Evaluarea spectrofotometrica a peroxidarii lipidelor ( Testul MDA-TBA)

Evaluarea spectrofotometrica a peroxidarii lipidelor ( Testul MDA-TBA)

Rancezirea produselor alimentare devine perceptibila sensorial atunci cand procentul de lipide este de minim 0.5%. Dezvoltarea mai mult sau mai putin rapida a gustului ranced depinde de numarul si natura acizilor grasi nesaturati, de suprafata de contact dintre lipide si aer (faza lipidica continua, dispersata sau emulsie), de lumina, temperatura, prezenta anumitor prooxidanti(ioni metalici) sau antioxidanti naturali(tocoferolii din ulei).

Procesul de peroxidare decurge dupa mecanismul reactiilor in lant, care implica cele trei etape: initiere, propagare si terminare si care necesita prezenta sau formarea unor radicali liberi ca si catalizatori ai reactiilor.

Schema initierii prin radicali liberi a peroxidarii lipidelor:

Metodele de evaluare a peroxidarii lipidelor includ:

analiza hidroperoxizilor, produsii primari ai oxidarii prin metode iodometrice sau colorimetrice;

determinarea dienelor conjugate prin metode spectrofotometrice, calorimetrice, chemiluminiscenta;

analiza produsilor rezultati prin descompunerea hidroperoxizilor: aldehide, cetone, hidroxiacizi sau alcani.

Principiul metodei:

Malondialdehida se gaseste sub forma libera sau legata covalent de diferite molecule in tesuturile peroxidate , celule, alimente provenite din surse animale sau vegetale, grasimi sau produse lactate.

Metodele utilizate pentru estimarea malondialdehidei sunt cele de absorbtie, utilizand diferite procedee de extractie si purificare din materialele biologice. MDA se poate cuantifica fie sub forma libera fie legata de alte molecule.

Cea mai utilizata metoda de dozare a MDA se bazeaza pe reactia acesteia cu acidul tiobarbituric cu formarea unui complex de culoare roz(MDA-TBA), care absoarbe la 535 nm.

Reactia chimica de obtinere a complexului MDA-TBA:

Pentru eliberarea malondialdehidei din complecsii biologici este necesara o temperatura de 1000C si un pH scazut(max.3). Procedeul clasic implica precipitarea proteinelor cu acid tricloracetic si incalzirea extractului cu acid tiobarbituric pana la formarea complexului roz MDA-TBA.

Acest procedeu poate genera erori, deoarece cantitatea de MDA din materialele biologice poate fi marita prin interferenta anumitor pigmenti care absorb la aceeasi lungime de unda ca si complexul MDA-TBA sau micsorata ca rezultat al precipitarii complexului cu proteinele. Atunci cand se utilizeaza aceasta metoda trebuie eliminate aceste interferente, iar peroxidarea lipidelor sa se calculeze in termini de echivalenti MDA.

Reactivi:

a) Reactiv TBA: 30g acid tricloracetic

0.75g acid tiobarbituric

5.2ml HCl 0.25N

Se aduc la balon cotat de 200ml cu apa distilata.

b) Solutie tampon Tris pH=7.4

Mod de lucru: Intr-o eprubeta de centrifuga se masoara 100 microlitri proba(ulei), 0.9ml sol.Tris si 2ml reactiv TBA. Se vortexeaza cca.1minut si se tine in baie de apa la fierbere 15 minute. Dupa racire se centrifugheaza 10minute la 1000 rotatii/minut.

Se iau 3ml din complexul roz MDA-TBA , se pun in cuva de la spectrofotometru si se citeste densitatea optica la 535nm fata de un blanc.

Blanc: 1ml Tris + 2ml reactiv TBA

Calcul rezultate:

Cantitatea de malondialdehida se calculeaza inmultind densitatea optica(DO) cu coeficientul molar de extinctie al MDA.

S = 1.56 x105 mol/cm2 (coeficient molar de extinctie)

Pentru obtinerea unor rezultate mai concludente este nevoie de realizarea unei curbe etalon. Se prepara  o solutie standard stoc ,iar prin dilutii repetate se obtin diferite concentratii de malondialdehida.

Curba de etalonare pentru malondialdehida

Se utilizeaza ca standard pentru obtinerea malondialdehidei 1,1,3,3 tetrametoxipropan.

Prepararea solutiei stoc:

Se masoara 82 microlitri standard 1,1,3,3 tetrametoxipropan la care se adauga 40 ml apa distilata si 40 picaturi HCl concentrat. Se aduce solutia la semn la 50 ml si se lasa 2 ore la hidrolizat.

Concentratia solutiei este 10mM.

Prepararea solutiei standard:

Din solutia stoc se face dilutie 1:100. Pentru a realiza acest lucru se iau 0.5ml solutie stoc si se completeaza pana la 50ml cu apa distilata. Concentratia solutiei standard este de 100 nmol/ml.

Pentru determinarea curbei de etalonare se fac urmatoarele dilutii:

Masa moleculara a 1,1,3,3 tetrametoxipropan este 164.20g.