CONDERATII GENERALE ASUPRA MICROBIOTEI ALIMENTELOR

CONDERATII GENERALE ASUPRA MICROBIOTEI ALIMENTELOR

In functie de natura microorganismelor , microbiota alimentelor cuprinde doua component:

Microbiota specifica

Microbiota nespecifica

MICROBIOTA SPECIFICA (MICROORGANISME UTILE)- este alcatuita din culturi starter introduse dirijat in produs, in scopul obtinerii unor transformari dorite  sau microorganismele autohtone (indigene) si microbiota care se formeaza in etape tehnologice determinate (Exemplu : murarea legumelor, fermentarea musturilor), care au o influenta pozitiva asupra calitatii si stabilitatii conservabilitatii produselor).

Aceste microorganisme nu sunt considerate contaminante, insa in anumite conditii (timp, conditii fizico-chimice, incarcatura microbiana) pot sa produca defecte senzoriale.

Culturi starter - obtinere si comercializare

Cresterea continua a productiei mondiale de alimente, in paralel cu diversificarea sortimentala, a impus perfectionarea tehnologiilor de fabricatie, atat pentru imbunatatirea calitatilor senzoriale si nutritive ale produselor finite, precum si pentru cresterea stabilitatii microbiologice la pastrare. In acest sens, utilizarea culturilor starter selectionate, a caror metabolism poate fi coordonat prin dimensiunea inoculului si reglarea conditiilor fizico-chimice de activitate, reprezinta garantia unor procese reproductibile, pentru obtinerea de produse cu proprietati care sa satisfaca cerintele de calitate si preferintele consumatorilor.

Desi multa vreme omul a beneficiat involuntar de activitatea microorganismelor pentru conservarea si diversificarea alimentelor, prima cultura starter de bacterii lactice a fost utilizata in conditii controlate abia in urma cu 100 de ani, iar aplicarea culturilor starter comerciale in biotehnologii alimentare a inceput anul 1950 (Lucke et al., 1990).

Prin cultura starter (inocul) se intelege cultura pura, in stare activa, utilizata sub forma de monocultura sau culturi multiple pentru declansarea si desfasurarea in conditii controlate a proceselor fermentative. Proprietatile biotehnologice ale culturii starter, dimensiunea si calitatea inoculului, precum si conditiile fizico-chimice de cultivare sunt primordiale pentru reusita procesului biotehnologic.

Ca urmare a progreselor inregistrate in studiul si utilizarea microorganismelor la nivel industrial, cercetarile au vizat permanent obtinerea de culturi starter performante, cu proprietati imbunatatite adecvate scopului pentru care acestea au fost create. In cazul culturilor starter utilizate in biotehnologii alimentare, in paralel cu imbunatatirea proprietatilor biotehnologice, s-a urmarit identificarea microorganismelor capabile sa actioneze in medii naturale, in culturi multiple cu microbiota specifica a alimentului.

O strategie completa de obtinere a culturilor starter performante cuprinde:

a)   dezvoltarea si aplicarea unor proceduri adecvate de selectie in vitro;

b)   optimizarea producerii si cultivarii pe scara larga a celor mai adecvate culturi pentru procesele biotehnologice industriale;

c)   definirea proprietatilor biotehnologice ale culturilor selectionate; 

d)   investigarea conditiilor fermentative:

evidentierea efectului calitativ si cantitativ al substratului asupra activitatii culturii starter;

evaluarea schimbarilor produse in sistemul fermentativ pe parcursul derularii fermentatiei: modificarea pH-ului, temperaturii, indicelui de activitate al apei, a concentratiei de oxigen dizolvat, formarea de gaze, etc;

studiul evolutiei populatiei de celule in timpul procesului fermentativ;

identificarea produselor metabolismului primar si secundar specifice culturii starter;

investigarea profilelor de aroma.

Ca urmare a cerintelor tot mai drastice impuse de cresterea si diversificarea productiei industriale, in paralel cu preferintele consumatorilor, care impun calitatea produselor, strategiile de selectie a culturilor starter au urmarit permanent imbunatatirea performantelor biotehnologice, vizandu-se in principal urmatoarele proprietati:

capacitatea de autoprotectie fata de contaminantii de natura microbiologica si potentialul de a actiona in conditii naturale in asociatie cu microbiota specifica a substratului;

stabilitatea metabolica si genetica;

capacitatea de a realiza procese rapide si reproductibile;

rezistenta la actiunea unor factori inhibitori;

sa fie lipsite de patogenitate;

sa nu induca formarea de compusi toxici prin transformarile pe care le catalizeaza;

sa fie usor de manipulat, transportat si depozitat.

Comercializarea si utilizarea culturilor starter

In mod frecvent, culturile starter sunt utilizate dupa reactivare (prin cultivare intr-un bioreactor de capacitati reduse) sau prin inoculare directa in mediul fermentativ industrial. Cea de a doua varianta, culturile tip DVS sau DVC (dupa denumirea in limba engleza - Direct to Vat Cultures) a devenit disponibila dupa anii '70, dar a inceput sa fie aplicata abia din anii '80. Aceste culturi au fost concepute atat pentru simplificarea procesul de productie, dar mai ales pentru asigurarea unor procese reproductibile, usor controlabile si pentru obtinerea de produse finite cu calitati standardizate.

Culturi repicate periodic (zilnic)

Acestea se obtin plecand de la o cultura stoc, in stare lichida sau congelata, achizitionata la intervale de doua saptamani sau un an, in functie de proprietatile si stabilitatea culturii. Pentru obtinerea culturii de productie se aplica cultivari intermediare, cu mentinerea calitatii culturii. Acest sistem este recomandat pentru fabrici cu capacitati de productie reduse.

Culturi congelate

Congelarea elimina necesitatea realizarii repicarilor zilnice de catre utilizator. Aceste culturi se obtin prin inocularea celulelor active in lapte praf degresat reconstituit (mediu protector) si congelare. Pe tot parcursul transportului si conservarii, culturile sunt mentinute, in stare congelata, in cutii termoizolante. Din culturile stoc, care constituie inocul standardizat, cultura de productie se obtine prin decongelarea rapida a celulelor, inocularea lor intr-un mediu de cultura favorabil si termostatare 12 ore.

Culturi concentrate congelate

Sunt obtinute din suspensii celulare concentrate, mentinute intr-un mediu protector si congelate in cutii de aluminiu cu capacitate de 70-120 ml, care sunt apoi plasate in lazi termoizolante, ce contin gheata carbonica, pentru mentinerea constanta a temperaturii la - 70°C. In fabrica, cutiile trebuie pastrate in spatii frigorifice, la temperaturi de maximum - 50°C. Viabilitatea culturilor va depinde de conditiile de pastrare. Termenul de valabilitate este in general de 3 luni, la - 50°C.

Culturile congelate tip DVC sunt produse in acord cu cerintele clientilor si reprezinta inocul standardizat pentru utilizare directa in mediul de productie, fara pasaje intermediare. De obicei, sunt comercializate in cutii de aluminiu (360 ml), sau sub forma granulata, ambalate in plicuri din folie de aluminiu sau in pungi de polietilena (500 g).

Culturi concentrate liofilizate

Dupa concentrare si liofilizare, culturile sunt ambalate in plicuri din materiale polimerice in cantitati suficiente pentru obtinerea culturii starter. Aceste tipuri de culturi sunt avantajate de conditiile facile de depozitare si transport, ne mai fiind necesara asigurarea lantului frigorific.

Culturile DVC liofilizate sunt comercializate in ambalaje confectionate din folie de aluminiu si sunt pastrate in conditii de refrigerare (0.4°C). Fiecare ambalaj individual reprezinta un inocul standardizat pentru procesarea a 100 kg materie prima.

In functie de necesitati si conditiile tehnologice, producatorii vor opta pentru sistemele de culturi starter cele mai convenabile, atat din punct de vedere al utilizarii in productie pe principii de eficienta economica, cat si al conservarii proprietatilor biotehnologice.

In tabelul 1 se prezinta un studiu de caz al principalelor caracteristici tehnico-economice de care trebuie sa se tina seama la alegerea culturilor starter comerciale si a modalitatilor de utilizare a acestora in productia industriala (Wigley, 1999).

Tabelul 1. Caracteristici tehnico-economice cu implicatii  in alegerea si utilizare culturilor starter

Importanta pe care implica obtinerea si utilizarea culturilor starter performante a condus la orientarea producerii acestora de catre companii multinationale specializate, care isi orienteaza permanent cercetarile si productia in acord cu cerintele producatorilor de alimente (tabelul 2).

Ideal ar fi ca producatorul de branzeturi sa utilizeze permanent aceleasi culturi starter pentru a elimina variatiile de ordin tehnologic sau calitativ. In practica insa, avand in vedere sensibilitatea culturilor fata de atacul fagilor, se procedeaza la rotatia culturilor. Din aceste considerente, producatorii de culturi starter acorda o atentie deosebita caracterizarii culturilor starter in vederea obtinerii de tulpini performante, rezistente, care sa poata fi utilizate permanent, fara rotatie.

Tabelul 2. Companii internationale care produc si comercializeaza culturi starter pentru industria laptelui

Desi calitatea culturilor starter de productie este monitorizata permanent, astfel incat culturile sensibile la fagi sa fie inlocuite, unii producatori prefera totusi rotatia culturilor, utilizand culturi alcatuite din tulpini diferite pentru fiecare sarja, sau dupa trei zile de utilizare.

Prepararea si controlul calitatii culturilor starter de productie (bacterii)

Producatorii de culturi starter garanteaza comercializarea culturilor pure, a caror stabilitate metabolica si genetica poate fi mentinuta indefinit. In productie insa principalele cauze care pot conduce la degenerarea sau contaminarea culturilor deriva din nerespectarea conditiilor biotehnologice si de igiena.

Metodele de obtinere a culturilor starter de productie prevad multiplicarea in trepte a celulelor pana la nivele care sa asigure concentratia necesara demararii fermentatiei industriale. Modalitatile de obtinere a inoculului au evoluat in timp in paralel cu modernizarea tehnologiilor de fabricatie, incat fiecare producator poate sa adopte acest sens strategiile cele mai adecvate in acord cu conditiilor de fabricatie.

Exceptand erorile de cultivare, precum termostatarea la temperaturi suboptimale, infectiile fagice reprezinta cauza majora ce afecteaza calitatea inoculului de productie. Daca gradul initial de contaminare al culturilor este redus, regresia inoculului de productie este evidenta abia dupa un numar de cicluri de dezvoltare. In general, ciclul litic variaza intre 10 si 140 minute si este dependent de conditiile fizico-chimice ale mediului (temperatura, pH, compozitia mediului).

Daca obtinerea unor culturi pure din punct de vedere al contaminarii cu fagi este practic imposibila, infectiile fagice pot fi limitate prin adoptarea unor practici de lucru adecvate, care se refera la:

selectia de tulpini fago-rezistente;

alternanta (rotatia) tulpinilor din componenta culturii starter;

adoptarea unor practici de lucru adecvate pentru obtinerea inoculului de productie.

Multa vreme s-a crezut ca fagii au specificitate pentru tulpina parazitata neputand supravietui fara aceasta. In acest sens, a fost adoptata rotatia culturilor ca o alternativa pentru inactivarea virusurilor, prin schimbarea culturii in fiecare zi a saptamanii, sau chiar pentru fiecare sarja. Aceasta metoda este destul de costisitoare datorita numarului redus de tulpini comerciale existente pe piata.

Practica a demonstrat insa ca fagii pot supravietui mult timp fara prezenta unei gazde, iar cercetarile au confirmat ca acelasi bacteriofag poate parazita mai multe tulpini ale unei specii sau gen. In aceste conditii, utilizarea culturilor multiple reduce riscul afectarii totale a culturii starter. In acest sens, producatorii de culturi starter recomanda scurtarea perioadei de rotatie si utilizarea a doua culturi diferite in zile alternative.

Marea majoritate a furnizorilor de culturi starter ofera asistenta tehnica pentru identificarea tulpinilor corespunzatoare pentru a fi utilizate in fiecare unitate de productie si pentru monitorizarea calitatii acestora. ey, 1999).

Particularitati privind obtinerea culturilor starter fungice

Culturile starter de mucegai sunt comercializate sub forma de suspensii concentrate de sporii, in stare congelata sau liofilizata, in general de aceleasi companii care produc si livreaza culturile starter de bacterii.

Pentru obtinerea culturilor de productie se procedeaza la reactivarea culturilor stoc si multiplicarea acestora pentru a obtine volume mari de suspensii de spori. Tehnicile de cultivare prevad multiplicarea mucegaiurilor in culturi de suprafata pe mediu lichid, sau in sistem SSF (din limba engleza, Solid State Fermentation). Alegerea mediului de cultivare, care trebuie sa induca sporularea intensa a mucegaiului, se face pe considerente tehnico-economice (capacitatea de productie, costul) (Blank,1999).

Culturile de suprafata pe mediu lichid sunt realizate in vase Roux, sau in fermentatoare adecvate, cu controlul conditiilor fermentative (pH, temperatura, oxigen dizolvat etc.). Dupa cultivare, timp de 10-20 de zile, la 20.28°C, sporii se separa de miceliu prin antrenare in apa sterila, in prezenta de Tween 80. Suspensia de spori este apoi concentrata si conservata prin congelare sau liofilizare. Sporii liofilizati se pot comercializa in stare granulata sau sub forma de tablete.

Cultivarea pe mediu solid (in sistem SSF) se realizeaza utilizand ca substrat bucati de paine (cuburi cu latura de aprox. 1cm) umectate cu mediu nutritiv lichid, plasate in vase de cultivare cu orificii largi si sterilizate la 121°C, timp de 1h. In timpul racirii vasele sunt agitate pentru a preveni compactizarea substratului. Dupa inoculare cu suspensie de spori, cultivarea se realizeaza la 20.25°C, timp de 10-20 zile, cu agitare periodica pentru a asigura dezvoltarea uniforma a miceliului. La sfarsitul cultivarii mediul fermentat se usuca menajat, apoi se macina obtinandu-se o pulbere activa, ce poate fi utilizata ca inocul de productie. In alte cazuri, sporii liberi de fragmente hifale sunt separati de mediul fermentat prin antrenare in apa sterila, iar suspensiile obtinute sunt utilizate ca atare, sau sunt concentrate si apoi congelate sau liofilizate.

Cultivarea se poate realiza pe medii cu agar, in placi Petri sau eprubete, iar dupa dezvoltarea coloniilor mature, sporii se antreneaza cu apa sterila, se separa de fragmentele hifale, apoi se concentreaza.

MICROBIOTA NESPECIFICA - MICROORGANISME DE CONTAMINARE - este formata din :

Microorganisme saprofite (organotrofe, saprotrofe) - cu metabolism propriu care prin activitatea lor determina transformarea biochimica substantelor organice din compozitia materiilor prime si a alimentelor, utilizand componentele chimice pentru nutritia lor, generand astfel modificarea caracteristicilor senzoriale si nutritive, precum si inocuitatea produselor. Efectul acestor transformari este alterarea alimentelor asociata cu producerea de toxine (rezultate prin biosinteza sau degradarea unor compusi chimici- amine biogene toxice).

Microorganisme patogene (parazite), nu au metabolism propriu, ele sunt dependente de o celula gazda pe care o paraziteaza generand o stare infectioasa (infectie) care determina imbolnavirea (boala).

MICROORGANISMELE SAPROFITE sunt foarte raspandite in natura si de obicei sunt asociate cu substraturilor ce contin compusi organici pe care pot sa-i degradeze cel mai facil celulele posedand echipamentul enzimatic diferit.

Sunt adaptate sa actioneze in conditii fizico-chimice specifice de mediu. Exemple: bacterii aerobe mezofile - pH=7.0, temperatura de 37C; bacterii aerobe psihrofile- pH=7.0, temperatura t=15-20C

In anumite cazuri sunt implicate in procese biochimice utile pentru calitatea alimentelor. Exemple:

- rol in maturare - trasformarea proteinelor cu producerea de aminoacizi, cu scopul cresterii digestibilitatii si cresterea valorii nutritive:

- rol in cresterea conservabilitatii produselor prin utilizarea de compusi antimicrobieni (bioconservanti)- acid lactic, bacteriocine (produse de bacteriile lactice), toxine killer (produse de drojdii).

ALTERAREA = totalitatea transformarilor biochimice ale compusilor chimici prezenti in materii prime sau alimente finite prin actiunea microorganismelor saprofite, organotrofe.

Prin alterare se produc modificari nedorite, cu implicatii asupra:

calitatii senzoriale (culoare, aroma, miros, gust);

texturii si consistentei;

valorii nutritive;

inocuitatii chimice si biologice;

securitatii alimentare (producerea de toxine)

Pentru ca sa se producta trebuie sa:

Sa existe microorganisme de contaminare care sa posede un echipament enzimatic adecvat, intrun numar suficient de mare, astfel incat transformarile sa fie vizibile, usor detectabile;

Sa existe conditii fizico-chimice optime pentru ca microorganismele de alterare sa desfasoare o activitate metabolica necontrolata.Microorganismele de alterare

Alterarea poate fi contolata prin:

Utilizarea unor materii prime cu calitate microbiologica adecvata

Procesarea in conditii de igiena corespunzatoare normelor de bune practici

Utilizarea principiilor corecte de conservare in limitarea multiplicarii microorganismelor si in inhibarea activitatii lor metabolice (pH, temperatura, limitare oxigen, conservanti etc)

Manipularea si conservarea produselor finite in conditii adecvate

Factorii care influenteaza alterarea sunt:

Factori intrinseci (greu controlabili) : dependenti de aliment- compozitia chimica, indicele de activitate al apei, pH, rH, prezenta unor compusi bioconservanti (cu activitate antimicrobiana).

Factori extrinseci (mai usor controlabili): dependenti de conditiile de procesare si depozitare-temperatura de pastrare, variatia pH-ului, durata de pastrare, principii de conservare (sarare, afumare, uscare tratamentul cu radiatii, ambalarea in atmosfera modificata).

Factori biologici - interrelatiile care se stabilesc intre microorganismele care colonizeaza acelasi substrat.

Alimentele cele mai perisabile:

Au compozitie chimica complexa (exemple: carnea, pestele, produsele lactate, produse vegetale)

Au continut ridicat de apa

Au pH apropiat de neutru

Alterarea microbiana a alimentelor este un proces competitiv intre bacterii, drojdii si mucegaiuri.

Bacteriile au prioritate deoarece se inmultesc rapid

Drojdiile joaca un rol neinsemnat deoarece sunt in numar redus, cresc lent, sunt dependente de substantele rezultate din matabolismul bacteriilor

Mucegaiurile se dezvolta mai lent decat bacteriile, cresc in conditii defavorizante (umiditate scazuta, pH acid, limitare nutrienti)

Produsele de origine animala - contin cantitati mari de proteine si lipide, au pH neutru si pot fi alterate chiar la temperatura scazuta. Agentii de alterare sunt bacteriile, iar procesul principal este putrefactia.

Produsele de origine vegetala - contin o cantitate mare de glucide si putine proteine si pH acid. Agentii de alterare sunt mucegaiurie si drojdiile. Procesele principale sunt putrezirea umeda (inmuierea tesutului), fermentatia alcoolica, mucegairea.

Principalele modalitati tehnologice aplicate pentru stoparea sau prevenirea alterarii sunt urmatoarele:

Pastrarea la temperaturi scazute - determina o serie de transformari reversibile asupra celulelor concretizate prin;

a.      intarzierea cresterii majoritatii microorganismelor la temperaturi de refrigerare (0-4C); astfel incat alterarea continua dar cu o viteza redusa, incat este posibil sa nu se produca prejudicii asupra calitatii alimentelor.

b.     oprirea activitatii microorganismelor- prin congelare (la temperaturi -8.-20C); alterarea se stopeaza, insa prin decongelare transformare au loc cu o viteza mai mare. Enzimele microorganismele raman active la aceasta temperaturi, incat alimentele congelate, care contin o incarcatura microbiana mare, dezvolta in timp un miros neplcaut (mai ales in cazul alimentelor cu continut ridicat de lipide).

Tratament la temperaturi ridicate (> 60C)- determina denaturarea proteinelor prin inactivarea enzimelor celulare, ceea ce conduce la moartea celulelor (transformarile sunt ireversibile).

Tratamentele termice:

- pasteurizarea (tratament termic la temperaturi < 100C) asigura: distrugerea tuturor formelor vegetative ale microorganismelor si a sporilor de drojdii si mucegaiuri; raman activi doar endosporii bacterieni si microorganismele termodurice.

- sterilizarea (tratament termic la temperaturi > 121C)- distrugerea tuturor microorganismelor.

Tratamentele termice:

asigura distrugerea majoritatii microorganismelor patogene;

asigura distrugerea toxinelor sintetizate de bacterii care sunt termolabile;

nu asigura distrugerea micotoxinelor produse de mucegaiuri, care sunt termolabile.

In practica este acceptabila sterilitatea comerciala a produselor deoarece:

poate de multe ori sa asigure distrugerea tuturor microorganismelor capabile de a creste si actiona in unele alimente;

asigura reducerea numarului de microorganisme viabile la valori care nu mai induc risc pentru alterare.

Limitarea continutului de apa libera - apa libera este un factor limitativ pentru microorganisme; bacteriile sunt cele mai hidrofile (aw>0.9), iar cele mai putin pretentiaose sunt mucegaiurile (aw<0,75); la aw<0.6 cresterea nu mai are loc (alimente in stare uscata); la aw~0,7 - alimentele au stablitate de un an; aw~0,75- alimentele au stablitate de cca. 6 luni; la aw>0,78 are loc alterarea rapida.

Alte metode aplicate pentru a preveni sau A stopa alterarea

a.      Conservarea chimica (conservanti naturali si de sinteza)

b.     Limitarea accesului oxigenului_pastrarea in atmosfera modificata; ambalarea in vacuum

c.      Reducerea pH-ului-asigura limitarea dezvoltarii bacteriilor de alterare in produsele de origine animala