificativa a primei depuneri de oua (Maack si Segner, 2001). Cu claritate, o alterare in timpul maturitatii sexuale poate rezulta in efecte semnificative la populatiile salbatice de pesti care cresc sezonal, intrucat gametii ar putea fi produsi la timpul care nu este optim pentru supravietuirea ulterioara a progeniturii lor.

Analiza efectelor lui E2 asupra reproductiei sunt complicate prin variabilitatea din numarul total de oua depuse de catre indivizii femela, un rezultat ce a fost raportat anterior in studii la plevusca cu cap gras (Kramer si col., 1998; Harries si col., 2000; Lange si col., 2001; Sohoni si col., 2001). Studiul nostru asupra productiei de oua la pestele zebra a fost evaluat (apreciat) folosind un mare numar de pesti (pentru fiecare tratament n .> 30) si a fost inregistrat pentru perioade extinse (6 saptamani pentru experimentul adultilor, 2 luni pentru experimentele stadiului timpuriu de viata), deci, variabilitatea observata in timp este probabil sa reflecte variabilitatea naturala care se intalneste in productia de oua la aceasta specie. Diferentele vazute in productia de oua intre grupele de control pentru diferitele experimente din acest studiu sunt probabil consecinta diferentelor de marime ale pestelui ce depune ouale (peste mai mic pentru experimentul de expunere embrio-larvara a produs mai putine oua).

Alteratiile din productia de oua au depins de timpul de expunere si concentratia de E2 la care pestele a fost expus. A existat o productie de oua crescuta la femelele adulte dupa expunerea la E2 in timpul stadiului embrio-larvar. In expunerile noastre de pesti zebra la E2 in timpul stadiului de viata juvenila, a existat o largire a productiei de oua aparenta la concentratia de expunere cea mai joasa de E2, dar un efect inhibitor la concentratii mai ridicate (25 si 100 ng/l). Orn si col., 2000, au expus pesti zebra la EE2 si au gasit o crestere semnificativa in productia de oua la concentratii de la 0,1 la 10 ng EE2 /l, dar o reducere semnificativa la o concentratie de expunere de 100 ng EE2 /l. Acest tip de U inversat a curbei doza-raspuns a fost in mod similar raportata in unele dintre alte studii ce au evaluat efectele reproductive ale xenoestrogenilor la plevusca cu cap gras; 4NP (Giesy si col., 2000), NPEO (Nichols si col.,2001) si BPA (Sohoni si col., 2001).

Efectele expunerii E2 asupra fecunditatii s-au facut pe frecventa depunerii oualor, mai degraba decat marimea lotului, similar cu ce s-a vazut la plevusca cu cap gras expusa la NPEO (Nichols si col., 2001) si 4NP (Harries si col., 2000) cat si la pestii zebra expusi la o varietate de contaminanti acvatici precum crom, cadmiu si atrazin (Dalverny, 1993). In ce mod se manifesta aceste efecte, nu a fost determinat. Intrucat nu au fost gasite diferente in dezvoltarea oocitelor intre femelele din diferite tratamente pentru fiecare experiment, o posibila cauza pentru reducerea ratei de depunere a oualor poate fi atribuita unei disruptii la comportamentul de imperechiere (Gray si col., 1999b; Bjerselius si col., 2001).

La pestii zebra expusi la E2 ca adulti a existat o inhibare aparenta dependent de doza a productiei de oua. Aceste rezultate sunt sprijinite de alte studii in care pestele adult a fost expus la E2. Shioda si Wakabayashi (2000) au descoperit ca productia de oua a fost redusa la femela de medaka adulta expusa la 0 nM E2. In mod similar expunerea plevustii cu cap gras de crescatorie la E2 a rezultat intr-o reducere de 10 si 50 % in numarul de oua produse la doze de expunere de 6,6 si respectiv 120 ng E2/l (Kramer si col., 1998).

In lucrarea lui Shioda si Wakabayashi (2000) expunerea masculului de medaka la 3 nM E2 (fara expunerea femelelor de crestere) a rezultat ulterior intr-o descrestere a numarului de oua ce a fost depus. Analiza ratei fertilizarii si a incubatiei generatiei F1 din studiul nostru, totusi, nu a pus in evidenta nici un efect semnificativ a lui E2 indiferent de stadiul de viata al expunerii. Rezultatul este intrigant, deoarece multi dintre "masculii" expusi la E2 in timpul stadiilor timpurii de viata au dezvoltat o cavitate retrogonadala asemanatoare femelei. S-a sugerat ca la masculul crap cu gonade cu mai multe ducte disrupte, este improbabil ca spermatozoizii maturi sa fie capabili de a atinge porul uro-genital si astfel sa fie eliberati pentru a fertiliza ouale (Gimeno si col., 1997). La vremea aceea nu stiam implicatia pe care formarea cavitatii retrogonadale la masculi ar putea sa o aiba asupra eliberarii spermatozoizilor maturi si nu am investigat cati dintre pestii adulti cu ducturi disrupte ar putea sa elibereze sperma si deci, cati masculi au contribuit la produsul reproductiv din tancuri. Este cu claritate important necesarul de studii asupra reproductiei care sa foloseasca sisteme de depunere a oualor grupate (ca pentru pestele zebra) pentru a intelege mai bine contributia relativa a diferitilor masculi din tancuri la generatia F1.

4.5. Rezumatul efectelor lui E2 si concluzii

Acest studiu a fost facut pentru a evalua efectele expunerii la E2 din timpul variatelor stadii de viata asupra inducerii vitelogenine, histologiei gonadale si produsului reprodductiv la pestele zebra (D.rerio) Aceasta lucrare demonstreaza ca expunerea la E2 a rezultat in inducerea vitelogenului indiferent de stadiul de viata expus, dar aceste efecte au fost reversibile dupa o perioada de depurare. Expunerea la 100 ng E2/l de la fertilizare pana la 21 dpf a cauzat de asemenea o disruptie a diferentierii sexuale dupa cum a fost evaluat prin raportul diferit al sexului la populatia adulta urmatoare. Expunerea din timpul stadiilor timpurii de viata a rezultat de asemenea intr-un tipar alterat al productiei de oua la adultii urmatori. Expunerea pestelui zebra ca adult la E2 a condus la o modificare a caracterelor sexuale secundare la 100 ng E2/l si o descrestere a productiei de oua. Luate impreuna, aceste date arata ca natura si nivelul efectelor lui E2 sunt dependente de timpul de expunere cu unele efecte ca fiind permanente (diferentierea gonadelor) si altele reversibile (inducerea Vtg). Acest studiu a demonstrat ca stadiile timpurii de viata ale pestelui zebra sunt sensibile la concentratii joase de E2 conducand la feminizarea partiala a populatiei si la inductia vitelogeninului, in principal trebuind luate in considerare acele efecte asupra stadiilor de dezvoltare vulnerabile. Datele prezentate ridica preocupari ulterioare despre efectele estrogenilor steroizi din mediu asupra sanatatii reproductive a pestilor.

Multumiri

Referinte

** ** **********