Titrarea aminoacizilor (metoda Sorensen). Dozarea azotului prin metoda Kjeldahl

Titrarea aminoacizilor (metoda Sorensen). Dozarea azotului prin metoda Kjeldahl

1. TITRAREA AMINOACIZILOR

a. Consideratii teoretice

Deoarece aminoacizii au un caracter amfoter, gruparea acida nu poate fi titrata cu o baza decat dupa ce gruparea aminica a fost blocata. In metoda Sorensen blocarea se face prin condensare cu aldehida formica:

COOH COOH

R-CH-NH2 + O = CH2 R-CH-N=CH2 + H2O

Aminoacid Ald.formica Baza Schiff

Produsul de condensare manifesta in solutie un caracter net acid.

b. Experienta: Substante necesare

aldehida formica (20% neutralizata in prezenta de fenolftaleina)

hidroxid de sodiu 0,1 N (solutie titrata)

fenolftaleina (1% in alcool)

amoniac (solutie)

acid clorhidric 0,1N

c. Mod de lucru. Intr-un flacon se iau 10 ml solutie de aminoacid, se adauga 10 picaturi de fenolftaleina si se neutralizeaza (cu NaOH 0,1 N, daca solutia este acida sau cu HCl 0,1 N daca solutia este alcalina), pana la aparitia culorii slab-roz. Se adauga apoi 10 ml aldehida formica si se titreaza cu hidroxid de sodiu pana la aparitia culorii slab-roz.

d. Calculul rezultatului:

V . f . T . 100

Aminoacid % = ----- ----- --------

10

unde T = titrul aminoacidului considerat (pentru glicocol

T=0,075 g/ml, pentru alanina T=0,00089g/ml)

V = numarul de ml solutie de NaOH folositi la titrare

F = factorul NaOH

DOZAREA AZOTULUI PRIN METODA KJELDAHL

a. Consideratii teoretice

Substantele azotate din materia vegetala sunt reprezentate in cea mai mare parte de proteine.

Continutul in azot al substantelor proteice din plante variaza intre limite destul de largi (14,7 - 19,5%); conventional se admite o valoare medie de 16%, deci unui gram de azot ii corespund 100/16 = 6,25 g proteina.

Determinarea proteinei se poate reduce astfel la o dozare de azot organic. Prin inmultirea cantitatii de azot organic cu factorul 6,25 se obtine asa-numita "proteina bruta".

Proteina bruta corespunde totalitatii substantelor organice azotate. Ea reprezinta suma de substante proteice si substante azotate neproteice. Substantele azotate neproteice sunt reprezentate prin alcaloizi, unii pigmenti, lipide complexe etc., ele alcatuind circa 3 - 10% din azotul organic.

Determinarea azotului total consta din trei operatii:

Mineralizarea. Substanta organica, uscata, se mineralizeaza cu acid sulfuric concentrat in prezenta de catalizatori (saruri de mercur si de cupru). Carbonul din materia organica este oxidat la acid carbonic, hidrogenul la apa, iar azotul este transformat in amoniac, care formeaza cu acidul sulfuric prezent, sulfat de amoniu. Deci prin operatia de mineralizare, azotul organic este transformat in azot amoniacal.

Distilarea. Prin tratarea sulfatului de amoniu cu o solutie concentrata de hidroxid de sodiu, amoniacul pus in libertate se poate distila fie obisnuit, fie prin antrenare cu vapori.

Titrarea. Prin captarea distilatului, deci a amoniacului intr-o cantitate cunoscuta de acid sulfuric, urmata de titrarea excesului de acid cu hidroxid de sodiu, se poate afla cantitatea de azot din proba luata.

b. Experienta: Substante necesare

acid sulfuric (concentrat)

sulfat de potasiu (cristalizat)

sulfat de cupru (cristalizat)

oxid de mercur (galben precipitat)

hidroxid de sodiu (43%)

sulfura de potasiu (4%)

hidroxid de sodiu 0,14 N (solutie titrata)

acid sulfuric 0,1 N (solutie titrata)

rosu de metil (indicator)

c. Mod de lucru

Mineralizarea. Se cantareste prin diferenta la balanta analitica, o cantitate de substanta uscata corespunzatoare la maxim 30 mg azot ( 1 g pentru materiale cu un continut intre 10 - 20 % proteina bruta si 2 g pentru materiale cu un continut mai mic de 10% proteina bruta).

Substanta cantarita se trece intr-un balon Kjeldahl si se adauga apoi 10 g sulfat de potasiu (pentru a ridica temperatura de fierbere a amestecului), 1 g sulfat de cupru, 0,55 g oxid de mercur si 20 ml acid sulfuric concentrat. Pentru a evita formarea unor combinatii complexe intre ionii de mercur si amoniac, se poate renunta la adaugarea oxidului de mercur.

Se astupa balonul cu o palnie si se aseaza in stativul de mineralizare Kjeldahl pe o sita de azbest gaurita pentru a permite contactul direct intre flacara si fundul balonului, apoi se incalzeste la flacara mica pana la inverzirea amestecului. Dupa inverzirea amestecului, semn ca a avut loc mineralizarea completa, se mai incalzeste 3 ore cu flacara marita.

Distilarea. Se face intr-un aparat Parnas-Wagner (prezentat in figura de mai jos). Pentru captarea amoniacului pus in libertate se iau, intr-un flacon conic, 30 ml acid sulfuric 0,1 N (masurati cu biureta) in care se adauga 2 - 3 picaturi rosu de metil. Flaconul conic se aseaza in asa fel incat capatul tubului prin care se colecteaza distilatul sa fie introdus in solutia de acid sulfuric

Dupa aceasta, amestecul mineralizat si racit din balonul Kjeldahl se dizolva in 50 ml apa distilata si se transvazeaza in balonul C al aparatului de antrenare cu vapori, turnandu-se in palnia atasata (a). La nevoie se incalzeste putin in vederea dizolvarii. Se spala apoi balonul Kjeldahl cu apa distilata si se adauga 80 ml hidroxid de sodiu 43%, care se masoara cu un cilindru gradat (in cazul cand mineralizarea s-a facut si cu oxid de mercur, se mai adauga 25 ml solutie de sulfura de potasiu, pentru a precipita mercurul ca sulfura). Introducerea hidroxidului de sodiu in balonul C se face cu atentie, turnand solutia in portiuni mici, sub agitare; in cazul unei reactii violente, se raceste balonul. Se spala palnia cu putina apa distilata si se inchid clemele (c).

Se antreneaza apoi timp de 20 de minute si se incearca sfarsitul distilarii cu capatul tubului de colectare scos din solutia de acid sulfuric, apoi se spala tubul exterior cu putina apa distilata.

Titrarea. Se face cu o solutie de hidroxid de sodiu 0,1 N, pana la virajul in galben al indicatorului.

d. Calculul rezultatului

(VH2SO4 . FH2SO4 - VNaOH . FNaOH) . TN . 100

N % = -------- ----- ------ ----- ----- ----------

m

unde:

VNaOH - numarul de mililitri hidroxid de sodiu 0,1 N

intrebuintati la titrare

m - greutatea materialului analizat

TN - 0,0014 g

Proteina bruta % = N % . 6,25

Functionarea aparatului Parnas-Wagner

Vaporii de apa formati in generatorul A trec prin vasul de siguranta B si ajung in balonul C unde are loc distilarea amoniacului format prin mineralizarea probei vegetale.

Vaporii de amoniac sunt condensati in refrigerentul D si captati in flaconul Erlenmayer in care se gaseste H2SO4 si indicatorul. Acidul sulfuric trebuie sa se gaseasca in exces (fapt care este indicat de mentinerea culorii rosii a indicatorului).

Lucrarea nr.16

Dozarea cazeinei din lapte.

1.Metoda volumetrica.

Cazeina este principala proteina din lapte,reprezentind aproximativ 80% din totalul proteidelor continute.Ca structura,cazeina este o heteroproteida,ce are ca grupare prostetica acidul fosforic,care imprima cazeinei un caracter acid.Cazeina se gaseste in lapte sub forma solubila,ca sare de calciu denumita cazeinat de calciu.Ca valoare alimentara,cazeina este o proteina completa,deoarece contine in componenta sa toti aminoacizii esentiali.

Dozarea cazeinei din lapte se face pe cale volumetrica.Cazeina,datorita caracterului sau acid este neutralizata cu un exces de solutie de NaOH de concentratie cunoscuta.Excesul de NaOH se neutralizeaza la rindul sau cu o solutie de H2SO4 cunoscuta.

Experienta.Substante necesare.

Solutie de acid acetic 1 N

Solutie de NaOH 1 N

Solutie de H2SO4 0,1 N

Indicator rosu de metil 0,3%

Indicator fenolftaleina 0,2%

Modul de lucru.Intr-un pahar Berzelius se pun 10 ml lapte la care se adauga 50 ml apa distilata si 2-3 picaturi de indicator rosu de metil.Se omogenizeaza bine amestecul,apoi se aciduleaza prin adaugare,picatura cu picatura acid acetic pina la obtinerea unei coloratii rosu intensa.Prin acidulare,cazeina trece din forma de cazeinat de calciu in cazeina libera care este insolubila in apa si apare sub forma de precipitat.Se evita adaugarea unui exces de acid acetic,deoarece la o valoare mai mica a pH-ului decit cea a pH-ului izoelectric al cazeinei,acesta se redizolva.Se lasa in repaus 5-6 minute,iar precipitatul format se filtreaza cantitativ,spalindu-se repetat paharul cu cantitati mici de apa acidulata.In cazul in care filtratul obtinut este opalescent,se retitreaza.Precipitatul de pe hirtia de filtru se aduce cantitativ,intr-un pahar Berzelius prin spalare cu apa distilat.Dintr-o biureta se toarna in paharul rerspectiv 2,5 ml solutie de NaOH 1N.Se omogenizeaza bine pina la dizolvarea completa a cazeinei,care se transforma in cazeinat de sodiu solubil.Se adauga apoi 2-3 picaturi de fenolftaleina si se titreaza excesul de NaOH cu o solutie de H2SO4 0,1 N.Pararel se efectueaza si o proba martor ce contine in pahar 2,4 ml NaOH 1 N,care se titreaza cu H2SO4 0,1N.

Calcul.

g cazeina 100 ml lapte (b-a) F 10, in care

b-ml H2SO4 consumati pentru proba martor

a-ml H2SO4 consumati pentru proba de analizat

F-factorul solutiei de H2SO4 0,1N

0,11-cantitatea de cazeina corespunzatoare la 1 ml NaOH 0,1N

10-ml lapte folositi in experienta

Proteinele totale din lapte variaza in functie de specie.Astfel,laptelede vaca contine 3,5 % proteine,cel de oaie 5,8%,iar cel de capra 4,1%.

Dozarea fotometrica a cazeinei din lapte.

Cazeina se dozeaza fotometric pe baza reactiei xantoproteice.Cazeina se nitreaza cu HNO3 concentrat,iar intensitatea culorii galbene care apare este proportionala cu concentratia cazeinei si se dozeaza fotometric.

Experienta.Substante necesare.

Solutie tampon acid acetic-acetat de sodiu 0,1N,pH 4,7

HNO3 concentrat

Solutie NaOH 30%

Modul de lucru.Intr-o eprubeta de centrifuga se masoara 0,1 ml lapte integral sau diluat in raport 1 10,in functie de cantitatea de proteine a laptelui.Cazeina se precipita prin adaugarea a 2-3 ml solutie tampon de acid acetic-acetat de sodiu.Se centrifugheaza la 2500Cg.Dupa indepartarea supernatantului se spala precipitatul de doua ori cu acelasi volum de solutie tampon.Se decanteaza si se adauga un ml HNO3.Se incalzeste apoi la fierbere,direct pe falcara,timp de 5-15 secunde.Se raceste si se neutralitzeaza cu solutie de NaOH,sub curent de apa,pina la virarea culorii.Se dilueaza la 5 sau 10 ml cu apa distilatasi se centrifugheaza sau se filtreaza.

Pe o parte din filtratul limpede se determina extinctia la l-430 nm.Continutul procentual in cazeina se indica cu ajutorul unei curbe de etalonare.

Determinarea activitatii catalazei.

Catalaza este o enzima din clasa oxidoreductazelor,raspindita in majoritatea microorganismelor aerobe,in celulele organismelor animale si vegetale.Este o cromoproteida heminica si contine 4 subunitati heminice per molecula.Hemul din catalaza contine Fe3+.Catalaza determina descompunerea apei oxigenate din celulele precipitarea unui donor de hidrogen sau a unui acceptor de oxigen asa dupa cum actioneaza peroxidaza.

Catalaza este una din cele mai active enzime.Un mol de catalaza transforma 5·106 moli de apa oxigenata la 00C timp de un minut.Domeniul de temperatura la care actioneaza optim este cuprins intre 00..100C.Preparatele de catalaza sunt folosite in industria alimentarea pentru distrugerea apei oxigenate utulizata la conservarea laptelui,in pasteurizarea la 'rece' a laptelui.

In principiu,extractul enzimatic obtinut dintru-un produs de origine animala,vegetala sau din microorganisme,este pus sa actioneze asupra unei anumite cantitati de apa oxigenata,la temperatura camerei,un anumit timp.Apoi se titreaza apa oxigenata ramasa netransformata cu KMnO4 in mediu acid.

H O +KMnO +H SO = MnSO +K SO +H O+O

Obtinerea preparatului enzimatic.Se iau 10 g produs (ce contine catalaza) bine maruntit sau mojarat,se adauga 100 ml apa si citeva picaturi de toluen,apoi se lasa la temperatura camerei timp de o ora.Amestecul se filtreaza iar filtratul constituie extractul enzimatic cu care se va lucra (filtrarea se va face prin hirtie de servetel sau prin vata).

Modul de lucru.

Din filtrat se iau doua probe a cite 20 ml fiecare,iar una din ele se fierbe pentru inactivarea enzimelor.Dupa aceasta operatie in ambele eprubete se adauga 20 ml apa distilata ,3 ml H2O2 1% si se lasa la temperatura camerei timp de 30 de minute.Se adauga apoi 5 ml H2SO4 10% si se titreaza apa oxigenata din cele doua probe cu KMnO4 0,1N.

Calcul. Diferenta dintre cantitatea de KMnO4 0,1N folosita la proba in care catalaza a fost inactivata si proba cu enzima activa corespunde apei oxigenate descompuse de catalaza din proba de analizat.

Activitatea enzimei se poate exprima in:

- ml de KMnO4 pentru un gram de produs sau in mg de H2O2 la un gram de produs,stiind ca la 1 ml KMnO4 0,1N corespund 1,7 mg H2O2

- Unitati enzimatice,adica in micromoli apa oxigenata descompusa de 1 ml extract enzimatic in timp de 1 minut

Determinarea activitatii peroxidazei pe cale colorimetrica

Peroxidaza este o enzima din clasa oxidoreductazelor care catalizeaza reactia generala.

In care ROOH poate fi api oxigenata sau peroxid organic.

Reactiile peroxidative pot avea loc in prezenta p-crezolului,guaiacolului,rezorcinolului ca substrat.Peroxidaza poate de asemenea cataliza si alte tipuri de reactii cum sunt:oxidative(in prezenta O2 si acid hidroxifumaric),acid ascorbic,hidroxihinona;catalitice(descompunerea ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,)si de hidroxilare(in prezenta unui donor de hidrogen si oxigen molecular hidroxileaza tirozina,fenilalanina,p-crezol,acidul salicilic)Peroxidazele sunt larg raspindite in diferite plante(hrean,ridichi,napi,cartofi,smochine,in diferite legume si fructe)si animale(leucocite,ficat,lapte,saliva).In general,peroxidazele au o mare stabilitate termica (850C-1150C),constatindu-se adesea reactivitatea lor dupa tratamentul termic al diferitelor materiale pe care le contin,in special cele de natura vegetala.Datorita acestui fapt,determinarea activitatii peroxidazei din diferite legume si fructe supuse tratamentelortermice(sterilizare,blansare)este folosita ca un indiciu al eficacitatii tratamentului.Determinarea activitatii lactoperoxidazei este folosita la urmarirea eficientei pasteurizarii in industria laptelui.Peroxidazele intervin in degradarea fructelor si legumelor fiind implicate in modificarea mirosului si gustului la mazare,fasole,contribuind la imbrumarea enzimatica.

In principiu,pentru determinarea unor cantitati mici de peroxidaza se utilizeaza reactia de colorare a peroxidazei cu guaicol in prezenta apei oxigenate,care este foarte sensibila.

Experienta.Substante necesare.

Solutie alcoolica de guaiacol 1%

Apa oxigenata 0,5M

Clorura de sodiu solutie 2%

Modul de lucru.Se cintaresc 10 g de produs si se mojareaza fin cu 50 ml solutie de NaCl 2%.Se trece continutul mojarului intr-un cilindru gradat de 100 ml,se clateste mojarul de citeva ori cu cantitati mici de apa distilata,apoi se aduce la volumul de 100 ml.Se lasa in repaus 30 minute timp in care se mai agita de citeva ori,apoi se filtreaza.Din filtrat se iau 10 ml intr-un balon Erlenmeyer,se adauga 10 ml de apa distilata,1 ml solutie H2O2,1 ml guaiacol 1% si se lasa timp de 30 minute la temperatura camerei.Se masoara apoi extinctiile solutiei colorate la 420 nm in raport cu apa distilata.Activitatea peroxidazei se exprima in extinctie pentru 1 g proba.