Ciuperci detectate pe semintele depozitate de solanaceae si activitatile lor biologie

Ciuperci detectate pe semintele depozitate de solanaceae si activitatile lor biologie

Abstract

Am izolat 629 de ciuperci din 1296 de seminte de plante de Solanacee, inclusive tomate, vinete, gogosar si ardei rosu, conservate pe termen lung sau scurt. Ele au fost clasificate in 22 de genuri cu exceptia ciupercilor neidentificate si au fost impartite in 2 tipuri: tomate-vinete si grupuri de ardei. Rezultatele analizelor Cluster cu metoda grupului-pereche necantarit si media aritmetica au sprijinit, de asemenea, aceste grupuri. Cele mai multe seminte de tomate infestate cu Geotrichum candidum au germinat si au crescut la fel ca semintele neinfestate. Cladosporium sphaerospermum si Arthrinium sp. izolate de pe semintele de vinete au suprimat puternic germinatia , si Penicillium a suprimat alungirea radacinii seminale la vinete. Alternaria alternate, Botrytis cinerea si Myrethecium verrucaria detectate de pe semintele de ardei rosu si gogosar au fost patogene pentru fructe si rasaduri dupa inocularea artificiala.

Introducere

Bolile Seedborne sunt capabile sa se extinda dincolo de frontierele internationale foarte usor si sunt adesea dificil de controlat deoarece sunt dificil de identificat, avand simptome tipice, fiind rare pe suprafata semintelor cu exceptia unor legume. Dupa cum impactul economic al bolilor Seedborne a crescut in ultimii ani, importanta lor a crescut in ceea ce priveste multe tipuri de culturi din Japonia , precum si la nivel mondial. Studii facute pe seminte patologice s-au ocupat in principal cu cereale, in timp ce cateva anchete au fost facute pe legume si flori ornamentale. In Japonia, studiile s-au ocupat doar cu agentii patogeni care provoaca daune grave sau sunt usor existente impreuna cu semintele in mod natural infectate, cum ar fi Fusarium care provoaca vestejirea si patarea unghiulara a frunzelor de cucurbitacee in 1970, pete negre cauzate de Alternaria spp. pe crucifere pe la inceputul anilor 1990 si la pepene verde. Studii sistematice asupra semintelor patogene trebuie sa fie intreprinse.

Ministerul Agriculturii, silviculturii si pisciculturii(MAFF) din Japonia a inceput in 1985 un proiect legat de banca de gene pentru a colecta seminte ca resurse genetice. Cu toate acestea avem putine informatii privind seedborne din banca de gene de seminte colectate, si numai Alternaria dauci si Alternaria radicina de pe semintele de morcov au fost raportate din colectiile de seminte pana in prezent(1993). Patogenitatea si impactul acestota asupra calitatii semintelor, iclusiv rata de germinare, raman necunoscute. Prin urmare, o serie de anchete asupra seedborne au fost asociate cu 5904 de seminte de legume, care au fost mentinute in colectia de seminte in banca de gene in anul 2000. Acest report reprezinta o parte din aceasta serie de investigatii.

Ohata a descris terminologia legata de seedborne in japoneza. Definitia lui despre seedborne a fost limitata de a fi folosita , dar seedborne in general include patogenii plantei, endofite nepatogene. Consideram ca calitatea smintei sanatoase ar trebui discutata din punc de vedere al intregii florei fungice a ciupercii care invadeaza tesutul interior al semintei dar de asemenea si suprafata semintei. Astfel, toate ciupercile asociate cu seminte sunt discutate in acest studiu.

Materiale si metode

Probele de seminte

In acest raport au fost investigate semintele de rosii, vinete, gogosar si ardei rosu. Toate semintele folosite in acest studiu s-au pastrat ca colectii de seminte in banca de gene propusa de MAFF din Japonia. Nici unele nu au fost tratate chimic si nici una nu a avut nici un simptom distinct pe suprafata lor. Au fost folosite 2-3 soiuri pentru fiecare specie si 2 loturi distincte recoltate in ani diferiti pentru fiecare soi. Loturile din fiecare soi reprezinta seminte colectate in anii 1980(vechi) si 1990(nou). Pentru loturile de seminte de ardei rosu colectate in anii 1991 si 1999, se face referire la vechi si nou. Caracterisicile materialului de plantat utilizat in acest studiu, cum ar fi germinatia, perioada de conservare si oroginea materialului de plantat sunt date in tabelul 1.

Detectarea si izolarea ciupercilor pe seminte

Pentru a detecta ciupercile a fost folosita o metoda partial modificata cu placa de agar, cu dextroza de cartofi care contine(PDA) 0,005% chloramphenicol. Jumatate din seminte din fiecare lot au fost spalate sub jet de apa pentru 2 ore si apoi uscate pe hartie de filtru sterilizata; cealalta jumatate de seminte a ramas nespalata. Toate operatiunile de la desigilarea pachetelor de seminte pana la introducerea semintelor pe placi de PDA s-au efectuat intr-o camera sterila. Pentru fiecare lot, au fost pregatite 12 placi fiecare continand 6 seminte spalate sau nespalate. In consecinta, 72 de seminte au fost examinate pentru fiecare lot, si pentru fiecare soi au fost efectuate 4 studii. Placile au fost incubate la temperatura de aproximativ 10°C pentru a suprima cresterea miceliana a ciupercilor cu crestere rapida. Dupa o luna de incubatie, sporii de ciuperci si coloniile care au aparut in jurul semintelor au fost izolate de catre un singur spor pentru a identifica in continuare. Numarul tulpinilor izolate au fost inumarate si procentul de seminte cu ciuperci calculat. Atunci cand mai mult de o colonie a unei specii de ciuperci a fost gasita pe o samanta, am considarat-o ca o tulpina izolata.

Analiza Cluster

Sedborne este de obicei afectata de multi factori ca modelele de formare a semintelor si mediul in timpul productiei de seminte. Pentru a analiza acesti factori, asemanari intre flora fungica obtinuta din semintele care provin din medii diferite au fost inspectate de analiza cluster cu distanta euclidiana. Tulpinile izolate din cele 22 de genuri fungice detectate dintr-un singur soi au fost aranjate intr-o progresie matematematica; fiecare progresie a fost alcatuita din 22 de elemente, presupunand ca cele 22 de genuri fungice au fost detectate pe toate soiurile. Distanta Euclidiana dintre progresia soiurilor a fost calculata. Rezultatele au fost mapate ca o dendrograma folosind metoda necantaririi grupurilor cu media aritmetica bazata pe distante.

Inocularea

Pentru a determina patogenitatea tulpinilor izolate, fructele de rosii, vinete, gogosar si ardei rosu(soiuri necunoscute), au fost ranite cu intepaturi de ac si apoi inoculate cu un disc micelial(de marimea unui dop de pluta)din fiecare specie cultivate pe placi de PDA. Pentru inocularea cu Rhizopus stolonifer pe ardei, fructele de ardei au fost bagate intr-o suspensie de spori din cultura de PDA. Fructele inoculate au fost tinute in plastic suficient de umed(aproximativ 100% din umiditatea relativa a aerului) la temperatura camerei. Efectele tulpinilor izolate asupra germinarii semintelor si cresterea plantelor au fost examinate dupa inocularea artificiala, semintele sterilizate la suprafata cu spori si / sau miceliu de la culturile de PDA sau agar V8.

Semintele din fiecare soi, stocate pe termen scurt si aparent sanatoase datorita germinatiei ridicate(tab.1), au fost dezinfectate cu 1% NaClO pentru 5 minute si 70% etanol pentru 3 minute. Dupa ce au fost spalate cu apa distilata, semintele au fost uscate intr-o camera sterile, imbibate in una din celulele inoculate pentru 10 minte, uscate din nou si depozitatea la o temperatura de aproximativ de 10°C pentru o luna. Dupa depozitare semintele au fost incubate pe placi de agar de apa la temperatura de 20°C. Germinatia a fost testata dupa o saptamana si lungimea radacinii seminale a fost masurata la 2 saptamani. Diferentele in lungime ale radacinii seminale au fost statistic evaluate de catre testul Student's la P<0 Zece seminte din fiecare soi au fost folosite pentru fiecare inoculare.

Rezultate

Frecventa spciilor de ciuperci izolate de pe seminte

In evaluare frecventei de specii izolate din fiecare soi si fiecare lot de seminte, 190 de specii izolate obtinute din semintele de la 3 soiuri de rosii au fost clasificate in 17 genuri(tab.2). Toate speciile Hormonema, unul din genurile cele mai comune gasite pe semintele de rosii, au fost detectate doar din loturile vechi. Un lot de seminte vechi de cv. Delicios a avut cea mai mare frecventa(tab3). A existat o diferenta vizibila intre flora fungica pe loturile vechi si noi de toate soiurile de rosii(tab2), dar nu si intre semintele spalate si nespalate. Un total de 51 de tulpini izolate obtinute din seminte de la 2 soiuri de vinete au fost clasificate in 10 genuri(tab2). Aspergillus paradoxus a fost frecvent detectat de pe loturi vechi de cv. Uonumakinchaku. Procentajul de seminte infectate sau infestate in celelalte loturi a fost relativ scazut(tab3). In plus, abia au fost detectate tuplini izolate pe semintele spalate cu exceptia lotului vechi de cv. Uonumakinchaku. Un total de 176 de tulpini izolate obtinute din seminte de la 2 soiuri de gogosar au fost clasificate in 12 genuri(tab2). Tulpinile izolate identificate ca Alternaria alternate si Cladosporium sp. inclusiv Cladosporium cladosporioides, Cladosporium oxysporum, Cladosporium tenuissimum si Caldosporium sphaerospermum au fost detectate frecvent la ambele soiuri si toate loturile. Alte tulpini izolate ca Rhizopus stolonifer, Fusarium sp. si Myrothecium verrucaria au fost de asemenea detectate cu frecventa redusa. In loturile noi 100% din semintele nespalate au fost infectate sau infestate(tab3), dar mai putine specii de ciuperci au fost izolate. Spaland cu apa curenta pur si simplu a redus numarul tulpinilor izolate in fiecare lot. Un total de 212 de tulpini izolate obtinute din semintele de la 2 soiuri de ardei rosu au fost clasificate in 10 genuri(tab2). Flora si procentajele de seminte infectate sau infestate au fost asemanatoare cu semintele de gogosar(tab2,3). Un punct important de remarcat a fost Botrytis cinerea, ciuperca cauzala putregaiului cenusiu, a fost detectata frecvent doar pe loturile vechi ale ambelor soiuri, si Fusarium sp cu exceptia F. oxysporm) a fost detectata doar pe loturile noi. Cu toate acestea flora fungica nu a fost diferita pe semintele spalate sau nespalate.

Asemanarile dintre seedborne florei fungice

Analizele Cluster ale asemanarilor intre flora fungica pe seminte, a aratat ca acestea ar putea fi clasificate in clase, corelat cu specile de plante, indiferent de anii de recoltate si localitate

Flora fungica pe seminte de la soiurile de solanacee separat din flora grupului cu privire la ridiche si a format o clasa unica, desi clasa, de asemenea, cuprinde flora pe castravete cv. Yomakirssshu

Mai mult decat atat clasa bacelor, cu exceptia cv de rosii. Delicious, a fost impartita in doua subclase, si anume, de rosii-vinete si subclasa ardei.

Patogenitatea izolatelor

Toate izolate de A. alternata si Phoma spp.identificate din seminte de rosii au fost nepatogene pe fructele de rosii, dar Geotrichum candidum a fost un patogen puternic impotriva ranilor fructelor de tomate. Izolatele reprezentate de Cladosporium spp.,A. alternate,Fusarium verticillioides,Phoma sp.,si Rhizosphaera sp, detectate de la seminte de vinete au fost nepatogene.

Alternaria alternta,M. verrucaria and Fusarium spp izolata de la ardei s-au dovedit a fi patogene pentru fructele de ardei.

Efectele izolatelor asupra germinatiei semintelor si a cresterii plantelor

Toate testele izolatelor fungice detectate din seminte de rosii nu au avut practic nici un efect asupra germinatiei semintelor.

Cu toate acestea, izolatele A. alternata,Penicillium waksmanii si Arthrinium sp. au inhibat puternic alungirea radacinilor seminale si apoi au cauzat putrezirea rasadului la 3 zile de la germinatie

Arthrinium sp si C.sphaerospermum idenificate la semintele vinetelor au inhibat puternic germinarea semintelor.

Izolatul Penicillium variabile a suprimat puternic alungirea radacinii, in timp ce izolatele C. oxysporum,Rhizopus stolonifer si Aspergillus paradoxus au suprimat putin alungirea radacinii.

Tulpinile de Alternaria alternate detectate din semintele de ardei sunt patogene pentru gogosar si ardei, au suprimat alungirea radacinii seminale, in timp ce,B.cinerea and M.verrucaria au suprimat puternic alungirea radacinii seminale la ardei dar efectul asupra germinarii a fost minor.

In contrast,Ulocladium atrum ocazional a consolidat alungirea radacinii la ardei.

Discutii

Acest sondaj a fost facut folosind categorizarea si definitia semintelor de la Kishi. In cazul in care semintele au un model comun de formare in conformitate cu acest concept, avem ipoteza ca fructele plantelor ar avea o ruta comuna a infectiei primare pentru agentii patogeni fungici si similara cu cea a florii fungice seedborne.Astfel in sondajul nostru despre seedborne pe plante cu seminte, cum ar fi de rosii, vinete, gogosar si ardei rosu, diferite ciuperci au fost detectate cu tendintele specifice plantei, precum si analiza cluster in linii mari sprijinite in masa de concepyul Kishi si ipoteza noastra. Spalatul cu apa curenta cu o luna inainte de izolare pur si simplu a redus numarul de tulpini izolate, mai degraba decat modificarea florei fungice detectate. Ciupercile de pe seminte si activitatile lor biologice, au fost evaluate dupa cum urmeaza. Cu toate ca semintele de tomate cvs. Shinsapporo si Kanenari recoltate in Hokkaido aproape in acelasi timp au avut un numar mic de agenti patogeni, lotul vechi de seminte cv. Delicios a fost caracterizat de Hormonema sp. Lotul va fi infectat sau dens infestat cu ele, deoarece ciupercile abia au fost indepartate prin apa curenta. Ciupecile izolate din semintele de rosii ar putea fi considerate ca saprofite, deoarece toate tulpinile izolate testate au fost nepatogene fata de rosii si au fost eliminate prin jet de apa. Analiza Cluster a florei fungice seedborne a aratat ca flora de pe semintele de rosii este puternic influentata de localitate si anul de recoltare. Cu toate acestea, doar o mica diferenta ar putea fi detectata printer flora fungica pe soiurile de rosii testate, deoarece au existat putine tulpini izolate de fiecare gen fungic, chiar dak diferitele tulpini izolate, au fost depistate in randul loturilor. In India, Suryanarayana(1963) a gasit 11 genuri fungice pe 19400 de seminte utilizand o metoda cu sugativa si PDA, malt-agar si nisip sterilizat. Rezultatele au indicat, de asemenea ca aproape toate tulpinile izolate de la semintele de rosii au fost saprofite, si numai atunci cand semintele au fost grav infestate au facut seminte si rasaduri? In plus, am aratat ca al semintele de rosii inoculate artificial cu Geotrichum candidum, agentul pathogen al putregaiului fructelor de rosii de culoare alba, ciuperca ar putea sa ramana in viata intr-un frigider timp de pana la o jumatate de an, dar a fost complet eliminate prin tratamentul cu apa curenta. Acest lucru a sugerat ca semintele de rosii au fost infestate cu Geotrichum candidum, ca urmare a fructelor recoltate cu putregai. Cateva tulpini izolate, cum ar fi Alternaria alternate, Arthrinium sp. si Penicillium waksmanii detectate de pe semintele de rosii au fost considerate ca fiind ciuperci patogene; oricum, spalarea semintelor a redus numarul de ciuperci detectate. Neergaard si Richardson au listat intre 7-21 de specii fungice de pe rosii, cu toate acestea au existat putine specii mutuale intre acest sondaj si aceste liste. Prin urmare, este rezonabil sa se presupuna ca agentii patogeni bacterieni si virali, cum ar fi ToMV si Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis ar putea fi cei mai importanti agenti patogeni pe rosii in Japonia, in timp ce Alternaria spp au fost considerate ca importanti agenti patogeni de Suryanarayana in India. Diversitatea florei fungice pe simtele de vinete a fost scazuta in randul soiurilor. Frecventa de tulpini izolate din 144 de seminte pentru fiecare soi era mai mic de cinci pentru fiecare specie, cu exceptia Aspergillus paradoxus. Desi A. paradoxus, Arthrinium sp. si Cladosporium sphaerospermum din lotul vechi de cv. Uonumakinchaku au suprimat germinare semintelor si alungirea radacinii seminale, varsta semintei si facorii fungici trebuiec luate in considerare atunci cand se discuta procentaje mici de germinare , in fiecare lot vechi, pentru ca putine tulpini izolate au fost depistate in lotul vechi de cv. Tsurubososennari. Semintele din lotul vechi de cv Uonumakinachaku, cu toate acestea, ar putea fi infectate sau pur si simplu infestate pe suprafata semintelor in randul populatiilor dense de A. paradoxus, deoarece acestea nu au putut fi eliminate prin apa curenta. In India, Suryanarayana a depistat 9 genuri fungice pe 8600 de seminte, precum Suryanarayana si Bhombe au detectat 6 genuri pe 100 de seminte din fructe bolnave. In aceste investigatii, Phomopsis sp. probabil Phomopsis vexanus a fost considerate ca cel mai important agent patogen. In plus, Rout si Rath au detectat numai 6 specii de ciuperci de la 800 de seminte de la 2 loturi si ceea ce trebuie sa fie subliniat este faptul k aproape toate dintre ele au fost soilborne si saprofite. In studiul nostrum aproape toate tulpinile izolate au fost detectate din seminte nespalate, putem sa le consideram capabile de infestare si de alti factori care trebuie sa suprime privind activitatea semintelor, cel putin cu privire la semintele testate. Desi Kishi nu a dezvoltat o clasificare detaliata a semintelor, rezultatele noastre bazate pe analiza Cluster au aratat ca semintele de gogosar si ardei rosu au protejat unele similtutidini in flora lor fungica si au fost diferite de cele de rosii si vinete. Astfel, clasificare Kishi ar putea fi impartita in continuare in grupuri. In studiul nostru, Alternaria alternate a fost detectata la aproximativ 12 %-25% din semintele testate si toate tulpinile izolate au aratat au aratat patogenitate la fructele de ardei. Acest lucru a sugerat ca Alternaria alternate a fost o flora omniprezenta pe semintele de ardei fara a tine cont de depozitarea pe termen lung sis curt, si ar putea fi prin urmare, cel mai important agent patogen din Japonia. Ciuperca a fost indepartata cu usurinta de catre apa curenta si prin urmare aproape toate sunt probabil de pe suprafata semintei. Alternaria alternata este bine adaptata, riguroasa si dominanta, aceasta a fost detectata relative frecvent pe fiecare lot depozitat pentru mai mult de 14 ani. Suryanarayna si Bhombe, Rout si Rath de asemenea au ajuns la concluzia ca Alternata spp. a fost cel mai important agent patogen in India. In Coreea, Kim si Yu au raportat fructe de ardei putrezite cauzate de Alternaria alternata pe care am gasit la inalta frecventa in loturile vechi si noi de seminte recoltatea in Japonia in acest studiu. Asa ca am presupus ca boala cauzata de Alternaria alternata a fost prezenta in Japonia de mai multe decenii, chiar am crezut ca nu a fost raportata ca o cauza de putregai de fructe si agent patogen pe ardei. Bolile de la aceasta ciuperca nu au fost recunoscute ca o problema reala in Japonia, deoarece simptomele distincte sunt foarte rare iar pierderile sunt adesea sub un nivel din punt de vedere economic admisibil. Cu toate acestea in conformitate cu Rotem, aceasta ciuperca a cauzat 50% din pierderile economice, si noi prin urmare trebuie sa ne ferim de focarele de boala.

Cel mai important, fructele putrede, nu ar trebui sa fie recoltate pentru productia de seminte. Faptul ca diferite specii de Fusarium, altele decat Fusarium oxysporum au fost izolate numai de pe loturile noi de seminte de ardei sugereaza ca longevitatea acestor specii de Fusarium pe seminte este mai mica de 9 ani si este influentata de incapacitatea lor de a forma pereti bruti de clamidospori asa cum s-a observat cu toate tulpinile izolate de Fusarium oxysporum. Cele mai multe dintre tulpinile izolate testate de Fusarium spp., au fost patogene pe fructele de ardei, prin urmare agentii patogeni de Fusarium spp. sunt considerate de asemenea importante din punct de vedere economic asupra ardeiului. In ceea ce priveste diferentele florei fungice de pe gogosar si ardei rosu, statutul de 2 agenti patogeni ar trebui sa fie discutat individual. Botryris cinerea detectata numai in loturile vechi de seminte de ardei rosu, a fost privita ca o componenta importanta a florei fungice. Pentru ca loturile de seminte vechi associate cu ciuperca au avut rate de germinare scazute, in ciuda de a fi recoltate in ani diferiti, ciuperca este considerate ca fiind cel mai important agent de reducere a germinarii semintelor de ardei rosu, chiar daca aceasta a fost in primul rand pe suprafata semintelor dupa cum s-a demonstrat prin indepartarea lor de catre apa curenta. In plus, ciuperca a ramas viabila pentru mai mult de 14 ani si s-ar putea pierde, refugia pe seminte proaspete de A. alternate, Cladosporium spp. sau Fusarium spp. Desi Botryris cinerea este un agent patogen care preleveaza gogosarul si ardeiul rosu, aceasta a fost mai comuna pe semintele de ardei rosu decat pe cele de gogosar. In ceea ce priveste, Myrothecium verrucaria pe semintele de gogosar in studiile anterioare, ciuperca a fost gasita pe ardei si a fost mentionata ca un agent patogen usor cu nici o descriere a unui test de patogenitate. Aceasta ciuperca a fost de asemenea raportata cu privire la semintele de fasole, soia si orez, precum si pin negru. Nguyen, de asemenea a utilizat testul lor de patogenitate pe frunzele de ardei rosu , cu toate acestea in conformitate cu sudiul nostru izolatul a fost patogenic pe fructul de ardei rosu in termen de 3 zile de la inoculare si a suprimat alungirea radacinii seminale. In mod evident, aceasta ciuperca a cauzat boala fructelor putrezite, prin intermediul transmiterii de seminte numai prin fructe bolnave. Constatarile noastre sunt prima inregistrare record de Botrytis cinerea si Myrothecium verrucaria din semintele de ardei din Japonia, care provoaca putregaiul de fructe si inhibarea germinatiei semintelor si cresterea. Am discutat flora fungica seedborne,cu toate acestea tulpinile izolate au fost compuse din ciuperci viabile si ciuperci culturabile in anumite conditii. Prin urmare studii suplimentare folosind diverse directii metodologice sunt necesare pentru a acumula o baza de date concise a informatiilor asociate cu seedborne.