Contaminarea culturilor de celule anmale

Practic contaminarea culturilor de celule animale poate sa apara oricand si cu orice tip de agenti contaminanti. Cei mai frecvent intalniti in practica de laborator sunt bacteriile, drojdii, fungi, micoplasme si chiar protozoare daca in laborator se lucreaza si cu asemenea organisme.

De regula, nu se acorda o atentie aparte tipului contaminantului atata vreme cat contaminarea este accidentala, fiind suficienta notarea: a) categoriei (bacterii, drojdii etc.); b) localizarea zonei in care cultura s-a contaminat; c) identitatea operatorului. Daca insa contaminarea se repeta sau devine frecventa atunci identificarea agentului precum si sursa contaminarii trebuiesc stabilite cu o cat mai mare exactitate.

Chiar si la o analiza macroscopica sumara aparitia contaminarii poate fi observata datorita multiplelor modificari aparute in cultura. O cultura de celule animale contaminata prezinta o serie de particularitati caracteristice cum ar fi: 1) modificarea brusca a pH-ului; 2) tulburarea mediului de cultura; 3) aparitia unor formatiuni fibrilare sau floconoase la suprafata sau de profunzime care, de regula se disloca la agitare.

Scaderea brusca a pH-ului este caracteristica majoritatii tipurilor de contaminanti. Totusi, in cazul contaminarii cu drojdii acest fenomen nu apare decat in situatia unei contaminari masive. De asemenea, contaminantii fungici determina o crestere a valorii pH-ului si nu o scadere a acestuia.

Examinarea la microscop a culturilor ofera date suplimentare asupra contaminarii, in functie de magnitudinea la care se realizeaza investigatia. Astfel, la o magnitudine de 100X, in culturile contaminate se observa o serie de aspecte tipice. Unul dintre acestea este aparitia unor spatii granulare in masa celulelor cultivate. De asemenea, poate fi observata miscarea agentilor contaminanti atunci cand infectia a fost indusa de un microorganism dinamic. Drojdiile apar sub forma unor particule ovoide care se multiplica prin inmugurire, iar fungii formeaza micelii filamentoase tipice.

In cazul examinarii la o magnitudine de 400X, contaminantii cu actiune toxica determina modificari morfologice ale celulelor cultivate, fiind posibila identificarea bacteriilor din grupa bacililor si cocilor. In plus, mobilitatea agentului contaminant devine mult mai evidenta, fiind posibila aparitia unor agregate de tip bacterie-celula animala.

Prin examinarea in frotiu, cu obiective de imersie, la o magnitudine de peste 1000X, morfologia si tipul contaminantului poate fi determinat cu o mult mai mare siguranta. In cazul dubiilor se recomanda insamantarea pe agar in vederea unei analize cat mai exacte.

Existenta in cultura a detritusului celular poate induce in eroare un examinator neavizat care poate considera acest element ca fiind formatiune bacteriana. Totusi, trebuie specificat ca bacteriile au o morfologie regulata, bine conturata.

Infectiile cu micoplasme sunt destul de periculoase, deoarece de regula, ele nu pot fi detectate cu ochiul liber sau pe baza modificarilor mediului. De aceea, pentru depistare lor trebuie aplicate tehnici specifice, cel mai frecvent recurgandu-se la: a) colorarea fluorescenta cu Orceina sau Giemsa, metoda prin care la o magnitudine de 500X se pot evidentia sub forma unor filamente extrem de fine; b) autoradiografie; c) testarea microbiologica.

Este de retinut faptul ca majoritatea micoplasmelor, mai ales in linii celulare continue, cresc foarte incet si nu distrug celula gazda. Totusi, pericolul in cazul aparitiei lor in culturi este determinat de actiunea lor asupra substantelor, respectiv metabolitilor intra- si extra-celulari. Concret, micoplasmele actioneaza prin: alterarea metabolismului celular in forme extrem de subtile; preluarea si consumul timidinei; alterarea comportamentului si metabolismului celulelor gazda.

Impotriva acestui tip de contaminare, solutia este verificarea periodica a culturilor. Pentru aceasta se recurge la monitorizarea culturilor, fie prin detectarea unor semne ale contaminarii cronice cu micoplasme, fie prin detectarea micoplasmelor cu ajutorul tehnicii de fluorescenta, sau prin depistarea micoplasmelor cu ajutorul unor metode alternative.

Semnele contaminarii cronice cu micoplasme sunt:

c)       reducerea ratei proliferarii celulare;

b) aglutinarea celulara la culturi in suspensie;

c) supravietuirea unor colonii celulare care au rezistat infectiei acute insa si acestea sunt purtatoare de micoplasme.

Pentru detectarea micoplasmelor, frecvent se apeleaza la tehnica fluorescenta. Principiu de determinare al acestei tehnici se bazeaza pe faptul ca micoplasmele contin AND, iar acesta poate fi pus in evidenta prin colorare cu substante fluorescente, aparand sub forma de microfilamele pe suprafata celulei sau in spatiile intercelulare. Se urmareste fluorescenta altor elemente nu numai a nucleului.

Alte metode pentru depistarea micoplasmelor presupun:

detectarea enzimelor specifice micoplasmelor (arginin deiminaza sau nucleozid fosforilaza)

detectarea toxicitatii

colonii microbiologice - dupa 8 zile au ~200 μg si aspect de "ochi", mai intunecate in centru si mai deschise pe margini

probe specifice (canuciale) pe baza de anticorpi monoclonali

colorarea cu Giemsa sau Orceina acetica

autoradiografa culturii pentru ³H incorporat in timidina

hibridare moleculara (ex. Southern blot analysis)

PCR

Detectarea contaminarii microbiene si

procedee de contracarare

Verificarea contaminarii de fiecare data cand se analizeaza cultura. Analiza micoplasmatica lunara este obligatorie.

Dupa confirmarea contaminarii se procedeaza la evacuarea instrumentarului din hota sau de pe masa de lucru si se dezinfecteaza cu alcool 70% continand dezinfectanti fenolici. Locul dezinfectat ramane ca atare minim 30 minute.

Se noteaza data si natura contaminarii

In cazul in care avem o contaminare noua si nu una repetata se indeparteaza:

a) cultura; b) mediile utilizate pentru hranire; c) mediile stoc.

Daca este o contaminare repetata se verifica solutiile stoc prin incubarea lor in sine sau prin insamantare pe agar.

Daca contaminarea este generala, multispecifica si repetata trebuie verificata procedura de sterilizare. Se urmareste astfel temperatura in autoclave, durata sterilizarii, modul de ambalare, modul de stocare a sticlariei si instrumentarului. Se va proceda la sterilizare completa a tuturor instrumentelor.

Nu incercati sa decontaminati culturile decat in cazul in care sunt culturi de neinlocuit. Decontaminarea culturilor este o operatiune dificila, ce presupune in esenta:

a) spalari repetate (minim de 5 ori) cu mediu de cultura continand o concentratie ridicata de antibiotice

b) impartirea culturii in subculturi si aditia unor antibiotice diferite pentru testarea eficientei

c) eliminarea antibioticelor din subculturi si cultivarea celulelor ca atare pentru a se sesiza reaparitia contaminarii

d) repetarea etapelor b) si c) de 3 ori

e) cultura fara antibiotice o perioada mai indelungata de timp pentru verificarea eficientei eliminarii contaminarii

Pentru decontaminarea celulelor tumorale se face pasajul acestora pe animal viu si ulterior reinceperea culturii pentru ca sistemul imun al animalului va fi cel care va anihila contaminantii.

Cele mai uzuale cai de contaminare a culturilor celulare sunt:

Manipulari, pipetari

Cauze:  Instrumentar, echipament, suprafata de lucru nesterile. Scurgeri de mediu pe marginile recipientelor, dopuri, etc. Manevrarea neatenta a mediului (nu se respecta regula prelingerii pe peretii recipientilor). Praf, celule epiteliale proprii ajunse in cultura. Mentinerea indelungata a placilor sau recipientilor in contact direct cu mediul ambiant (deci fara capac).

Solutii, medii de cultura

Cauze: Reagenti sau medii nesterile. Conditii de stocare improprii. Conditii de sterilizare improprii. Sursa comerciala de reagenti de slaba factura.

Remediere: Filtrarea si autoclavarea reagentilor. Verificarea integritatii filtrelor. Testarea solutiilor dupa sterilizare

Sticlariile, dopuri

Cauze: Depuneri de praf si spori in timpul stocarii. Sterilizare ineficienta.

Instrumentar, pipete

Cauze: Contactul cu suprafete nesterile sau materiale. Contact cu praful, cu suprafete nesterile. Sterilizare ineficienta.

Recipientele pentru cultura, sticle de mediu incepute

Cauze: Praf sau spori din termostat sau frigider. Conditii improprii de stocare sau incubare.

Aerul atmosferic

Cauze: Curenti, turbulenta, aerosoli.

Suprafata de lucru

Cauze: Praf.

Igiena necorespunzatoare a personalului

Cauze: Praf, scame din haine, par. Aerosoli din stranut, tusit.

Hote

Cauze: filtre perforate sau care necesita schimbare

Incubatoare

Cauze: Sterilizare incorecta. Prezenta prafului, sporilor prin deschidere prea frecventa.

Probe biologice

Cauze: Infectarea provine de la sursa sau din timpul dezagregarii.

Animale: cele de laborator sau insecte.

CONTAMINAREA INCRUCISATA (CROSS CONTAMINATION)

Contaminarea incrucisata reprezinta contaminarea unor culturi celulare cu crestere lenta cu alte linii celulare cu crestere rapida. Spre exemplu contaminarea culturilor lente cu celule HeLa.

Acest tip de contaminare poate cauza pierderi mari in cadrul unui laborator, atunci cand apar. De aceea, pentru evitarea contaminarii incucisate trebuie sa se tina seama de o serie de masuri de precautie.

Procurarea liniilor celulare de la o sursa credibila (banca de linii celulare)

Nu se tin deschisi simultan recipientii continand linii celulare diferie

Nu se foloseste aceeasi pipeta in 2 culturi celulare diferite

Pipetele care au atins o cultura nu mai trebuie sa atinga mediul de cultura de aceea in recipienti se pune mediul mai intai si apoi celulele

Trebuie verificate caracteristicile culturii in mod regulat si semnalata orice modificare a morfologiei sau ratei de crestere

Confirmarea cross contaminarii se realizeaza prin analiza cromozomilor.

CONCLUZII

Verificati culturile celulare prin microscopie normala sau cu contrast de faza (fluorescenta pentru micoplasme in preparat fixat)

Caracterizati culturile-liniile celulare nou introduse in laborator

Sa nu se foloseasca medii sau alte solutii de catre mai multi operatori simultan

Verificati frecvent caracteristicile liniei celulare pentru evitrarea crosscontaminarii