ENZIME

ENZIME

1.Consideratii generale

Enzimele sunt biocatalizatori, reprezentand o clasa speciala de molecule dotate cu activitate catalitica. Sintetizate de catre celula vie, enzimele catalizeaza ansamblul de reactii chimice termodinamic posibile, conditionand desfasurarea, coordonarea si autoreglarea acestor reactii specifice materiei vii. Ca orice catalizator, enzimele sunt substante care modifica cinetica reactiilor pe care le catalizeaza, participa in cantitati extrem de mici la aceste reactii si nu se transforma in cursul desfasurarii acestora.

Enzimele catalizeaza miile de reactii biochimice de sinteza si degradare care constituie metabolismul.

Fiind catalizatori de natura proteica, structura lor chimica de ansamblu reprezinta un edificiu macromolecular complex determinat de nivelurile de organizare structurala a proteinelor. Totodata, enzimele poseda proprietatile generale fizice si chimice ale proteinelor. Enzimele sunt constituite dintr-o parte proteica, numita apoenzima, si una neproteica, numita coenzima sau grupare prostetica.

Fiind o clasa speciala de molecule proteice, se caracterizeaza-sub aspect structural-prin doua trasaturi generale distinctive:

existenta unor particularitati structurale specifice care le confera activitate catalitica; astfel enzimele poseda in structura lor anumite zone, numite, cu o secventa de aminoacizi si o conformatie caracteristice, zone care sunt esentiale pentru manifestarea activitatii catalitice(situs catalitic) sau pentru functia de reglare(situs allosteric)

existenta unei configuratii structurale spatiale a moleculei, configuratie care este responsabila sau contribuie la manifestarea activitatii enzimatice.

Una din cele mai remarcabile proprietati ale enzimelor este capacitatea lor de a actiona preferential numai asupra unor anumite substraturi, proprietate denumita specificitate enzimatica. Intre situsul catalitic al enzimei si substratul de reactie se produce o interactiune specifica ce sta la baza catalizei enzimatice.

Enzimele micsoreaza energia de activare a reactantilor si inlesnesc infaptuirea reactiilor la temperaturi mai joase.

Cinetica reactiilor enzimatice, respectiv viteza de reactie este dependenta de o serie de factori, si anume: concentratia enzimei, concentratia substratului, afinitatea enzimei pentru substrat, temperatura, pH-ul, efectorii enzimatici(activatori si inhibitori  ai enzimelor).

Evidentierea activitatii enzimelor

Comparatie intre activitatea enzimelor si a catalizatorilor chimici

Principiu:

Activitatea catalitica a enzimelor este mult mai puternica decat a catalizatorilor chimici obisnuiti. Astfel, o amilaza hidrolizeaza in cateva minute o solutie diluata de amidon, pe cand in prezenta de acid clorhidric, la temperatura obisnuita, aceasta hidroliza se realizeaza in cateva zile. De asemenea, catalaza, descompune apa oxigenata mult mai intens decat ionii de fier.

Experienta Substante necesare:

amidon (1,1%)

acid clorhidric (2 n)

iod in iodura de potasiu (solutie diluata)

apa oxigenata (3%)

amilaza

catalaza (zeama de cartofi)

clorura ferica (solutie diluata)

Mod de lucru:

a. Se iau in doua eprubete cate 1 - 2 ml solutie de amidon. In prima eprubeta se adauga putina amilaza (saliva), iar in a doua 2 - 3 picaturi acid clorhidric.

Dupa 2-3 minute se incearca in ambele reactia de identificare a amidonului cu o solutie de iod.

In eprubeta cu adaos de amilaza nu apare culoarea albastra, semn ca amidonul a fost hidrolizat, pe cand in eprubeta cu adaos de acid clorhidric se obtine reactia de culoare albastra caracteristica amidonului, deoarece in acest rastimp nu a avut loc inca hidroliza amidonului.

b. Se iau in doua eprubete cate 1 - 2 ml apa oxigenata. Intr-una din eprubete se adauga putina zeama de cartofi, care contine enzima numita catalaza. Se observa o degajare foarte activa de oxigen.

In cealalta eprubeta se adauga la aceeasi cantitate de apa oxigenata cateva picaturi de clorura ferica. Se observa o degajare foarte lenta de oxigen.

Influenta temperaturii asupra activitatii enzimelor

Principiu:

Influenta temperaturii asupra activitatii enzimelor se manifesta in felul urmator: la temperaturi relativ joase, o urcare a temperaturii produce o crestere a vitezei de reactie pana la o anumita temperatura optima, la care viteza este maxima. Peste aceasta temperatura optima, o urcare a temperaturii produce o scadere a vitezei de reactie, iar la temperaturi mai inalte (50-800C) se produce o denaturare a componentei proteice, care are ca urmare o completa inactivare ireversibila a enzimei.

Majoritatea enzimelor au o temperatura optima intre 20 - 400C. La temperaturi sub 00C, activitatea enzimelor scade foarte mult, fara sa fie distruse. Sub forma uscata, enzimele isi pastreaza activitatea si unele pot rezista scurt timp la o temperatura de 1000C.

Experienta:

Se repeta experientele cu enzime de la punctul2.1. a) si b), adaugand insa enzimele respective numai dupa ce au fost fierte si racite. Rezultatele sunt negative, intrucat enzimele nu mai prezinta activitate catalitica.

Influenta pH-ului asupra activitatii enzimelor

Principiu:

Concentratia ionilor de hidrogen are o influenta fundamentala asupra activitatii enzimelor, fiecare enzima dizolvand o activitate maxima la un anumit pH, numit optim. Amiaza din malt are pH-ul optim la 4,8, iar amilaza pancreatica la 6,8.

Experienta Substante necesare:

amidon (solutie 0,25%)

fosfat disodic 0,2 m 71,5 g / l

acid citric 0,1 m 21,002 g / l

amilaza (saliva)

Mod de lucru:

Se ia o serie de 7 eprubete in care se realizeaza solutii tampon la diferite pH-uri, prin amestecarea in anumite proportii a unei solutii de fosfat disodic 0,2 m si cu acid citric 0,1 m conform tabelului de mai jos:

In fiecare eprubeta se adauga 6 ml tampon, apoi cate 4 ml solutie de amidon si apoi cate  1 ml saliva (saliva in prealabil diluata cu un volum egal de apa distilata si filtrata).

Toate eprubetele se tin la 300C. Din timp in timp se urmareste mersul hidrolizei, prin reactia de culoare cu iodul (se scot cateva picaturi de hidrolizat si se introduc in solutie apoasa foarte diluata de iod). Cand aceasta reactie este negativa, inseamna ca hidroliza s-a terminat. Se noteaza durata hidrolizei pentru fiecare eprubeta. Dupa ce in toate eprubetele a avut loc hidroliza, se intocmeste un grafic, notand pe ordonata timpul si pe abscisa pH-ul.

2.4. Otravirea enzimelor

Principiu:

Activitatea enzimatica poate fi inhibata datorita prezentei anumitor substante care poarta numele de inhibitori (efectori) si care pot bloca fie crapaturile active, fie cele activatoare ale enzimelor.

Astfel, catalaza are coenzima o porfirina de fier. Daca se trateaza un extract de catalaza cu hidrogen sulfurat sau acid cianhidric, catalaza isi pierde complet activitatea.

Experienta:

Se repeta experienta 2.1.b), adaugand zeama de cartofi, dupa ce s-a barbotat prin ea hidrogen sulfurat. Nu se mai observa degajare de oxigen.

Extragerea si determinarea calitativa a activitatii zaharazei (invertazei)

Principiu:

Invertaza sau zaharaza este o b-fructozidaza, existenta in drojdia de bere si are pH-ul optim de 4,5. Enzima catalizeaza reactia de hidroliza a zaharozei intr-o molecula de a-glucoza si b-fructoza prin desfacerea legaturii b-glicozidice.

Experienta  Substante necesare:

-toluen

-solutie de amoniac 2,5%

-acid acetic diluat

-fosfat disodic 0.1M

-clorura de calciu 0,2M

-zaharoza 5%

-reactiv Fehling

Mod de lucru:

Extragerea invertazei: Se amesteca intr-un mojar 1 gram de drojdie de bere uscata cu 2ml toluen.Se omogenizeaza timp de 10 min. Continutul se trece intr-un balon Erlenmeyer si se spala mojarul cu 50ml apa distilata. Extractul se aduce la pH 5,8 cu solutia de amoniac(cca.2 picaturi)si se mentine 30 min.la 370C. Dupa racire se aduce la pH 4,8 cu acid acetic diluat( 2 pic.) si se filtreaza. Precipitatul se indeparteaza, iar invertaza din filtrat se absoarbe pe fosfat tricalcic, care se obtine prin tratarea a 10ml solutie clorura de calciu 0.2m cu 10ml fosfat disodic 0,1m.Se lasa in repaus 10 min. si se filtreaza. Precipitatul contine o cantitate apreciabila de invertaza.

Determinarea activitatii: In doua eprubete se masoara cate 4ml solutie de zaharoza 5%. In prima eprubeta se introduce un varf de spatula din precipitatul care contine invertaza. Se agita si se mentin 10 min. la 370C.Se adauga in fiecare eprubeta 1ml reactiv Fehling si se mentin cateva min. pe baia de apa la fierbere.

Observati si interpretati reactiile care au loc.

Oxidarea pirogalolului cu apa oxigenata sub actiunea peroxidazei.

Peroxidaza fiind enzima care catalizeaza oxidarile cu oxigen peroxidic,activeaza si urmatoarea reactie in care donorul de electroni este polifenolul numit pirogalol.

Trecerea culorii in portocaliu-brun indica aparitia configuratiei chinonice cromofore.Hidroxi-o-chinona se transforma in continuare in purpuro-galina.

Experienta.Substante necesare:

Peroxidaza(extract apos de hrean)

Pirogalol (2%)

Apa oxigenata (0,5%)

Intr-o eprubeta se iau 1 ml extract apos de hrean (obtinut din hrean ras,extras in apa),la care se adauga 0,5 ml pirogalol si doua picaturi de apa oxigenata.Imediat apare o culoare portocalie-bruna.

Corelatia dintre temperatura,pH si activitatea enzimelor.

Influenta temperaturii.

Prin ridicarea temperaturii pina la o anumita valoare(de exemplu 50-600C),viteza reactiilor catalizate enzimatic creste,la fel ca si in cazul unei reactii necatalizate enzimatic.Pentru fiecare enzima exista o temperatura caracteristica (optima) la care viteza de reactie atinge valoare maxima.Cresterea temperaturii peste temperatura optima determina micsorarea vitezei de reactie datorita inactivarii si denaturarii termice a enzimei.

Temperatura optima de reactie a enzimelor este influentata si conditionata de structura chimica a enzimei si a substratului,de concentratia lor in mediul de reactie,de pH-ul si timpul in care se urmareste reactia.In general activitatea enzimelor scade la temperaturi de peste 600C.Atit enzimele cit si proteinele,sunt denaturate structurale si functional prin incalzire la temperaturi de aproximativ 60-800C,iar frigul determina numai o micsorare a activitatii enzimelor,fara distrugerea lor.La 00 C sau sub 00 C activitatea enzimelor este mult mai redusa,uneori abia sesizabila,fapt pentru care alimentele pot fi conservate la rece.O data cu cresterea temperaturii,enzimele isi revin la activitatea initiala.

In functie de temperatura si de durata actiunii acesteia,denaturarea enzimelor poate fi reversibila sau ireversibila.In general pentru a fi inactivate,enzimele trebuie incalzite timp de citeva minute la 75-800C,iar in unele cazuri la 1000C.

Pentru a determina influenta temperaturii asupra vitezei reactiilor enzimatice trebuie sa se determine activitatea unei enzime la diferite temperaturi situate intre 0-1000C.Datele obtinute se exprima grafic,trecind pe axa absciselor valorile luate pentru temperatura (0-1000C),iar pe axa ordonatelor activitatea enzimei.

Experienta.Substante necesare:

Carbonat de calciu

Apa oxigenata 0,5 M

Iodura de potasiu 10%

Solutie de acid sulfuric (15 ml H2SO4 concentrat la 100 ml apa distilata)

Molibdat de amoniu 1%

Tiosulfat de sodiu

Obtinerea extractului enzimatic.Materialul biologic (cartofi,mere) care constituie sursa de enzima a carei activitate o determinam (10 g) se mojareaza fin cu 5 g carbonat de calciu.Amestecul obtinut se trece cantitativ intr-un cilindru gradat de 100 ml si se aduce la semn cu apa distilata.Se agita puternic si se lasa in repaus timp de o ora,dupa care se filtreza prin filtru de vata.

Modul de lucru.In patru baloane Erlenmeyer se iau cite 10 ml din extractul obtinut si se adauga 5 ml H2O2 0,5 M,dupa care se mentine timp de 15 minute astfel:

O proba se introduce la frigider (+40C)

O proba se lasa la temperatura camerei

O proba se tine pe baia de apa la 600C

O proba se tine pe baia de apa la 800C

In paralel se efectueaza o proba martor in care extractul enzimatic este inlocuit cu apa distilata.Dupa epuizarea timpului mentionat in toate probele se adauga cite 5 ml solutie de KI 10 % si 2-3 picaturi de molibdat de amoniu 1 %.Continutul baloanelor se agita energic 2-3 minute si probele sunt titrate cu tiosulfat de sodiu 0,1 N in prezenta amidonului ca indicator.

Influenta pH-ului.

Viteza rectiilor enzimatice este influentata in mare masura si de pH-ul mediului in care actioneaza enzimele.Ca si proteinele,enzimele care sunt proteine sau proteide, pot sa sufere modificari de solubilitate,incarcare electrica, presiune osmotica, viscozitate la diferite valori de pH.Modificarile in activitatea enzimelor,sub influenta pH-ului mediului se datoresc in principal modificarii stabilitatii si gradului de ionizare,fie a enzimelor,a substraturilor corespunzatoare sau a complexelor enzima-substrat.Sensibilitatea fata de pH a enzimelor nu se manifesta numai in legatura cu viteza de producere a reactiei pe care o catalizeaza.S-a dovedit ca insasi stabilitatea enzimelor este afectata de aciditatea sau alcalinitatea mediului.O enzima oarecare este stabila si prezinta activitate numai in anumite limite de pH,in cadrul carora se poate stabili un pH optim de activitate.Pentru a stabili influenta pH-ului asupra activitatii unei enzime se masoara viteza reactiei enzimatice utilizinu-se solutii tampon cu valori cunoscute.Activitatea enzimei obtinuta la diferite valori ale pH-ului pe axa absciselor.Se obtine astfel curba caracteristica ce exprima dependenta vitezei reactiei enzimatice de pH-ul mediului.

Experienta.Substante necesare.

Acid clorhidric 1N

Hidroxid de sodiu 1 N

Apa oxigenata 0,5 N

Iodura de potasiu 10%

Solutie de acid sulfuric (15 ml H2SO4 concentrat la 100 ml apa)

Molibdat de amoniu 1%

Tiosulfat de sodiu 0,1 N

Obtinerea extractului.Materia prima ce contine sursa de enzima a carei activitate o determinam (10) se mojareaza fin cu 5 g de carbonat de calciuAmestecul obtinut se trece cantitativ intr-un cilindru gradat de 100 ml si se aduce la semn cu apa distilata.Se agita puternic si se lasa in repaus,timp de o ora,dupa aceea se filtreaza prin filtru de vata.

Modul de lucru.In trei baloane Erlenmeyer se iau cite 5 ml din extractul enzimatic obtinut.In primul balon se adauga 2 ml de apa distilata (pH=7),in al doilea balon 2 ml HCI 1 N (pH=2),iar in cel de al treilea balon 2 ml NaOH 1 N (pH=14).Se efectueaza si o proba martor in care extractul enzimatic este inlocuit cu apa distilata.Continutul baloanelor se agita si in fiecare se adauga cu pipeta cite 5 ml H2O2 0,5 N si se lasa in repaus timp de 15 minute.Se adauga apoi cite 5 ml solutie de acid sulfuric,5 ml iodura de potasiu 10% si 2-3 picaturide molibdat de amoniu 1%.Dupa agitare energica timp de 2-3 minute probele se titreaza cu tiosulfat de sodiu 0,1 N in prezenta amidonului ca indicator.

Calcul.Datele experimentale,exprimate in ml tiosulfat de sodiu se scad din ml tiosulfat de sodiu folosit la titrarea probei martor.Folosind aceste date si pH-ul la care a actionat enzima se traseaza curba care indica influenta pH-ului asupra activitatii enzimei si evidentiaza pH-ul optim de actiune.