IZOLAREA SI IDENTIFICAREA GERMENILOR DIN SPECIA ESCHERICHIA COLI

CAP. 1. SCOP. DOMENIU DE APLICARE

SCOP

Izolarea din materiale patologice a germenilor din specia Escherichia coli   si identificarea lor pe baza caracterelor culturale, microscopice si biochimice.

DOMENIU DE APLICARE

Prezenta procedura se aplica in cadrul Compartimentului de Sanatate Animala pentru diferite categorii de probe de materiale patologice, receptionate si procesate in cadrul sectiei de Bacteriologie a LSVSA Cluj.

CAP.2. DOCUMENTE DE REFERINTA SI CONEXE

DOCUMENTE DE REFERINTA

Bacteriologie speciala veterinara, Rapuntean Gheorghe, Rapuntean Sorin, Editura Tipo Agronomia, Cluj-Napoca 2000

PG-L-01: Controlul documentelor

PG-L-02: Analiza cererilor de oferta, ofertei si contractelor

PG-L-07: Controlul inregistrarilor

PG-L-10: Controlul echipamentelor de incercare, trasabilitatea masurarii

PG-L-11:Managementul probelor:

PG-L14: Localuri, conditii de mediu si protectia personalului

PG-L-15: Executia analizelor si asigurarea calitatii rezultatelor .

PG-L-16: Controlul datelor

DOCUMENTE CONEXE

IL-LBT-01- Instructiune de lucru Termostat MIM- 37⁰C, serie LP 1222725181, nr. inv. 2235

IL-LBT-02 - Instructiune de lucru Autoclav RAYPA AES - 75, seria : 17084,nr. Inv. 2260

IL-LBT-04 - Instructiune de lucru Etuva Veb Mlw Medizinische HS 200, serie 15-191, nr. inv. 3142

IL-LBT-05 - Instructiune de lucru Microscop tip Olympus model CHS, seria 4A0274, nr. inv. 3017

IL-LBT-06- Instructiune de lucru Hota cu flux laminar Optofina, Bucuresti, nr. Inv. 2183

IL-LBT-13- Metode uzuale de colorare a frotiurilor

CAP. 2. DEFINITII SI ABREVIERI

DEFINITII

Escherichia coli este un germen de forma cocobacilara sau bacilara, cu dimensiuni cuprinse intre 1-3/0.4-0.7 mm, nesporulat, ciliat si fimbriat, unele tulpini putand prezenta capsula, ce se gaseste dominant in tubul digestiv, mai ales in intestinul gros al omului si mamiferelor.

ABREVIERI

MC MANUALUL CALITATII;

PG - PROCEDURA GENERALA DE SISTEM;

PO PROCEDURA OPERATIONALA;

PS PROCEDURA SPECIFICA DE INCERCARE ;

IL - INSTRUCTIUNI DE LUCRU ;

SC - SISTEMUL CALITATII ;

AC - ASIGURAREA CALITATII;

HG - HOTARARE GUVERNAMENTALA;

AI AUDITUL INTERN ;

LBT - LABORATOR BACTERIOLOGIE;

BA - BULETIN DE ANALIZE ;

RAC RESPONSABIL ASIGURAREA CALITATII;

EIMI ECHIPAMENTE INCERCARE ;

DC DOCUMENTELE CALITATII;

RTL RESPONSABILUL TEHNIC DE LABORATOR;

CAP. 3. DESCRIEREA ACTIVITATII PROCEDURATE

CONDITII PREALABILE

Modul de analiza, acceptare si inregistrare a cererilor de incercare (analiza) este conform MC si PG-L-02

Receptia, verificarea, circuitul, inscriptionarea si esantionarea probelor de analizat se face conform MC si PG-L-11.

Protectia personalului

Este obligatorie purtarea halatului alb (din bumbac) de protectie si a bonetei.

Deoarece suspensiile obtinute din probele ce urmeaza a fi analizate analizate, culturile si subculturile realizate in diferite etape ale procesului analitic, cat si culturile microbiene martor folosite sunt potential contaminante, manipularea acestora se va face cu maxima precautie.

Pentru a se evita ingerarea materialului potential patogen, pipetele folosite in procesul analitic se vor asigura cu dop de vata. Dupa utilizare, pipetele se vor depune in recipiente din sticla cu solutie dezinfectanta.

Protectia mijloacelor de incercare si/sau masurare

Toata sticlaria care se foloseste in aceasta determinare se pastreaza numai sterilizata, in dulapuri sau sertare speciale, pentru a evita prafuirea, contaminarea sau deteriorarea ambalajului in care au fost sterilizate.

Termostatele pentru incubarea mediilor insamantate se urmaresc zilnic si se inregistreaza valorile temperaturilor in fi;ele de monitoriyare a temperaturii.

Verificarea starii de functionare si confirmare metrologica a mijloacelor de masurare si/sau incercare

Balantele, in perioada de valabilitate a verificarii metrologice/ etalonarii, se verifica periodic conform instructiunilor prevazute in Manualul Calitatii,   conform PG-L-10.

In cazul termostatelor, in perioada de valabilitate a verificarii metrologice, inregistrarea temperaturii se face de doua ori/zi in fisele de monitorizare a temperaturii FG-L-14-11.

Se verifica starea tehnica a sticlariei care se va folosi la determinare.

Nu se vor utiliza mijloace de masurare a caror perioada de valabilitate metrologica este depasita, care nu functioneaza la parametrii corespunzatori sau care nu se incadreaza in clasa de precizie impusa de standardul de lucru.

Lampa bacteriologica-UV se verifica pentru eficienta sterilizarii prin teste de sanitatie de pe suprafetele asupra carora a actionat.

RESURSE NECESARE

ECHIPAMENTE DE INCERCARE SI MIJLOACE DE MASURARE

Termostat la 37^oC tip MIM, seria LP 123836208, nr. inv. 3111- IL-LBT-01

Autoclav RAYPA AES - 75, seria : 17084,nr. Inv. 2260 -IL-LBT

Etuva tip Veb Mlw Medizinische HS 200, serie 15-191, nr. inv. 3142- IL-LBT

Microscop tip Olympus model CHS, nr. 4A0274, seria 4A0274, nr. inv. 3017- IL-LBT-05

Hota cu flux laminar tip Optofina, Bucuresti, nr. Inv. 2183 - IL-LBT

MATERIALE SI STICLARIE DE LABORATOR

Foarfeca;

Bisturiu;

Pensa anatomica;

Anse bacteriologice de unica folosinta cu capacitate de 1 μl;

Spatula;

Bec de gaz;

Stative pentru eprubete;

Tavi de inox;

Lame micorscopice;

Eprubete sterile cu diametre diferite (16/160 mm, 18/180mm, 10/100mm);

Pipete gradate sterile, cu capacitatati diferite (1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml), cu gradatii de 0,1 ml;

Placi Petri sterile, cu diametrul de 90 mm;

Recipienti de sticla cu solutie dezinfectanta pentru pipetele Pasteur;

Anse bacteriologice cu bucla cu diametru de aprox. 3 mm, din nichel-crom si/sau ace de insamantare sterile;

Hartie de filtru;

Manusi chirurgicale.

MEDII DE CULTURA SI REACTIVI

Agar Istrate-Meitert - preparat conform Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Agar MacConkey - preparat conform Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Agar nutritiv - preparat conform Anexa B5 din SR EN ISO 6579/2003 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Bulion nutritiv - preparat conform Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Agar TSI (triple sugar/iron agar) - preparat conform Anexa B6 din SR EN ISO 6579/2003 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Mediul mobilitate-indol-uree (MIU) - preparat conform Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate.

Reactiv Kovacs - preparat conform Anexei B11 din SR EN ISO 6579/2003 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Tulpini de referinta

violet de gentiana, ;

sol. Lugol ;

sol. fuxina diluata1/10 ;

sol. de alcool-acetona ;

sange defibrinat de oaie.

Oleu de cedru.

EXECUTIA ANALIZEI, ACTIVITATII

Pregatirea probelor se realizeaza de catre personalul executant de incercare sub supravegherea responsabilului de incercare.

Pentru determinare se folosesc mijloace de masurare si/sau incercare prevazute la

materiale supuse examinarii

Fecale (de la animale in viata), continut intestinal, exsudate din cavitati (fibrina mai ales la pui si purcei), lapte, organe cu leziuni (cord, pulmon, ficat, splina, rinichi, intestin, os lung, tesut muscular, limfonoduri mezenterice s.a.). Probele sa fie recoltate pe tampoane, in tuburi, serinigi, respectiv pungi din plastic cu respectarea normelor de asepsie si cele privind transportul de laborator.

PREGATIREA PROBEI DE ANALIZAT

Din materialele patologice se fac insamantari abundente in medii uzuale, bulion nutritiv si respectiv agar nutritiv si pe agar cu sange (la probele provenite de la suine).

Mediile insamantate se incubeaza la 37⁰ C peste noapte (24 h).

In medii lichide se constata turbiditate intensa, uneori inel la suprafata, cu formarea treptata a unui depozit abundent, neaderent, usor omogenizabil.

Pe medii solide se formeaza colonii de 1-3 mm, rotunde, lucioase, cu suprafata neteda, semitransparente (tip S). Unele tulpini produc colonii plate, cu margini neregulate, opace (tip R). Exista si forme intermediare intre coloniile "S'" si "R", dupa cum exista si colonii mucoide (tip M).   Pe agar cu sange unele tulpini sunt hemolitice (hemoliza clara); aceasta proprietate o prezinta tulpinile izolate de la porci cu boala edemelor.

examen bacterioscopic

Din cultura in bulion se executa un fortiu ce se coloreaza prin metoda Gram. Prezinta semnificatie orientativa, in directia unei infectii cu germeni Gram negativi, cand la examinare se constata numerosi bacili sau cocobacili Gram negativi cu morfologie caracteristica.

izolarea germenului

Din cultura in bulion de 24 de ore se fac insamantari pe mediul de diferentiere agar MacConkey, strierea facandu-se in asa fel ca sa se obtina culturi izolate. Mediul insamantat se incubeaza la 37⁰ C peste noapte (24 h).

Coloniile caracteristice de Escherichia coli pe agar MacConkey sunt mari de culoare rosie, inconjurate de un halou opac.

identificarea speciei

Se ia cu ansa o colonie izolata de pe agarul MacConkey si se insamanteaza prin striere pe mediul selectiv Istrati-Meitert. Mediul insamantat se incubeaza la 37⁰ C peste noapte (24 h).

Coloniile caracteristice de Escherichia coli pe agar Istrati-Meitert sunt de culoare galbena, de marime mijlocie.

confirmarea biochimica

Pentru stabilirea proprietatilor biochimice se folosesc medii politrope TSI si MIU, urmarindu-se capacitatea fermentativa fata de lactoza, glucoza, manoza, producerea de indol, H2S, precum si utilizarea ureei.

Prezinta semnificatie penstru diagnostic pozitiv: Lactoza +, Indol +, Lizindecarboxilaza +, H2S-, Ureeaza -.

In cazul in care se doreste confirmarea serologica definitiva, tulpina izolata, caracterizata cat mai complet, se trimite spre institutul acreditat de referinta din tara.

CAP. 4. ACTIVITATI FINALE

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Conform rezultatelor interpretarilor se indica prezenta sau absenta speciei Escherichia coli in probele examinate.

CAP. 5. RESPONSABILITATI

Limite de autoritate

Pentru executarea in bune conditii a prezentei proceduri limitele de autoritate sunt:

Responsabilitati

Director Executiv

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura.

Sef de Laborator

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura si coraboreaza datele prezentate in buletinul de analiza.

Sef Birou Sanatatea Animalelor

aproba cererea de analiza si primirea probei pentru incercare,

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura si coraboreaza datele prezentate in buletinul de analiza,

verifica prin sondaj, rezultatele incercarilor

Responsabilul de incercare

supervizeaza executia incercarii;

raspunde de corectitudinea executiei;

elaboreaza opinii si interpretari asupra rezultatelor inscrise in buletinul de analiza, prin compararea cu reglementari si normative in vigoare,

redacteaza buletinele de analiza, cu observatiile si concluziile aferente;

valideaza executia incercarii;

confirma rezultatul prin semnatura.

verifica nutritivitatea si selectivitatea mediilor de cultura;

gestioneaza tulpinile de referinta

Executantii de analiza

inregistreaza proba in registrul de analiza;

completeaza fisele analitice ale probelor si toate inregistrarile calitatii referitoare la incercarea din prezenta procedura specifica

inregistreaza in fisele de temperaturi ale aparatelor valorile citite

executa sub supravegherea specialistilor operatiile de pregatire a probelor;

executa incercarea conform regulilor din procedura specifica;

verifica functionarea mijloacelor de masurare si/sau incercare;

pregatesc si aseptizeaza spatiile si suprafetele de lucru;

conditioneaza si verifica starea sticlariei utilizata in incercare;

tehnoredacteaza buletinul de analiza

comunica responsabilului de incercare orice problema aparuta in timpul operatiilor efectuate;

CAP. 6. INREGISTRARI

Registru unic primire probe diagnostic cod R-L-11-1

Registru de diagnostic Necropsic si Bacteriologic cod R-L-11-55

buletine de analiza FG-L-13-01

fisa de diagnostic bacteriologic FL-LBT-01

fisa de monitorizare a temperaturii FG-L-14-11

fisa pentru evidenta tulpinilor de referinta FL-LBT-54

fisa de evidenta a materialelor sterilizate la etuva FL-LBT-56

fisa de solicitare medii de cultura Fl-LBT-57

fisa preparare si aprovizionare cu solutii FL-LBT-58

fisa pentru evidenta control sterilitate si valoare nutritiva a mediilor de cultura FL-LBT-59

fisa pentru evidenta autoclavarii infectelor FL-LBT-60

fisa interna de gestionare a deseurilor din laboratoare FO-L-08-09

CAP. 7. ANEXE

Fisa de diagnostic bacteriologic FL-LBT-01

Fisa pentru evidenta tulpinilor de referinta FL-LBT-54

Fisa de evidenta a materialelor sterilzate la etuva FL-LBT-56

Fisa de solicitare medii de cultura: FL-LBT-57

Fisa preparare si aprovizionare cu solutii FL-LBT-58

Fisa pentru evidenta control sterilitate si valoare nutritiva a mediilor de cultura FL-LBT-59

ANEXA 1

ANEXA 2

ANEXA 3

ANEXA 4

MEDII DE CULTURA

ANEXA 5

Nr. crt	Data prepararii	CANTITATEA	pH-ul	Valabilitatea	Laboratorul unde se prepara	Semnatura
Directia Sanitara Veterinara si pentru Siguranta Alimentelor Cluj Laborator Sanitar Veterinar de Stat CLUJ Pag:  din

ANEXA 6

ANEXA 7