METODE CITOLOGICE PENTRU STUDIUL DIVIZIUNII MITOTICE SI A CROMOZOMILOR LA PLANTE

METODE CITOLOGICE PENTRU STUDIUL DIVIZIUNII MITOTICE SI A CROMOZOMILOR LA PLANTE

Metoda de includere in parafina si colorarea cu hematoxilina ferica

Recoltarea materialului vegetal. Pentru studiul diviziunii mitotice si a cromozomillor, folosim bulbi de ceapa sau "catei" de usturoi, care au fost tinuti in apa inainte cu doua zile, intr-un pahar Berzelius de 50cc, respectiv in eprubete cu apa in care se cufunda partea bazala si se mentin la temperatura camerei.

De obicei recoltarea radacinilor se face dupa determinarea ciclului mitotic, care difera de la specie la specie si in functie de temperatura (ceapa 19-20 ore). Se recolteaza numai varfurile radacinii pe o lungime de 5-10 mm, operatie care se poate efectua cu o lama, brici, bisturiu sau foarfeca folosind un suport de pluta sau de cauciuc. Cu toate ca zona meristematica este situata numai pe cativa mm de la varf, se folosesc radacini sectionate mai lung, pentru o manipulare mai usoara a lor.

A. De ce am ales ca material vegetal varful radacinii?

Fixarea materialului, are ca scop omorarea rapida a tesutului si o oarecare intarire a lui, pastrandu-se structura pe care a avut-o in momentul fixarii (impiedica autoliza celulelor). Cele mai utilizate lichide fixatoare sunt : fixatorul Zenker, Carnoy, Navasin si Bouin. Materialul se pastreaza in aceste lichide mai multe ore (in fixatorul Zenker sau Bouin pana la 24 ore, iar in fixatorul Carnoy 1 ora) in eprubete mici, inchise cu dop de vata.

Spalarea este necesara pentru indepartarea urmelor de fixator, care ar impiedica operatiunile urmatoare. Spalarea se face cu apa de robinet in mai multe randuri (de 2-3 ori). Pentru aceasta operatie se acopera gura eprubetei cu tifon, spre a impiedica scurgerea materialului.

Deshidratarea - este necesara pentru a putea include materialul in parafina, care nu este miscibila cu apa, in vederea sectionarii. Pentru aceasta se trece materialul (varfurile de radacina) printr-o serie de flacoane care contin alcool etilic de concentratii crescande: 20°, 35°, 50°, 70°, 96°) si alcool etilic absolut. In fiecare din acestea materialul se tine timp de 30 min - 1 ora, iar in alcool absolut de 3 x 1 ora. Se trece apoi materialul in amestecul alcool absolut-toluen (1:1), apoi in toluen pur, amestec de toluen-parafina (1:1), din care materialul poate fi acum transferat in parafina lichida la 60^oC intr-un termostat, unde se pastreaza aproximativ 1 ora.

De notat ca in alcoolul de 70^oC, materialul se poate conserva timp de cateva luni la temperaturi scazute (-4^oC). De asemenea in loc de toluen se poate utiliza xilen sau cloroform.

Includerea in parafina

Prin mentinerea materialului in parafina lichida, acesta patrunde in  tesuturile materialului vegetal, astfel ca acum el se poate include intr-un bloc de parafina. In acest scop utilizam barele Leuckart, confectionate din sticla sau stiplex, care delimiteaza intre bratele lor, spatii de forma cubica sau paralelipipedica. In aceste spatii se toarna parafina lichida la 60^oC, apoi cu ajutorul unei pense ale carei varfuri se incalzesc mereu la flacara unui bec de gaz, se transfera varfurile de radacini si se orienteaza paralel intre ele, 2-4 astfel de radacini, pentru a usura citirea lor in serie pe lama preparatului. Dupa solidificarea parafinei pe margini si formarea unei pelicule solide la suprafata, se cufunda barele Leuckart si placa de sticla pe care sunt asezate, impreuna cu blocul de parafina, intr-un vas cu apa rece, pentru o solidificare rapida, impiedicand astfel cristalizarea parafinei. Pentru a facilita desprinderea blocului de parafina dupa solidificare, se recomanda ca placa de sticla si barele sa fie obduse inainte, cu un strat subtire de ulei de parafina.

B.     Ce este parafina?

C. De ce se obduc placa de sticla si barele Leuckart ?

De asemenea, este indicat ca placa de sticla pe care sunt dispuse barele Leuckart sa fie incalzita pe o placa sofanta inainte de includere, pentru a facilita orientarea materialului inainte de solidificarea parafinei in contact cu ea. Pe blocul de parafina decupat se poate marca, cu ajutorul unui ac, sensul de orientare a materialului, proba, data, etc.

Sectionarea se   face cu ajutorul microtomului, la care blocul de parafina este mobil si inainteaza intr-un plan vertical, iar briciul sau cutitul este fix. Blocul de parafina se lipeste de portobiect, i se ajusteaza apoi marginile, astfel ca laturile, superioara si inferioara, sa fie paralele. Pentru materialul nostru grosimea sectiunilor se regleaza intre 4-16 μ (de obicei 7 μ). Sectiunile obtinute prin invartirea manivelei, adera unele de altele, prin marginile lor "in serie" si formeaza o panglica continua. Acestea le intindem usor pe o hartie, sau pe o placa de sticla. Fiecare din sectiuni prezinta o fata lucioasa si una mata, aceasta din urma dispusa spre cel care face sectiunea.

D. Ce tip de sectiune se realizeaza in acest caz si de ce?

Lipirea sectiunilor pe lama. Lamele folosite pentru efectuarea preparatelor microscopice trebuie sa fie in prealabil degresate cu alcool, apoi se obduce una din suprafetele lor, in partea centrala cu albumina Mayer (albumina glicerinata) in vederea unei mai bune retineri a benzilor si mai ales materialul sectionat sa nu fie desprins in cursul operatiunilor viitoare. Pentru coagularea albuminei Mayer se trece lama usor pe deasupra unei flacari de la un bec de gaz. Se pune apoi pe fiecare lama 1-2 picaturi de apa peste care se aseaza 2-3 sectiuni din panglica de parafina, orientate cu fata lucioasa catre lama. Se incalzesc apoi usor lamele in flacara unui bec de gaz, pentru intinderea si descretirea sectiunilor (etalare), dar evitand topirea parafinei care ar duce la deteriorarea materialului. Se scurge apoi apa de pe lama prin inclinarea acesteia si lamele astfel pregatite se aseaza intr-un suport, in pozitie verticala, pentru scurgerea completa a apei si evaporarea ei in timp de 24 ore la 40^oC, la termostat.

Albumina Mayer (albumina glicerinata): 50 ml albus de ou se amesteca cu 50 ml glicerina si 1 g salicilat de sodiu (sau timol). Se agita puternic, intr-un borcan cu dop rodat, pana ce apar numeroase bule de aer, apoi se filtreaza prin panza. Se poate conserva bine chiar la temperatura camerei.

E. Care este rolul albuminei Mayer ?

Deparafinarea si hidratarea. Colorantul folosit fiind intr-o solutie apoasa, este necesara o indepartare a parafinei din tesut si rehidratarea acestuia. Aceasta operatiune se efectueaza prin trecerea succesiva a lamelor printr-o serie de pahare Borel cu urmatoarele solutii (in ordine): toluen (de doua ori), toluen: alcool etilic absolut (1:1), alcool de 96°, 70°, 50°, 35°, 20°, apoi apa. Pentru o deparafinare completa este indicat sa se treaca lamele chiar si de 3 ori in pahare diferite cu toluen. In fiecare din acestea, lamele se mentin cate 3-5 minute.

Colorarea se face intr-un pahar ce contine hematoxilina, in care lamele se pastreaza 1-5 min, dupa care se spala cu apa de robinet pentru a favoriza virarea culorii. Pentru o colorare de fond, a citoplasmei si membranei, se introduce apoi lama intr-o solutie de eosina 0,1%, dupa care se spala intr-un pahar cu apa. Hematoxilina coloreaza nucleul si cromozomii in violet iar citoplasma si membrana sunt colorate in roz-rosu de catre eozina.

Colorarea se mai poate efectua si cu o solutie 1% de Violet de Gentiana, un colorant bazic, care impreuna cu iodul formeaza o combinatie ce nu este solubila in alcool. In acest caz lamele se mentin, dupa deparafinare si hidratare, timp de 20-30 min in colorant, apoi se spala in apa si se trec intr-o solutie de IIK 1%, in care se mentin 30 sec, dupa care se deshidrateaza si apoi se trec intr-un amestec de alcool-ulei de garoafe (1:1).

Montarea preparatelor fixe. Dupa colorare este necesara montarea sectiunilor intr-un mediu transparent, care sa permita in acelasi timp si examinarea la microscop dar si conservarea sectiunilor un timp mai indelungat. In acest scop se foloseste balsamul de Canada, o rasina cu indice de refractie apropiat de al sticlei. Deoarece balsamul de Canada nu este miscibil cu apa, este necesara o noua deshidratare, care se face prin trecerea succesiva a lamelor, prin dilutiile de alcool, de data aceasta de la cel de 20s spre alcool absolut, apoi amestecurile alcool-toluen, toluen, dupa care aplicam peste sectiunea colorata o picatura de balsam de Canada, diluat cu toluen si se aplica apoi lamela, evitand formarea bulelor de aer. Preparatul se lasa astfel pe o suprafata plana, la temperatura camerei pentru solidificarea balsamului.

F. Ce puteti spune despre balsamul de Canada ?

Etichetarea preparatului se face dupa solidificarea balsamului. Excesul de balsam se rade cu un bisturiu, apoi se sterge cu toluen, iar la extremitati se lipesc cate doua etichete, pe care se noteaza felul preparatului, felul sectiunii, colorantul, data, etc. Preparatul astfel obtinut se pastreaza in cutii speciale, ferit de lumina si praf.

STUDIUL DIVIZIUNII MITOTICE (CARIOCINEZA) IN MERISTEMUL RADICULAR DE CEAPA (ALLIUM CEPA)

Reproducerea organismului are la baza reproducerea celulara. Perioada ce se deruleaza intre doua diviziuni mitotice alcatuieste ciclul celular (din gr. "kyklos" - cerc). Ciclul celular cuprinde interfaza si diviziunea celulei (fig.1).

Fig. 1. Schema ciclului celular:
G₁ - perioada presintetica; S - perioada sintetica;
G₂ - perioada postsintetica; M - mitoza.

Interfaza (din gr. "inter" - intre si gr. "phasis" - aspect) reprezinta intervalul dintre doua mitoze consecutive. In interfaza, celula se pregateste de diviziune, aceasta insa nu inseamna ca ea se afla in stare de repaus, dimpotriva, este cea mai activa din punct de vedere metabolic in ciclul celular, in care au loc o serie de procese esentiale pentru declansarea diviziunii celulare.

In aceasta etapa a ciclului celular, nucleul reprezinta o structura optic uniforma, cromozomii sunt despiralizati, vizibili fiind doar nucleolii.

Interfaza este formata din trei perioade (subfaze), iar fiecare dintre ele se caracterizeaza printr-o serie de particularitati.

Perioada G₁ (presintetica) (din eng. "G-gop" - gol).

In perioada G₁ nu se produce sinteza ADN-ului (cantitatea de ADN este 2n), dar se sintetizeaza intensiv ARNm, proteinele, enzimele. In afara de aceasta, in celula se acumuleaza ATP, iar numarul de organite celulare creste.

Perioada G₁ constituie 25-50% din timpul interfazei (4-10 ore). La o serie de celule (celulele maligne), plasmodiul mixomicetei (Fusarium) poate lipsi.

Perioada S (sintetica) (din eng. "S-synthesis" - sinteza).

In aceasta perioada are loc reduplicarea ADN-ului, cantitatea lui variind intre 2c si 4c (dupa numarul de cromatide). Paralel cu sinteza ARNr continua sinteza ARNm.

Perioada S ocupa 35-40% (5-8 ore) din interfaza. Ea nu poate lipsi in ciclul celular.

Perioada G₂ (postsintetica).

In aceasta perioada continua sinteza ARN-ului si a proteinelor. Se sintetizeaza in cantitati mari tubulinele, actina si miozina, acestea fiind necesare dividerii celulare.

Perioada G₂ are o durata de 20-35% (3-5 ore) din interfaza. Dupa interfaza celula se divide.

Reproducerea celulelor asigura cresterea, multiplicarea, diferentierea si regenerarea tesuturilor, iar, in cele din urma, continuitatea vietii.

Celulele procariote se reproduc ca rezultat al dividerii simple, fie prin strangulatie (bacteriile gramnegative), lamela mediana (bacteriile grampozitive), sau prin inmugurire (la rizobii).

In prealabil, in celula initiala are loc reduplicarea moleculei de ADN cu participarea nemijlocita a plasmalemei, astfel celulele-fiice primesc aceeasi informatie ereditara localizata in nucleoid.

Celulele eucariote se reproduc pe doua cai:

• prin diviziunea directa (amitoza);
• prin diviziunea indirecta (cariochineza si citochineza).

Diviziunea directa reprezinta o simpla scindare a nucleului si a citoplasmei, iar diviziunea indirecta are loc in urma unor schimbari ale substantei nucleare. Diviziunea indirecta poate fi:

• tipica sau ecvationala (mitoza);
• alotipica sau reductionala (meioza);

Mitoza (din gr. "mitos" - filament) reprezinta diviziunea indirecta a celulelor somatice cu dublarea prealabila si repartizarea uniforma a numarului de cromozomi (materialul ereditar) in celulele-fiice. Mitoza are loc in celulele ce se afla in plina crestere: tesutul embrionar si tesuturile meristematice ale plantelor, organele hematopoetice si tesuturile epidermice ale animalelor etc. Aceasta diviziune asigura inmultirea celulelor, cresterea si diferentierea individuala, continuitatea genotipului.

Mitoza a fost descoperita pentru prima data de W. Fleming in 1879. Diviziunea mitotica are loc in celulele-mama diploide (cu 2n cromozomi). In urma diviziunii mitotice, celula se dubleaza, generand doua celule-fiice identice cu celula-mama (cu 2n cromozomi). Ea ocupa circa 10% din ciclul celular. In functie de specia din care fac parte celulele ce se divid, mitoza poate dura intre cateva minute si cateva ore.

Mitoza este alcatuita din 4 faze succesive:

Profaza - perioada in care cromozomii devin vizibili in urma spiralizarii si condensarii. Fiecare cromozom este dublat longitudinal si se evidentiaza cele doua cromatide rasucite una in jurul celeilalte si unite in regiunea centromerului. Spre sfarsitul profazei, apar centrii mitotici, nucleolii devin mai mici si chiar dispar complet, se degradeaza membrana nucleara.

In concluzie: profaza mitozei se caracterizeaza prin urmatoarele procese:

• dublarea centriolilor (inca in interfaza) si migrarea lor spre polii celulei;
• condensarea cromatinei si evidentierea cromozomilor;
• degradarea nucleolilor;
• degradarea membranei nucleare;
• formarea fusului de diviziune (in celulele vegetale este aranjat intr-un singur plan);
• amestecul carioplasmei si hialoplasmei (fig. 2a).

Profaza ocupa circa 50% (30 min) din mitoza.

Structura unui cromozom eucariot

Metafaza - etapa in care cromozomii sunt delimitati si se aranjeaza in regiunea ecuatorului unde formeaza placa metafazica. Metafaza este stadiul in care se pot stabili, cu deosebita precizie, numarul, forma, marimea cromozomilor specifici fiecarei specii.

Cromozomii se ataseaza de centromer cu fibrele fusului de diviziune (pe fiecare fibra cate un cromozom). Cele doua cromatide ale fiecarui cromozom sunt asezate una langa alta si sunt unite in regiunea centromerului. Cand metafaza se apropie de sfarsit, centromerii incep sa se divida, iar de fiecare jumatate ramane prinsa cate o cromatida.

In metafaza poate sa continuie degradarea membranei nucleare.

Asadar, particularitatile metafazei sunt urmatoarele:

• aranjarea cromozomilor la ecuatorul celulei;
• formarea placii metafazice;
• aranjarea cromozomilor in forma de stea (cu centromerul spre centru);
• fixarea cromozomilor prin intermediul fusului de diviziune (fig. 2b).

Metafaza alcatuieste circa 13% (8 min) din mitoza.

Anafaza consta in clivarea longitudinala a cromozomilor si deplasarea lor (fiecare cromozom este monocromatidic) spre polii opusi ai celulei. Astfel, la polii celulei se formeaza doua seturi de cromozomi cu aceeasi constitutie genetica ca si nucleul celulei-mama.

Anafaza dureaza circa 7% (4 min) din timpul mitozei si se caracterizeaza prin:

• deplasarea cromatidelor fiecarui cromozom spre polii celulei (viteza deplasarii este de 0,2-5,0 µm/min);
• aranjarea cromatidelor in timpul deplasarii in conformitate cu pozitia centromerului (fig. 2c).

Fig 2. Diviziunea mitotica in celula animala:
a) profaza;   b) metafaza;   c) anafaza;   d) telofaza.

Exista opinii diferite referitoare la natura fortelor care mobilizeaza cromozomii monocromatidici (cromatidele) spre polii celulei.

Conform ipotezei biochimice, deplasarea cromozomilor, la desprinderea lor de centromer, are loc datorita polimerizarii in apropierea centriolilor a tubulinei (proteina contractila) fusului de diviziune si depolimerizarii in regiunea centromerilor (chinetocorului).

Conform ipotezei fiziologice, deplasarea cromatidelor este rezultatul contractiilor proteinelor contractile ale microtubulilor (actina si miozina). Ambele ipoteze merita atentie, mai ales ca unele celule (celulele plantelor superioare) nu au centrioli.

Telofaza se caracterizeaza prin formarea la fiecare pol al celulei a cate un nucleu separat, care, dupa despiralizarea cromozomilor, devine optic omogen. Spre sfarsitul telofazei apar nucleolii. Continutul nucleolilor este similar cu cel al celulei-mama.

In concluzie: telofaza se caracterizeaza prin:

• decondensarea cromozomilor;
• formarea unei noi membrane nucleare;
• formarea nucleolilor;
• degradarea fusului de diviziune;
• formarea centrului celular;
• citochineza si formarea a doua celule-fiice identice cu celula-mama (fig.2d).

Citochineza (din gr. "kytos" - cavitate, "kinesis" - miscare) reprezinta dividerea citoplasmei cu tot ansamblul de constituienti citoplasmatici si ai membranei celulare. Organitele celulare se repartizeaza intr-o masura mai mare sau mai mica intre celulele-fiice. Mecanismul citochinezei difera la plante si animale. La plante citochineza are loc prin formarea fragmoplastului (a lamelei mediane) in regiunea ecuatorului, cu extinderea ulterioara spre periferie (se presupune ca fragmoplastul deriva din tubulii fusului de diviziune si decurge cu participarea aparatului Golgi).

In rezultatul mitozei, dintr-o celula somatica (diploida-2n) se formeaza doua celule-fiice, in mare masura asemanatoare intre ele si cu celula-mama (sunt de asemenea diploide-2n).

Semnificatia biologica a mitozei este urmatoarea:

• asigura constanta numarului de cromozomi (a materialului ereditar) in procesul de dividere a celulelor somatice;
• asigura integritatea structurala a tesuturilor in caz de pierdere a celulelor (substituirea eritrocitelor, a celulelor din epiteliul intestinului etc.);
• asigura cresterea si dezvoltarea organismului pluricelular;
• asigura regenerarea tesuturilor si a organelor.

Exercitii aplicative

Pe preparatul fix, obtinut din meristemul radicular de ceapa sau usturoi, se observa la microscop celulele meristematice, cu membrana foarte subtire, de forma patrata sau dreptunghiulara, cu citoplasma abundenta, vacuole numeroase si mici, nucleul voluminos. Unele celule se gasesc in diviziune mitotica si la acestea se vor urmari fazele diviziunii si se vor observa cromozomii.

Raspundeti in scris la urmatoarele intrebari:
1. In ce etapa a mitozei se produc urmatoarele procese?

Cromatina este condensata in cromozomi  __________ ______ ____ ______________

Cromozomii sunt aliniati la centrul celulei  __________ ______ ____ ______________

Anvelopa nucleara se dezorganizeaza  __________ ______ ____ ______________

Din celula mama se formeaza cele doua celule fiice __________ ______ ____ _____________

Cromozomii migreaza la polii celulei  __________ ______ ____ ______________

2. Identificati etapele ciclului celular pentru fiecare imagine (mai multe imagini pot reprezenta aceeasi etapa)