Testul imunoenzimatic DAS-ELISA

Testul imunoenzimatic DAS-ELISA

Testarea pomilor si puietilor s-a facut prin tehnica serologica DAS-ELISA (Double-Antibody-Sandwich Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay).

Organele utilizate pentru analize au fost frunzele (in cursul vegetatiei) si muguri (in timpul repausului vegetativ).

Pentru diagnosticarea virusurilor s-au utilizat antiseruri provenite de la Institutul de Cercetari pentru Selectie si Tehnologii Pomicole Chisinau- Republica Moldova, firma Loewa- Germania si firma Sanofi-Franta.

S-au facut teste DAS-ELISA pentru urmatoarele virusuri : la mar- apple mosaic, apple chlorotic leaf spot, apple stem grooving, apple stem pitting ; la prun- plum pox, prune dwarf, Prunus necrotic ring spot.

Au fost parcurse urmatoarele etape :

1.      peliculizarea placii de polistiren cu solutie IgG (imunogamaglobulina) antivirus PDV si PNRSV in tampon de acoperire cu pH=9,6.

2.      legarea antigenului viral de anticorpul fixat pentru formarea complexului anticorp-antigen. Probele folosite au provenit din frunze si muguri. Materialul vegetal a fost mojarat in tampon de extractie in urmatoarele raporturi : 1 :10 pentru muguri (0,5g : 5ml tampon) si 1 :12 pentru frunze (0,5g : 6ml tampon).

3.      reactia anticorpilor cu conjugatul imunoenzimatic (fosfataza alcalina). Pentru cuplarea conjugatului cu antigenul s-a adaugat cate 0,25ml conjugat in fiecare godeu, pentru conjugatul de la Chisinau, respectiv 10ml conjugat pentru cel provenit de la Loewa si Santofi. Conjugatul s-a diluat in solutie de PBS + Tween 0,5(11), la care s-a adaugat 20g polivinil pirolidona K2S si 2g seralbumina de bovine. Placa s-a incubat la termostat (37⁰C) timp de 4 ore, apoi s-a spalat de 4 ori, cu 200ml solutie PBS + Tween per godeu.

4.      reactia cu substratul specific. S-a utilizat o solutie de p-nitrofenilfosfat 1mg per ml tampon substrat. Reactia  p-nitrofenilfosfatului cu fosfataza alcalina a avut loc la temperatura camerei, la intuneric. Virarea culorii din incolor in galben a avut loc in decurs de 1-1 1/2 ore. Intensitatea reactiei de culoare, care masoara cantitatea de anticorpi specifici legati de antigene, prezenti in serul de cercetat, s-a determinat fotometric cu aparatul Zeiss-Sumal. Densitatea optica (DO) a solutiei colorate la 405 nm s-a evaluat in raport cu densitatea optica a martorului sanatos. Au fost considerate pozitive cele care au avut valoarea extinctiei mai mare de 0,1 si au avut valoarea extinctiei de 2 ori mai mare decat cea a martorului negativ.

Foto 1 - Aparatura ELISA din laboratorul de virusologie-fitopatologie de la SCDP Bistrita