Substrate cromogene macromoleculare - reactivi moderni pentru enzimologia analitica

SUBSTRATE CROMOGENE MACROMOLECULARE - REACTIVI MODERNI PENTRU ENZIMOLOGIA ANALITICA

1.Introducere

Pentru determinarea activitatii catalitice a enzimelor, se acorda in prezent in enzimologie o atentie tot mai mare metodelor analitice bazate pe folosirea substratelor cromogene. Principiul care sta la baza folosirii acestui gen de substrate consta in faptul ca, in urma actiunii catalitice a enzimei fie se elibereaza in mediul de reactie, din substrate macromoleculare (cuplate in prealabil cu coloranti organici si de regula insolubilizate in acest scop) fragmente solubile colorate si dozabile colorimetric, fie se formeaza in timpul reactiei enzimatice, din substrate initial incolore (de regula solubile si cu greutate moleculara mica, cum ar fi de exemplu p-nitrofenil-fosfatul - fig.1) produsi colorati care, de asemenea, pot fi dozati colorimetric. Intensitatea coloratiei aparute in supernatant este proportionala in ambele cazuri cu activitatea catalitica a enzimei cercetate. Se pot folosi si substrate cromogene, macromoleculare, solubile, dar in acest caz partea ramasa nedegradata de enzima trebuie precipitata la sfarsitul reactiei enzimatice si indepartata apoi din mediul de reactie - ca si in cazul substratelor cromogene, insolubile, ramase nedegradate - prin simpla filtrare, centrifugare sau doar prin decantare, inaintea determinarii absorbtiei supernatantului la o lungime de unda corespunzatoare absorbtiei maxime a colorantului eliberat in mediu.

Metodele de determinare ale activitatii catalitice a enzimelor, bazate pe folosirea substratelor cromogene se caracterizeaza printr-o mare simplitate si rapiditate, prin sensibilitate si reproductibilitate si totodata, printr-un consum redus de reactivi, iar uneori si printr-o inalta specificitate daca nu chiar absoluta.

Materialul prezentat mai jos ofera o cuccinta privire de ansamblu asupra unor preocupari si realizari mai vechi si mai noi din strainatate si din laboratorul de biologie moleculara al Institutului de Stiinte Biologice Bucuresti privind obtinerea de substrate enzimatice, de semisinteza, realizate prin grefarea de coloranti organici, reactivi sau de alta natura pe macromolecule naturale.

Fig. 1. - Exemple de substante cromogene care, in urma hidrolizei enzimatice, genereaza produse colorate din combinatii initial incolore.

Substantele cromogene astfel obtinute s-au dovedit eficiente la dizarea activitatii catalitice a unei serii intregi de hidrolaze de interes medical si biotehnologic.

1.1.Substrate cromogene folosite la determinari cantitative ale activitatilor enzimatice

1.1.1.Scurt istoric

Primul substrat cromogen, molecular, insolubil, semnalat in literatura de specialitate a fost realizat in 1946 de Oakley si colab. Prin simpla absorbtie a unui colorant organic, rosu, de pielea bovina fin pulverizata. Acest preparat, puternic colorat in rosu a fost destinat dozarii activitatii colagenazei, dar si a altor proteaze si elibereaza in supernatant, in urma hidrolizei sale enzimatice, o cantitate de colorant proportionala cu activitatea enzimei studiate si dozabila fotocolorimetric la 520 nm. Preparatul cunoscut sub denumirea de Azocoll este oferit si astazi de firma Calbiochem. Cu trei ani mai tarziu, Tomarelli si colab. Descriu un alt substrat cromogen macromolecular, dar de data aceasta solubil, destinat de asemenea dozarii activitatii enzimelor proteolitice. Produsul colorat in galben-portocaliu este obtinut din albumina bovina (fractiunea a 5-a) si prezinta un complex format din azoderivatul albuminei respective si acidul sulfanilic si este cunoscut sub denumirea comerciala de Azoalbumina (Sigma). La sfarsitul reactiei enzimatice, substratul ramas nehidrolizat este precipitat cu acid tricloracetic si indepartat din mediul de reactie iar supernatantul galben-portocaliu-colorimetrat la 440 nm. Intensitatea culorii este de asemenea proportionala cu activitatea enzimei proteolitice.

Aceiasi autori au realizat, dupa un principiu asemanator, si alt substrat cromogen, tot pentru proteaze, care este cunoscut sub denumirea de Azocazeina si format dintr-un complex alcatuit din azocazeina si sulfanilamida.

Acestei prime generatii de substrate cromogene, macromoleculare ii apartine si seria preparatelor obtinute in 1961 de Nelson si colab., dintre care se remarca, mai ales, substratul cunoscut sub denumirea comerciala de Fibrin-Blue, foarte sensibil la actiunea pepsinei, precum si interesantele complexe proteice, colorate, realizate de Sacher si colab., pentru dozarea activitatii catalitice a elastazei si obtinute prin tratarea elastinei din seafa bovina cu orceina, respectiv cu Rosu de Congo.

Substratele cromogene, macromoleculare, din categoria celor amintite mai sus prezinta, toate, combinatii complexe, formate dintr-o proteina si un colorant, la care fixarea colorantului este realizata prin adsorbtia fizica de molecula proteica, natura legaturii stabilite fiind deseori greu de explicat.

Acest tip de legatura, intre proteina si colorant, confera substratelor cromogene din aceasta categorie unele proprietati neavantajoase scopului urmarit. Astfel, natura legaturii stabilite fiind relativ slaba, pot avea loc terceri ale colorantului de pe molecula substratului pe molecula proteinelor prezente in stare dizolvata in mediul de rectie. Prezenta de saruri in mediu se poate repercuta de asemenea nefavorabil putand duce la o desprindete a colorantului de pe molecula substratului. Anumite valori de pH, in sfarsit pot cauza, si ele, fara contributia enzimei, o desfacere a complexului proteina-colorant, ducand la rezultate eronate.

Urmatorul pas logic care se impunea in dezvoltarea de noi substrate cromogene macromoleculare, insolubile, tinand cont de neajunsurile enumerate mai sus, a fost facut in 1967 de colectivul condus de Rinderknecht si a constat in fixarea colorantului printr-o legatura covalenta, stabila de macromolecule proteice sau de alta natura.

Incepe elaborarea celei de-a doua generatii de substrate cromogene, insolubile. Folosindu-se in acest scop o serie de coloranti organici reactivi de tip Remazol (marca inregistrata de firma Farbwerke Hoechst AG), cum ar fi Albastru Brilliant R (fig.2) sau colorantul reactiv, clortriazinic Cibacron Blue 3G (fig.3), s-au obtinut preparate deosebit de valoroase si apeciate, livrate in prezent de firme cu renume, ca: Sigma, Calbiochem s.a.

Fig.2. - Formula structurala a colorantului organic reactiv Remazol albastru Brilliant R, cunoscut si ca Reactive Blue 19.

Colorantul Remazol Albastru Brilliant R reactioneaza foarte usor cu functiunile hidroxilice, primare si secundare dintr-o molecula polihidroxilica, cu formare de legaturi eterice, stabile (fig.4).

Fig.3. - Formula structurala a colorantului organic reactiv clortriayinic Albastru Cibacron 3G (Sinonime:Reactive Blue 2, Blue A, Procion Blue II+B si altele).

Fig.4. - Reprezentarea schematica a unui fragment din structura conjugatului format din colorantul reactiv Remazol Albastru Brilliant R si amidon. Colorantul s-a fixat covalent de molecula amidonului printr-o legatura eterica realizata cu una din gruparile hidroxilicde secundare libere. Colorantul reactioneaza la fel de usor si cu gruparile hidroxilice primare.

Fig. - Formulele structurale ale unor coloranti reactivi, clortriazinici sau de alta natura, sintetizati in tara (Colorom Codlea, Institutul Politehnic Bucuresti) folositi de autori la obtinerea de substante cromogene. I. Rosu B5A; II. Rosu M3A; III Rosu MB; IV. Violet M3R; V. Aminoantrachinona; VI. Acid bromaminic.

Pe aceeasi directie se inscriu si unele din preocuparile principale ale laboratorului de biologie moleculara al Institutului de Stiinte Biologice Bucuresti. In dorinta de a imbogati paleta substantelor cromogene, macromoleculare, existente si oferite, in parte, de diferite firme de profil si in dorinta de a dispune de astfel de preparate-adeseori greu de procurat, dar atat de utile si eficiente in dozarea activitatii catalitice a enzimelor-acest colectiv a realizat o serie de noi substrate cromogene, viu colorate, stabile in timp si folosite cu succes la dozari cantitative si semicantitative ale activitatii catalitice ale diferitelor enzime de interes medical sau biotehnologic, cum ar fi proteaze, amilaze, celulaze, hemicelulaze, pectinaze s.a. Substratele cromogene au fost realizate prin legare covalentastabila a unor coloranti organici reactivi, indigeni sau facand parte din seria colorantilor Levafix a firmei Bayer (Leverkusen)-de diferite macromolecule insolubile sau insolubilizate in acest scop prin reticulare cu epiclorhidrina sau aldehida formica.

Procedeele de obtinere precum si rezultatele obtinute la testarea lor in practica au format obiectul mai multor inovatii, propuneri de inventii, articole originale si referate de sinteza publicate.

1.1.2.Exemplu tipic de dozare a activitatii unei hidrolaze folosind un substrat cromogen

Metodele bazate pe folosirea substratelor cromogene la dozari de activitati enzimatice se remarca prin simplitate si rapiditate si nu difera mult de la o hidrolaza la alta. Mersul unei determinari cuprinde, in mare, urmatoarele faze:

incubarea substratului cu enzima, un anumit timp, la o anumita temperatura; are loc scindarea substratului cromogen, macromolecular, insolubil cu formare de fragmente colorate, solubile;

indepartarea din mediul de reactie prin filtrare sau cemtrifugare a substratului insolubil, ramas nedigerat (eventual dupa o prealabila precipitare a sa, daca a fost solubil);

colorimetrarea supernatantului colorat, la o lungime de unda care corespunde absorbtiei maxime a colorantului respectiv;

transformarea absorbantelor in unitati internationale uzuale de exprimare a activitatilor catalitice.

In mod concret, prezentam un exemplu tipic de dozare cantitativa a activitatii amilolitice a α-amilazei prin folosirea unuia dintre substratele cromogene, clortriazinice: 75 mg substrat cromogen (rezultat din cuplarea amidonului reticulat cu unul dintre colorantii organici, reactivi, clortriazinici) se introduc in 3 ml apa distilata. Dupa 3 min. de repaus, pentru gonflare, se adauga 1 ml de enzima (de exemplu 0,25-1,00 mg/ml). Se incubeaza amestecul de reactie 10-15 min la 25sC sau 35sC, cu agitare, dupa care se stopeaza reactia cu 2 ml NaOH 0,2 N.

Dupa o scurta centrifugare, filtrare sau chiar simpla decantare, substratul ramas nehidrolizat se depune complet in vasul de reactie, se determina extinctia prezentata de supernatant la lungimea de unda corespunzatoare absorbtiei maxime a colorantului organic reactiv, respectiv (si anume: 560 nm pentru Rosu B5A, 530 nm pentru Rosu M3A, 540 nm pentru Rosu MB, 550 nm pentru Violet M3R, 625 nm pentru Albastru MV si 420 nm pentru Galben-auriu M2R). In scopul transformarii valorilor de extinctie in unitati enzimatice internationale, s-a dozat, initial, activitatea α-amilazei si printr-o metoda clasica, cum ar fi cea a lui Noelting si Bernfeld sau cea elaborata de Somogyi si Nelson, alcatuindu-se o curba etalon pentru metoda cromogena fata de metodele clasice, reductometrice. Rezultatele obtinute sunt reprezentate grafic in fig.6 si demonstreaza eficienta substratelor cromogene, specifice pentru α-amilaza, realizate pe baza de amidon reticulat. Din aceasta figura rezulta existenta unei liniaritati intre concentratia (activitatea) α-amilazei din proba si extinctiile observate in cazul substratelor cromogene folosite.

Fig.6. Variatia extinctiilor obtinute cu unele din substantele cromogene sintetizate de autori, in functie de concentratia α-amilazei din mediul de reactie. Substratele cromogene au fost realizate prin cuplarea amidonului (insolubilizat in prealabil prin reticulare cu epiclorhidrina) cu urmatorii coloranti organici reactivi, clortriazinici: 1.Albastru MV; 3.Rosu MB; 4.Rosu M3A; Violet M3R; 6.Rosu B5A; 7.Galben-auriu M2R; 2 reprezinta curba obtinuta prin folosirea substratului cromogen Blue Starch continut in tabletele Phadebas (Pharmacia Uppsala).

Din aceasta figura rezulta totodata ca majoritatea substratelor cromogene sintetizate prezinta, fata de α-amilaza, afinitati comparabile cu cea prezentata de Blue Starch (produsul activ din preparatul "Phadebas"). Rezultatele cele mai bune au fost observate la folosirea substratului realizat cu Galben-auriu M2R. Acesta este aproximativ de zece ori mai sensibil decat conjugatul amidonului cu Cibacron Blue.

Interesant de amintit cu aceasta ocazie este si faptul, oglindit de altfel si in figura de mai sus, ca afinitatea enzimei fata de substratul ei cromogen, specific poate varia destul de mult, in functie de colorantul organic reactiv, grefat pe molecula substratului. Mai mult, unii coloranti grefati pe molecula substratului macromolecular pot exercita chiar o actiune de inhibitie. Dupa cum am putut observa, in cazul unor substrate cromogene sintetizate pe baza de colagen, aceasta inhibitie se manifesta selectiv, in functie de natura proteazei studiate. Astfel, in timp ce conjugatul colagenului cu colorantul clortriazinic Rosu M3A este un bun substrat pentru colagenaze, el nu a putut fi atacat nici de tripsina, si nici de α-chimotripsina, inhiband actiunea hidrolitica a acestor enzime. Pe baza acestei observatii surprinzatoare, am mers un pas mai departe si am imaginat folosirea acestui conjugat ca suport afin la izolarea, prin cromatografie de afinitate, a tripsinei si α-chimotripsinei din extraxte brute sau amestecuri de enzime proteolitice, cunoscut fiind faptul ca inhibitorii imobilizati ai enzimelor pot fi folositi, cu succes, ca suporturi afine la izolarea enzimelor corespunzatoare prin cromatografie de afinitate. Si intr-adevar, am putut separa intr-un mod simplu si rapid, folosind drept suport afin conjugatul colagenului cu Rosu M3A, aceste doua enzime dintr-un amestec care continea si colagenaze.

1.1.3.Substrate cromogene pentru dozarea activitatii proteazelor

Tinand seama de numeroasele avantaje prezentate de substratele cromogene, macromoleculare pentru enzimologia analitica, surprinde totusi numarul lor realativ redus, care a fost sintetizat in ultimii 20 ani, adica incepand cu anul 1967, cand Rinderknecht si colab. Au realizat, dupa cum s-a mai aratat, primul substrat cromogen prin legarea covalenta a unui colorant organic, reactiv de un substrat macromolecular, insolubil. Nici in comert nu se ofera o gama prea mare de substrate de acest gen. In comparatie cu alte hidrolaze, proteazele, luate in totalitatea lor, par a avea, in acest sens, un oarecare regim preferential, care se poate explica insa foarte usor, tinand seama de marea varietate a proteazelor existente pentru care a fost conceput acest tip de substrate.

Primele substrate cromogene, macromoleculare, destinate dozarii activitatilor catalitice ale proteazelor au fost, in acelasi timp, si primele substrate cromogene realizate vreodata. Ele sunt oferite si astazi in comert sub denumirile de Azocoll, Azoalbumina si Fibrin-Blue, acesta din urma fiind destinat mai ales proteazelor acide, cum ar fi pepsina. Prin legare covalenta a colorantului organic rectiv Remazol Albastru Brilliant de colagen din piele bovina, fin pulverizata, Rinderknecht si colab. Au creat, pentru proteaze, si primul substrat de tip nou, caracterizat prin legare covalenta a colorantului de molacula substratului si oferit si astazi in comert sub denumirea de Hide Powder-Azure (Calciochem). Gruparile hidroxilice libere din molecula colagenului, fiind aproape integral eterificate cu colorantul folosit, rezulta un substrat cromogen care raspunde deosebit de sensibil la actiunea proteazelor neutre. Tripsina, de pilda, poate fi dozata usor si exact, pana la ordinul nanograme. Datorita naturii heterogene a substratului insolubil, o reactie de ordinul zero poate fi observata insa doar pana la aproximativ 500 ng proteaza/proba. Dar chiar si relatia, nu tocmai liniara, dintre extinctii si concentratii enzimatice mai crescute, poate fi folosita, fara rezerva, la dterminari aproximative ale continutului in enzima proteolitica al unei probe.

Tot pe baza de colagen din piele de bovina, dar intr-o stare purificata si reticulata in prealabil, am reusit si noi sa elaboram cu coloranti organici, clortriazinici, cum ar fi Rosu M3A, Rosu MB, Rosu B5A, Galben-auriu M2R s.a., o serie de substrate cromogene, noi, care permit o dozare simpla si rapida a colagenazei. Substratele realizate de noi su permis dozarea activitatii colagenazei in numai 15 min., in loc de 4, 5 sau chiar 20 ore, dupa metoda clasica. Colagenul folosit de noi fiind partial denaturat, substratele cromogene realizate cu el au putut fi folosite si la dozarea activitatii proteolitice a tripsinei si α-chimotripsinei.

Din seria substratelor cromogene realizate cu Remazol-Albastru-Brilliant se poate aminti si cel preparat de Rinderknecht si colab. Pentru dozarea elastazei, o enzima proteolitica din pancreas de porc care actioneaza asupra alstinei, o proteina prezenta in ligamente. Acest substrat prezinta o serie de avantaje fata de cele obtinute mai inainte, prin adsorbtie fizica de coloranti la molecula substratului si a fost studiat mai aprofundat de Bieth si colab.

Mai poate fi amintit, in aceasta serie de conjugate, si Cazein-Yellow (Calbiochem) care este tot un substrat cromogen pentru proteaze, obtinut insa dupa un principiu complet diferit: nu prin cuplarea cazeinei cu un colorant galben, ci prin simpla nitrare cu acid azotic a moleculei ei.

1.1.4.Substrate cromogene pentru dozarea activitatii celulazelor

Hidroliza macromoleculelor de celuloza pana la unitati de celobioza, dizaharid solubil si reducator, se produce, dupa cum se stie, sub actiunea unui complex enzimatic, cuprinzand mai multe tipuri de celulaze, cu moduri de actiune insuficient cunoscute pana in prezent. S-a convenit ca activitatea complexului celulozolitic sa se clasifice in doua categorii: activitatea C₁ (exoglucanazica), evaluata pe substrat celulozic insolubil si activitatea de tip C_x (endoglucanazic), determinata pe un substrat celulozic, solubil (CM-celuloza). Din motivele unei prezentari mai sistematizate, expunem preocuparile si realizarile obtinute in domeniul substratelor cromogene specifice celulazelor, respectand acesta clasificare.

a)     Celulaze de tip C₁ (exoglucanaze)

Exista numeroase metode de dozare a componentei C₁ a complexului celulazic. O serie dintre acestea se bazeaza pe principiul dozarii zaharurilor reducatoare, formate din celuloza insolubila sub actiunea enzimatica. Aceste metode prezinta insa ca inconvenient principal faptul ca dozeaza totalitatea zaharurilor reducatoare din mediu, adica si zaharurile care nu provin exclusiv prin actiunea hidrolitica a componentei celulozolitice C₁ ci si cele care pot proveni din actiunea β-glucozidazei, enzima relativ frecvent asociata cu celulazele. Metodele gravimetrice si cele turbidimetrice, la randul lor, dau o masura exacta a efectului de solubilizare a celulozei de tip C₁, dar sunt deosebit de laborioase. Metodele bazate pe folosirea substratelor cromogene derivate de la celuloza insolubila inlatura toate aceste serioase inconveniente. In acest scop, s-au elaborat o serie de substrate cromogene prin cuplarea colorantului Remazol-Albastru-Brilliant R cu diferite preparate de celuloza, cum ar fi Solka Floe si Avicel sau hartie de filtru. Preparatul oferit in comert sub denumirea de Cellulose Azure (Carbiochem) a fost obtinut prima data de Rinderknecht si colab. Cu acelasi colorant, folosind insa o celuloza tratata in prealabil cu un acid.

Seria substratelor cromogene, realizate de noi pentru dozarea activitatii celulozolitice C₁ reprezinta conjugate ale celulozei microcristaline, de tip Avicel, ale hartiei de filtru Whatman sau ale bumbacului cu colorantii reactivi, clortriazinice, amintiti mai inainte sau cu unii coloranti reactivi ai firmei Bayer (Laverkusen), din seria Levafix, cum ar fi Goldgelb E-G, Gelb E-2RA, Marinblau E-2BA, Brilliantrot E-6BA si Schalach E-2GA.

Folosite in practica, se constata de regula o directa proportionalitate intre cantitatea colorantului eliberat in supernatant in urma actiunii hidrolitice a celulazei de tip C₁ asupra substratului si concentratia acesteia din mediul de reactie.

b)Celulaze de tip C_x (endoglucanaze)

Ca si in cazul celulazelor de tip C₁, se cunosc o serie de metode de dozare si pentru componenta C_x a complexului celulozolitic, bazate, in principiu, tot pe determinarea zaharurilor reducatoare, formate prin hidroliza enzimatica a CM-celulozei.

Pentru evitarea obtinerii unor rezultate eronate se recomanda, si in acest caz, folosirea de substrate cromogene capabile de a fi hidrolizare numai de componenta celulozolitica C_x. Singurele substrate cromogene de acest tip intalnite in literatura au fost descrise de McLeary si obtinute prin cuplarea colorantilor organici reactivi Remazol Brilliant Blue R si Remazol Brilliant Black R de CM-celuloza. Substratele cromogene, specifice pentru dozarea activitatii celulazelor de tip C_x, realizate de noi au fost sintetizate prin fixarea colorantilor reactivi clortriazinici sau a celor din seria Levafix a firmei Bayer, amintiti deja mai inainte tot de molecula CM-celulozei. Aceste preparate permit determinarea selectiva a activitatilor celulozolitice C_x si in prezenta β-glucozidazei interferente si pot fi folosite cu succes, cum vom vedea ceva mai tarziu, la analize semicantitative, in serie, bazate pe difuziune radiala in geluri si de mare folos pentru selectarea de tulpini de microorganisme inalt producatoare de endoglucanaze.

1.1.Substrate cromogene pentru dozarea activitatii hemicelulazelor

Hemicelulazele reprezinta un grup de hidrolaze, relativ putin studiat pana in prezent, cu toate ca joaca un rol biologic deosebit de important si prezinta in acelasi timp si un mare interes practic nu numai pentru diferite ramuri industriale (alimentara, farmaceutica, textila), dar si pentru agricultura si zootehnie, pentru valorificarea deseurilor menajere s.a. Ele insotesc, de regula, celulazele si dezagrega hemicelulazele-componente constitutive ale membranelor celulare-usurand prin aceasta procesele de amiloliza si proteoliza.

Acest tip de enzime joaca, pe langa celuloze, un rol important si in procesele de desfacere a peretilor celulelor vegetale pentru marirea randamentului de extractie a diferitelor substante biologice valoroase din punct de vedere alimentar, terapeutic sau de alta natura, apoi in grabirea proceselor de fermentatie la unele produse alimentare la prelucrarea furajelor brute in vederea maririi coeficientului de asimilare etc. Hemicelulazele exista sau se formeaza si in semintele diferitelor plante si au rolul sa dezintegreze membranele celulare pentru eliberarea substantelor de rezerva din celule, necesare dezvoltarii embrionului si a plantei tinere.

Substratul natural al hemicelulazelor sunt hemicelulozele care se gasesc in cantitati apreciabile in lemn (17-41%), in stiuleti de porumb, in paie, tarate, nuci si diferite seminte. Hemicelulozele insotesc in peretii celulari celuloza si consolideaza scheletul acesteia. Ele sunt amestecuri de diferite polizaharide cunoscute sub denumirea de xilani, manani, galactani, arabani, arabinoxilani, mananogalactani etc., in care pentozele si hexozele sunt legate prin mai multe tipuri de legaturi (α-; β-; 1,2; 1,3; 1,4; 1,6). In structura lor intra uneori si acizii uronici ai glucozei si galactozei. Hemicelulozele reprezinta totodata si componenta principala dintr-un grup de produse naturale cunoscute sub denumirea de gume.

Dupa natura substratului asupra caruia actioneaza, hemicelulazele au fost clasificate in xilanaze, mananaze, galactanaze, arabinaze etc.

Tinand cont de multitudinea hemicelulazelor existente, este evident ca metodele clasice de determinare a activitatii catalitice a acestor enzime, bazate pe determinarea zaharurilor reducatoare, rezultate din hidroliza enzimatica a hemicelulozelor, sunt nespecifice si cu totul nesatisfacatoare pentru identificare si studii cinetice si de specificitate a unei anumite hemicelulaze, dintr-un preparat enzimatic de origine fungica sau de alta natura.

De mare utilitate in acest scop ar putea fi, si de data aceasta, substratele cromogene. Dar si pentru acest grup de enzime, firmele de profil, din strainatate ofera, pana in prezent, un numar redus, si anume doar doua substrate cromogene macromoleculare, specifice pentru doua tipuri din numarul mare de hemicelulaze existente in natura. Unul dintre acestea poarta denumirea comerciala Betamananochrem, este oferit de Coch-Light Laboratories Ltd. (Anglia) si a fost elaborat de McLeary prin cuplarea cunoscutului colorant Remazol Brilliant Blue R de carbo-D-galacto-D-manan. Acest substrat prezinta specificitate absoluta pentru β-D-mananaza. Cel de-al doilea substrat cromogen, conceput pentru o alta enzima din aceasta grupa de hidrolaze este oferit de firma Sigma sub denumirea comerciala de RBB-Xylan si este specific pentru hemicelulazele de tipul xilanazelor. Preparatul a fost obtinut foarte recent (1985) de Biely si colab. Si reprezinta conjugatul colorantului Remazol Brilliant Blue R cu 4-0-metil-D-glucorono-D-xilan.

In scopul de a imbogati paleta substratelor cromogene pentru identificarea diferitelor hemicelulaze si determinarea activitatilor lor catalitice am elaborat si noi o serie de substrate cromogene originale, rezultate din cuplarea unor coloranti organici reactivi de molecula agarozei. Agaroza, fiind un polizaharid liniar, alcatuit din molecule de galactoza si anhidrogalactoza, legate intr-o succesiune alternativa prin legaturi β-1,4-glicozidice intre ele, substratele cromogene realizate vor fi specifice mai ales pentru hemicelulaze de tipul galactanazelor.

Prin actiunea hemicelulazei de acest tip asupra substratului cromogen insolubil, se elibereaza in supernatant, in functie de activitatea enzimei, cantitati mai mici sau mai mari de fragmente oligo-sau monozaharidice, solubile, colorate si dozabile colorimetric la o lungime de unda care corespunde absorbtiei maxime a colorantului organic cuplat de agaroza.

Colorantii folositi de noi ma marcarea cromogena a polizaharidelui au facut parte din seria colorantilor Levafix al firmei Bayer (Leverkusen), amintiti deja mai inainte. Si de data ceasta, conjugatele rezultate se prezinta sub forma de produsi viu colorati si stabili in timp.

1.1.6.Substrate cromogene pentru dozarea α-amilazei

Dintre enzimele amilolitice cunoscute, α-amilaza ocupa un loc de frunte prin importanta pe care o prezinta atat pentru industria alimentara si farmaceutica, cat si mai ales pentru clinica, unde permite adesea, punerea exacta a diagnosticului in cazuri acute, care nu permit amanarea. De aceea, nu este surprinzator numarul mare de metode de investigare elaborate pentru aceasta enzima de-a lungul mai multor decenii. Aceste metode clasice de determinare a activitatii amilolitice a α-amilazei se bazeaza, in general, dupa cum se stie, pe reducerea vascozitatii unei solutii de amidon, pe reducerea turbiditatii unei suspensii de amidon, pe slabirea intensitatii culorii formate de amidon cu iod si pe cresterea gruparilor reducatoare in mediul de incubare in urma hidrolizei enzimatice, grupari care la randul lor pot fi dozate printr-un numar impresionant de metode analitice.

Din motive lesne de inteles, a fost foarte firesc sa se acorde acestei enzime, si in cadrul elaborarii noilor metode simple si specifice, bazate pe folosirea substratelor cromogene, o atentie deosebita.

Substratele cromogene pentru determinarea α-amilazei se obtin,de regula, printr-o dubla modificare a substratului ei natural-amidonul sau a uneia din componentele acestuia-amiloza si amilopectina. Acestea, sunt, mai intai, insolubilizate prin reticulare cu agenti chimici bifunctionali, iar apoi cuplate cu colorantii organici, reactivi. Derivatii de semisinteza astfel realizati sunt accesibili numai α-amilazei, actiunea exoamilazelor interferente (β-amilaza, glucoamilaza) fiind limitata la puntile inter- si intracatenare formate prin reticulare. In metoda colorimetrica, ce utilizeaza ca substrat amidon reticulat, colorat, activitatea α-amilazei este proportionala cu absorbanta supernatantului in care au trecut fragmentele oligozaharidice, insolubile, colorate, ca rezultat al actiunii hidrolitice a enzimei. In metoda difuziometrica, activitatea α-amilazei se apreciaza-cum vom vedea mai tarziu-pe baza dependentei liniare care exista intre logaritmii activitatilor enzimei si diametrele zonelor de difuziune corespunzatoare.

Substratele cromogene pentru determinarea selectiva a α-amilazei sunt folosite in prezent pe scara larga, indeosebi in laboratoarele clinice, stiuta fiind semnificatia amilazei serice si urinare ca diagnostic in afectiuni pancreatice, abdominale acute, parotidice si carcinom ovarian. Astfel, se folosesc si in tara noastra, de mai multa vreme, preparatul tabletat Phadebas (Pharmacia Diagnostics Upssala, Suedia) care contine ca substrat cromogen, specific pentru α-amilaza, amidon reticulat, cuplat cu colorantul triazinic Cibacron Blue, cunoscut si sub denumirea de Blue Starch si descris pentru prima data de Ceska si colab. Autorii reticuleaza amidonul abia dupa cuplarea sa cu colorantul albastru, folosind ca agent de reticulare un diepoxid.

In comert se ofera si o serie de alte preparate pentru dozarea activitatii α-amilazei, dintre care amintim: Alphachrom (Koch-Light Anglia)-un substrat cu o specificitate absoluta, extrem de sensibil si rezultat din cuplarea CM-amilozei cu Remazol Albastru Brilliant R si Amylopectin Azur (Calbiochem), (Behring Diagnostics) realizat de Hall si colab. Prin cuplarea amilopectinei cu Remazol Albastru Brilliant R. Acest colorant a mai fost cuplat de Rinderknecht si colab. Si de amidon si amiloza din cartofi, realizand substrate cromogene, comercializate de firma Sigma sub denumirea de Starch Azure si Amylose Azure. Substrate cromogene de la amiloza au fost realizate de Klein si colab., iar de la amilopectina de Bapson si colab.

Substratele cromogene realizate de noi largesc gama de produse utilizate pentru determinarea activitatii α-amilazei, uneori mai greu accesibile pentru noi. Am realizat aceste substrate prin legarea covalenta a unor coloranti organici, clortriazinici sau antrachinonici, indigeni, reprezentati in fig.5 sau a unor coloranti ai firmai Bayer, din seria Levafix, de amidon insolubilizat prin reticulare cu epiclorhidrina. Gradul de reticulare a fost astfel ales incat sa permita o buna insolubilizare a substratului, fara insa ca puntile glicerice, formate in cazul reactiei de reticulare, sa impiedice accesul enzimei la legaturile 1,4-α-glucozidice.

Substratele cromogene realizate de noi pe baza de amidon reticulat sunt viu colorate, stabile in timp si specifice, permitand determinarea selectiva si rapida a α-amilazei dintr-un complex amilolitic, deci in prezenta exoamilazelor interferente (β-amilaza, glucoamilaza). Substatele elaborate se pot folosi in doua tipuri de determinari ale activitatii α-amilazei: la determinari colorimetrice, cantitative, de mare sensibilitate si precizie si la determinari semicantitative, bazate pe difuziune radiala in geluri, deosebit de adecvate pentru analize in serie, de pilda la selectarea de tulpini microbiene inalt producatoare de α-amilaza.

1.1.7.Substrate cromogene pentru dozarea pectinazelor

Pectinazele ocupa un loc important in randul enzimelor care actioneaza asupra substantelor pectice. Ele apartin poligalacturonazelor si hidrolizeaza legaturile α-1,4-glicozidice din molecula pectinelor, larg raspandite in regnul vegetal, mai ales in diferite fructe (mere, pere, prune, citrice etc.), dar si in sfecla de zahar, in bulbi si in fibre vegetale. Prin actiunea lor specifica de depolimerizare, pectinazele joaca un rol deosebit mai ales in procesul de coacere a fructelor si in procesul de "topire" a inului si canepii. Pectinazele sunt folosite cu succes si in industria alimentara, la maturarea fructelor si legumelor, precum si in industria bauturilor, pentru limpezirea sucurilor de fructe si legume.

Pentru determinarea activitatii pectinazelor din plante, bacterii sau ciuperci s-au descris si se practica o serie de metode, care, in cele din urma, se reduc la doua categorii: metode de masurare a variatiei viscozitatii-in cazul endoenzimelor si metode bazate pe determinarea cresterii puteriireducatoare a mediului de reactie-in cazul exoenzimelor, adica in cazul pectinazelor, care actioneaza numai asupra resturilor terminate, de acid D-galacturonic, cu eliberarea de galacturonobioza reducatoare. Literatura de specialitate abunda in metode din aceste doua categorii si fiecare laborator de enzimologie, care se ocupa cu pectinaze isi are metodele lui preferate.

Parcurgand literatura din ultimele doua decenii si cataloagele firmelor mari, specializate in elaborarea si distribuirea de reactivi si compusi pentru biochimie analitica si enzimologie, am constatat, cu surprindere, ansenta totala a substantelor cromogene pentru dozarea activitatii catalitice a pectinazelor.

In continuarea unor preocupari ale noastre, pe linia crearii de noi substrate cromogene, macromoleculare pentru hidrolaze de interes medical si biotehnologic, am sintetizat o serie de substrate de acest tip si pentru determinarea simpla si selectiva a pectinazelor. Au fost realizate doua serii de substrate cromogene folosind cei cinci coloranti de tip Levafix ai firmei Bayer amintiti mai inainte, plecand fie de la pectina din citrice si mere (Man Research Laboratories, Inc. New York) ca atare, fie plecand de la o pectina insolubilizata in prealabil prin reticulare cu epiclorhidrina. Conjugatele obtinute se prezinta sub forma de produse viu colorate care au putut fi utilizate cu succes la dozari cantitative (seria de substrate obtinute de la pectina insolubilizata prin reticulare) si semicantitativa prin difuziune radiala in geluri (seria de substrate derivate de la pectina solubila) a unei pectinaze oferite in comert (Ultrazim 40 Swiss Ferment Co. Ltd. CH-4056 Basle).

1.2.Folosirea substratelor cromogene la dozari semicantitative ale activitatilor enzimatice bazate pe difuziune radiala in geluri

1.2.1.Scurt istoric

Metodelor de analiza biochimica, bazate pe difuziune radiala in geluri li se acorda in ultimul timp o atentie crescanda, mai ales datorita posibilitatii folosirii lor la analize in serie, in cadrul trierilor preliminare (screening) de tulpini de microorganisme inalt producatoare de enzime, in analize imunochimice, precum si in enzimologie, pentru identificari sau dozari semicantitative de activitati enzimatice. Dupa cum se stie, aceasta metoda a fost folosita initial exclusiv in analiza imunochimica, pentru identificarea prezentei, chiar si in urme, a antigenelor cu anticorpii lor corespunzatori si invers, prin asanumita reactie de imunoprecipitare.

Substratele cromogene, macromoleculare, solubile sau insolubile, elaborate de noi au putut fi folosite cu succes si in difuzia radiala, pentru identificarea si dozarea semicantitativa a diferitelor hidrolaze. Principalul avantaj de folosire al acestor substrate in metoda difuzimetrica consta, mai ales in aceea ca permit urmarirea directa si la un mare numar de probe, in conditii perfect identice, a difuziei si deci atat detectarea rapida a prezentei respectivelor hidrolaze intr-un mediu de analizat dat, cat si urmarirea in timp a proceselor catalitice ce au loc.

1.2.2.Metoda clasica a dfuziei radiale

Ajustarea metodei difuziei radiale in geluri pentru dozarea activitatilor catalitice ale enzimelor a constituit une din preocuparile interesante ale enzimologilor care au fost incununate cu succes. Principiul acestei metode consta in dizolvarea sau suspendarea substratului specific al enzimei studiate in gelul folosit la difuzia radiala. In godeurile practicate in acest gel, turnat in prealabil pe o placa de sticla, se introduce preparatul enzimatic de analizat. Dupa un anumit timp de difuziune, in cazul folosirii substratelor necolorate, placa cu gel trebuie mai intai developata prin imersarea ei intr-o solutie a unui colorant adecvat substratului folosit sau a produselor de reactie rezultate si spalat apoi timp indelungat si cu cantitati mari de solutie de spalare pentru indepartarea excesului de colorant. Daca se utilizeaza de pilda substrate polizaharidice obisnuite, necolorate in placa de gel, zonele de difuziune pot fi decelate abia dupa o developare prealabila cu iod sau cu albastru de toluidina care stopeaza insa totodata si reactia de hidroliza enzimatica, asa incat placa respectiva nu mai poate fi utilizata in continuare la eventuale studii de cinetica.

1.2.3.Metoda bazata pe folosirea substratelor cromogene

Prin inlocuirea substratelor macromoleculare, necolorate (proteine, polizaharide, acizi nucleici, pectine s.a.) cu derivatii lor colorati la gelul folosit pentru detectarea sau determinarea semicantitativa de hidrolaze se realizeaza o varianta noua a metodei difuziei radiale care prezinta urmatoarele avantaje:

-permite efectuarea concomitenta in conditii perfect identice a unui mare numar de analize pe aceeasi placa de difuzie;

-permite selectarea rapida de tulpini de microorganisme inalt producatoare de enzime, dintr-un numar de specii;

-prezinta simplitate in executie, fiind eliminate colorarile ulterioare, urmate de spalari indelungate necesare la metodele utilizate in prezent;

-ofera posibilitatea pastrarii rezultatelor ca document sub forma de folie rezistenta la rupere.

Prin introducerea substratelor cromogene, solubile sau insolubile de genul celor preparate de noi in gelurile de difuziune, in urma actiunii enzimei aplicate in godeurile gelului se vor elibera in zona de difuziune fragmente solubile, colorate din macromolecula substratului. Acestea duc la formarea unei zone circulare, de difuziune, care se deosebeste net de gelul invecinat. Daca se doreste-ceea ce nu este insa necesar pentru interpretarea datelor-se poate imersa placuta cu gel pentru un timp in apa rece, in vederea eluarii colorantului eliberat, urmata de decolorarea zonei respective. Intrucat intre diametrul zonei de difuziune si logaritmul activitatii (concentratiei) enzimei exista o dependenta liniara pentru estimarile semicantitative se va construi, in prealabil, o curba etalon din datele experimentale obtinute in conditiile aratate mai sus, dar cu o serie de concentratii bine cunoscute ale enzimei studiate. Curba etalon construita este valabila pentru toate analizele ulterioare ale enzimei respective.

Adaugandu-se in amestecul de gel 1,5% alcool polivinilic, probele pot fi pastrate ca document in stare uscata, sub forma de pelicule rezistente la rupere.

1.2.4.Exemplu tipic de aplicare a unui substrat cromogen la determinarea unei hidrolaze prin difuziune radiala

Intrucat metodele difuziometrice, bazate pe folosirea substratelor cromogene, macromoleculare, nu difera practic de la o hidrolaza la alta, prezentam mai jos un exemplu tipic de aplicare a acestei metode de dozarea α-amilazei: la 100 ml solutie agar 1%, incalzita pe baie de apa la 60-70sC se adauga 1g dintr-unul din substratele cromogene in stare fin pulverizata, rezultate din cuplarea amidonului reticulat cu coloranti reactivi, clortriazinici si se agita. Amestecul omogen se toarna apoi pe placi de sticla de 8x8 cm, si anume cate 20 ml pe o placa, astfel incat la racire sa rezulte un strat de gel de aproximativ 3 mm grosime. In godeurile (Φ=3,5 mm) practicate in straturile de gel, se aplica apoi 30 μl solutie de α-amilaza. Se lasa sa se desfasoare difuzia 20 ore in atmosfera umeda, la temperatura camerei. Se citesc apoi diametrele zonelor de difuziune. Se construieste o curba etalon procedandu-se in acelasi mod pentru mai multe concentratii de α-amilaza bine cunoscute, cuprinse, de exemplu, pe domeniul 0,003-1 mg/ml. In fig 7 este prezentata o astfel de curba de etalonare, realizata in cazul folosirii amidonului colorat cu Galben-auriu M2R si Rosu M3A ca substrat cromogen.

Fig.7.- Variatia diametrului zonei de difuziune in functie de logaritmul activitatii α-amilazei din proba examinata folosind drept substrate cromogene-conjugate formate din amidonul reticulat cu colorantii reactivi Rosu MB (-) si Galben-auriu (0-0). Drept martor s-a folosit amidonul reticulat ca atare, necolorat (-).

Se observa o directa proportionalitate intre diametrul zenelor de difuziune si logaritmii avtivitatilor concentratiilor α-amilazei.

In cazul in care se doreste uscarea gelului si pastrarea lui ca proba document, se adauga in solutia de agar, pe langa substrat si 1,5% alcool polivinilic, care duce in final la uscarea gelului sub forma de pelicula rezistenta.

Aceasta metoda a putut fi folosita cu succes si la selectarea repida de tulpini inalt producatoare de celulaze dintr-un numar de peste 50 de tulpini de microorganisme. Mai mult, metodele de screening bazate pe introducerea substratelor cromogene chiar in mediile de cultura prezinta mari avantaje pentru laboratoarele de microbiologie si genetica la selectia de tulpini salbatice sau mutante inalt producatoare de enzime, deoarece pot fi observate direct zonele de hidroliza mai mici sau mai mari in jurul tulpinilor respective, fara a mai fi necesara adaugarea unor reactivi speciali pentru developare asa cum o cereau, de regula, metodele curente.

Din categoria substratelor cromogene, macromoleculare mai pot fi amintite si preparatele Chitin Azur, Keratin Azur precum si conjugatul acidului dezoxiribonucleic cu verde de metil.

Datorita numeroaselor avantaje pe care le prezinta metodele analitice cantitative si semicantitative, bazate pe folosirea substratelor cromogene la dozarea activitatii catalitice ale diferitelor hidrolaze importante pentru diagnostic medical si pentru diferitele ramuri ale industriei alimentare si farmaceutice, ele se bucura de o raspandire tot mai mare in laboratoarele de analize medicale, de biotehnologie si de cercetare fundamentala.

Simplitatea, rapiditatea, selectivitatea, condumul redus de reactivi si alte avantaje ale metodelor analitice bazate pe folosirea substratelor cromogene vor incita, si pe viitor, cercetatorii sa imbogateasca continuu gama substratelor enzimatice de acest gen cu noi preparate mai sensibile, mai specifice si mai accesibile.