diagnosticul infectiilor stafilococice

Prelevarea produsului patologic se face cu tamponul steril, stergand cu o usoara apasare zona afectata a tegumentului, in cazul leziunilor cutanate. Tot cu tamponul steril se recolteaza puroi din leziunile deschise superficiale sau dupa evacuarea chirurgicala a colectiilor profunde.

Prelevarile trebuiesc efectuate inaintea oricarui tratament cu antibiotice.

Examenul direct.

Din produsele patologice se pot efecta frotiuri colorate Albastru de metilen, care se examineaza

la microscopul optic, cu obiectivul 100 x cu imersie.

Stafilococii sunt coci Gram pozitivi, cu diametrul de 0.8-1 micrometri, grupati tipic in ciorchine, dar si in gramezi, lanturi scurte, sau izolati. Ei sunt in general necapsulati.

Figura nr. 8: Frotiu colorat Gram din produse patologice

Caractere de cultura

Stafilococii sunt bacterii nepretentioase, care cresc si pe geloza simpla, nutritiva, dar se prefera geloza sange pentru observarea hemolizei. Se foloseste geloza cu sange defibrinat de berbec 7% si nu cu sange de om, care contine inhibitori nespecifici si eventual anticorpi antistafilococici.

Nu este indicata la prima izolare folosirea unui mediu selectiv (Chapmann sau Baird -Parker), care ar putea falsifica rezultatele prin selectarea exclusiva a S.aureus, chiar in cantitate mica, neputandu-se face deosebirea dintre o colonizare si un proces infectios real.

Dupa o incubatie de 18-24h la 37^oC se obtine o cultura abundenta si caracteristica.

Alte specii care pot produce colonii pigmentate sunt: S.saprophiticus (citreus), S.hominis, S.haemoliticus si S.hyicus, subsp.chromogenes. Pigmentii sunt carotenoizi, iar culoarea variaza de la galben la oranj.

S.epidermidis, S.simulans, S.intermedius, S.hyicus,subsp.hyicus, produc colonii nepigmentate (albe ) Exista tulpini de S.aureus nepigmentate sau care si-au pierdut capacitatea de a produce pigment datorita unor factori nefavorabili din mediu. De aceea testul coagulazei este obligatoriu.

Dintre speciile de stafilococi coagulazo-negativi mai pot produce hemoliza completa S.haemoliticus si S.intermedius.

In caz de aspect necaracteristic, verificarea culturii se face prin frotiu din cultura pura colorat Gram si prin evidentierea producerii de catalaza.

Catalaza - enzima ce elibereaza O₂ din H₂O₂ este prezenta la genurile Micrococcus si Staphylococcus si absenta la Streptococaceae. Se poate determina pe lama sau in tub. Cateva colonii de stafilococ de pe un mediu de cultura fara sange se emulsioneaza intr-o picatura de H₂O₂ pe o lama de microscop sau in 1 ml. H₂O₂ intr-un tub de reactie. Eliberarea bulelor de gaz indica prezenta catalazei.

Pe mediul Chapmann solid cu manitol,

Teste de evidentiere a caracterelor de patogenitate

1. Coagulaza.

Coagulaza legata (clumping factor).-se determina printr-o reactie de aglutinare pe lama.

- O picatura de plasma de iepure sau umana citratata se depune pe lama si se amesteca cu continutul unei anse incarcata cu colonii dintr-o cultura de stafilococ. Citirea se face la 10 sec. Actiunea coagulazei se manifesta prin aparitia de mici coaguli, datorita precipitarii fibrinogenului in fibrina.

Figura nr.9: Testul coagulazei ( latex aglutinare)

Coagulaza libera se determina printr-o reactie de coagulare in tuburi - se folosesc tuburi de hemoliza sterile, in care se introduc cate 0.5 ml plasma recoltata pe un alt anticoagulant decat citratul, de ex.pe EDTA.

-se adauga 0.1 ml din cultura in bulion, sau o colonie de pe geloza simpla

-se incubeaza tuburile la 37^o .

Coagulaza libera actioneaza asupra substantei protrombin-like, declansand reactiile ulterioare ale coagularii.

-reactia se citeste dupa 4,18 si 24h.

-coagularea se prezinta sub 3 aspecte: -coagulare in masa

-aspect de "cap de meduza"

-aspect de grunji in lichid clar

Orice grad de coagulare indica reactie pozitiva.

In timp ce coagularea pe lama este un test rapid, de screening, coagularea in tub da rezultatul definitiv (Lenette).

2. Prezenta proteinei A

Proteina A se identifica printr-o reactie de latex-aglutinare, singura sau impreuna cu clumping factor.

Cu ajutorul trusei Pastorex Staph Plus, (BIORAD, Marne la Coquette, France), prin metoda latex -aglutinarii, se poate determina simultan:

a). Coagulaza legata sau "clumping factor"

b). Proteina a, cu afinitatea pentru fragmentul "cristalizabil" (Fc) al imunoglobulinelor de clasa IgG.

c) polizaharidele capsulare ale S.aureus.

Reactivul latex contine particule de latex de culoare rosie sensibilizate cu anticorpi monoclonali specifici anticapsulari, fibrinogen si IgG.

Metoda: 1-3 colonii de stafilococ (de pe mediul geloza sange, geloza simpla sau mediu hiperclorurat cu adaos de manitol) se emulsioneaza intr-o picatura de reactiv latex, int-un cerc de pe cardul de aglutinare. Se omogenizeaza prin miscari usoare de rotatie timp de 30 secunde.

Citirea si interpretarea: prezenta aglutinarii - reactie pozitiva. Agregatele de latex pot fi de diferite marimi, pe fondul unui mediu clar; absenta aglutinarii si aspect uniform-lactescent - reactie negativa.

Reactia se efectueaza intotdeauna cu martori: pozitiv si negativ, pentru a se putea valida rezultatul. Sensibilitatea testului este de 99.1% pentru S.aureus.[42, 99,123].

Speciile recent identificate Staphylococcus lugdunensis si Staphylococcus Schleiferi poseda un factor de afinitate pentru fibrinogen si pot da reactii de aglutinare pozitive.

 

Figura: 10 (a, b) Latex-aglutinare pe lama pentru clumping factor, proteina A

si polizaharizii de suprafata

3. Determinarea DNA-azei termostabile

Metoda clasica -printr-o reactie de culoare

-se utilizeaza geloza cu adaus de ADN si albastru de toluidina ca indicator de pH;

-in geloza se taie godeuri in care se adauga cultura de stafilococ de 18h in bulion, inactivata prin fierbere 15 minute la Bain- Marie;

-se incubeaza 2-4 h la 37^oC;

Actiunea enzimei asupra ADN si fragmentarea acestuia determina virarea culorii indicatorului in roz.

Figura: 11 Testul DNA - zei

O metoda mai specifica, mai rapida dar mai costisitoare este prin reactia de sero-neutralizare cu anticorpi anti DNA-aza stafilococica. Rezultatul se poate citi dupa 4 h.

Alte teste accesorii pentru S.aureus

Fermentarea manitei in anaerobioza. Se foloseste geloza semisolida cu adaos de manita 1% si indicator de pH - albastru de toluidina sau rosu neutru. Se inoculeaza tulpina de studiat si se incubeaza 24-48 h la 37^o C.

S.aureus fermenteaza manita atat in aerobioza ,cat si in anaerobioza.

SCN fermenteaza manita strict aerob.

Producerea de acetoina (reactia Voges-Proskauer)

Producerea de acetoina din glucoza sau piruvat este o alta reactie de diferentiere intre S.aureus si alte specii ce pot fi ocazional coagulazo-pozitive: S. intermedius, S.hyicus, precum si intre S. aureus si SCN.

Punerea in evidenta a toxinelor

Enterotoxinele

Cele 7 enterotoxine (A,B,C1,C2,C3,D,E ) sunt antigenice si pot fi diferentiate serologic, prin tehnici de imuno-difuzie, aglutinare, RIA , ELISA .

Exfoliatinele A si B

Se pot determina prin metode imunologice:CIEF (contraimunoelectroforeza) , ELISA.

Leucocidina

Se poate determina prin metode imunologice, ex.latex-aglutinare.

Diagnostic indirect

Diagnosticul indirect are o valoare practica limitata.

Titrul antistafilolizinelor alfa poate prezenta interes in cazul infectiilor profunde sau cronice, valorile normale fiind <2 UI/ml.

Cautarea anticorpilor anti-peptidoglican sau anti-acizi teichoici prin imuno-electroforeza sau imuno-difuzie in gel poate avea indicatii in focare infectioase inaccesibile culturii si endocardite cu hemoculturi negative,dar nu exista antigene bine standardizate.

TESTE MINIME DE IDENTIFICARE A PRINCIPALELOR SPECII DE STAFILOCOCI

Producerea de acid din diverse zaharuri

Fermentarea zaharurilor se poate determina clasic, prin cultivarea pe geloza cu adaus de diferite zaharuri si indicator de culoare, sau folosind sisteme comerciale de identificare biochimica: API - staph, API staph - ident, Staph-trac-strip si alte sisteme automatizate si miniaturizate de diagnostic ex. Micro-scan-Combo-panel

Aceste sisteme permit un diagnostic exact de specie si efectuarea de antibiograme cantitative (CMI si CMB) la un numar mare de antibiotice.

Figura 11 - Galerie API - staph

Antibiograma si determinarea rezistentei la MeticilinA

Testarea sensibilitatii la antibiotice a tulpinilor stafilococice se poate face conventional, prin

metoda difuzimetrica sau prin metoda dilutiilor, cu evidentierea CMI si CMB.

De asemenea, exista sisteme miniaturizate sau / si automatizate pentru antibiograme prin metoda dilutiilor (Murex, API: Bio-Merieux, Baxter).Setul de antibiotice folosit poate varia in functie de scopul determinarii (test de rutina, cercetare), localizarea infectiei (cutanata, osoasa, proces septicemic, infectie urinara ), sistemul folosit.

Asociatia americana de laborator clinic recomanda urmatoarele antibiotice pentru testarile de rutina:

-Amikacina (sau:Gentamicina,Kanamicina,Netilmicina,Tobramicina)

-Cephalotin

-Chloramphenicol

-Clindamicina

-Eritromicina

-Meticilina, Oxacilina sau Nafcilina

-Penicilina G

-Tetraciclina

-Trimetoprim - Sulfametoxazol

-Vancomicina,Teicoplanina (antibiotice de rezerva)

-Nitrofurantoin, Sulfizoxazol si Trimetoprim,numai pentru infectii urinare.

Laboratorul nostru mai foloseste, pentru metoda clasica Kirby Bauer si alte antibiotice: - Rifampicina, Norfloxacina, Ciprofloxacin, Ofloxacina (sau alte fluorochinolone), Lincomicina- Cefuroxim (generatia a II-a), Ceftazidim (generatia a III-a), Linezolidul.

Tulpinile meticilino-rezistente de S.aureus (MRSA) pot fi depistate cu mare acuratete astfel:

a).Metoda difuzimetrica: insamantare in panza a inoculului pe geloza Muller-Hinton suplimentata cu NaCl 4% si aplicarea de microcomprimate cu Meticilina 10 micrograme/ml, Oxacilina sau Nafcilina 6 micrograme/ml. Inoculul de 10⁶CFU se insamanteaza in panza pe suprafata placii si se incubeaza 24-48 h la 35-35 ⁰ C. Cresterea lenta la o temperatura inferioara 37^oC, mareste sensibilitatea testului.

b). Metoda microdilutiilor, cu determinarea CMI, foloseste bulion Muller-Hinton suplimentat cu cationi bivalenti si NaCl 2%. MRSA demonstreaza CMI la meticilina de >16 micrograme/ml, iar la Oxacilina si Nafcilina de >10 micrograme/ml.

Sisteme de tipare epidemiologicA

Biotiparea se foloseste mai ales pentru SCN, dar da rezultate valoroase si pentru S.aureus. Antibiogramele trebuie standardizate pentru a oferi rezultate comparabile.

Tiparea fagica. Folosita din 1952, ofera rezultate valoroase si astazi pentru tulpinile de S.aureus. Metoda consta in stabilirea grupului de bacteriofagi la care esta sensibila tulpina izolata (lizosensibilitate), cu ajutorul unui set de fagi activi pe S.aureus de origine umana.

Determinarea profilului plasmidic (tiparea plasmidica) al tulpinilor izolate, prin electroforeza in gel de agar a ADN tratat cu enzime de restrictie permite identificarea de populatii clonale stafilococice cu noi caractere, in special referitoare la rezistenta multipla la antibiotice,ce poate fi codificata de 5-10 plasmide diferite, transferabile.

Analiza ADN cromozomial prin electroforeza in camp tranvers alternant a ADN tratat cu enzime de restrictie, si folosirea de sonde nucleotidice, permite identificarea genelor ce codifica anumite caractere: producerea de toxine, rezistenta la antibiotice.

DIAGNOSTICUL INFECTIILOR STREPTOCOCICE

Definitie si caractere generale

Familia Streptococcaceae cuprinde coci Gram-pozitivi, izolati si grupati in lanturi de diferite

lungimi sau perechi, imobili, nesporulati, aerobi facultativ anaerobi; sunt catalaza-negativi si

oxidazo-negativi.

Streptococii sunt bacterii pretentioase nutritiv, ce necesita pentru cresterea in vitro medii

complexe, nutritive, mediul de electie fiind geloza-sange.

Exista mai multe genuri de streptococi cu importanta pentru om: Genul Streptococcus,

genul Enterococcus, genul Lactococcus. Apartenenta la familia Streptococcaceae a fost stabilita

pe baza criteriilor fenotipice si mai recent, de biologie moleculara.

Principalele criterii de clasificare a streptococilor, care reprezinta si criterii de identificare

sunt: aspectul hemolizei produsa pe mediul geloza-sange si prezenta antigenului de grup Lancefield.

In functie de hemoliza, se deosebesc:

streptococii b-hemolitici, care produc hemoliza completa, sub forma unei zone clare, bine delimitate, cu diamentrul in general mare in raport cu marimea coloniilor.

Streptococii a-hemolitici, produc hemoliza partiala, verzuie (viridans), mai slab delimitata.

Streptocoicii a'-hemolitici, produc o zona de hemoliza incompleta delimitata de o zona ingusta de hemoliza incompleta

Streptococii nehemolitici (g

Clasificarea Lancefield se bazeaza pe prezenta antigenului de grup - polizaharidul C, de

la nivelul peretelui celular. In functie de acest antigen, streptococii apartin grupelor A-H si K-W.

Exista si streptococi negrupabili, care nu poseda antigenul de grup, de exemplu streptococii viridans.

Majoritatea speciilor intalnite la om sunt saprofite - conditionat patogene si fac parte din flora

normala a tegumentului, tractului respirator, digestiv, genital.

Specia obligat patogena este Streptococcus pyogenes, dar si aceasta specie poate fi izolata

si de la purtatori sanatosi.

Streptococcus pyogenes

Streptococul b-hemolitic de grup A determina:

infectii respiratorii: faringite, angine

infectii cutanate: impetigo, erizipel, infectii de plaga, in special la arsi

celulite, fasceita necrozanta

scarlatina

febra puerperala, soc toxic

Recoltarea si insamantarea produselor patologice. Produsele patologice pot fi: exudat

faringian, exudat nazal, secretie de plaga, etc, in functie de localizarea infectiei.

Acestea se recolteaza pe cat posibil inaintea administrarii de antibiotice.

Insamantarea se face, in cel mai scurt timp de la recoltare. Cand acest lucru nu este posibil,

pentru a preveni uscarea tampoanelor, acestea se introduc in mediu de conservare si transport

sau in 2 ml bulion steril. Mediul de electie este geloza-sange, cu 7% sange defibrinat de berbec.

Incubarea se face la 37 ⁰ C, timp de 24 h.

Caracterele de cultura: Streptococii cresc sub forma unor colonii mici (cu diametru de

aproximativ 0,5 mm), de tip S: rotunde lucioase, convexe, cu margini regulate; mai rar, pot fi

colonii mucoide sau de tip glossy, sau colonii mai mari de 5 mm.

Hemoliza este completa, de tip b

Examenul microscopic al frotiului efectuat din cultura pura evidentiaza coci Gram-pozitivi

grupati in lanturi de lugimi diferite.

Testul catalazei - negativ

Testul oxidazei - negativ

Identificarea grupului: testul la bacitracina pozitiv (sau Bacitracina pozitiv si Biseptol negativ)

Reactii de aglutinare sau de precipitare cu seruri de grup.

Streptoccus agalactiae - Streptocul de grup B

Streptococcus agalactiae este conditionat patogen. Se gaseste la aproximativ 30% dintre

persoanele sanatoase in flora intestinala, naso-faringiana si flora vaginala, in special la gravide.

Poate produce infectii la nou nascut: meningita neonatala si pneumonia neonatala, cu atat

mai severe cu cat nou nascutul este prematur si membranele au fost rupte de mai mult de 48h.

Cele doua afectiuni se pot complica cu septicemie.

La adult produce infectii respiratorii si genitale, urinare, cutanate, si mai rar pneumopatii, meningita, septicemie.

Caractere de cultura - pe geloza sange produc coloniide tip S sau M, mici, transparente, incolore, inconjurate de hemoliza completa.

Examenul microscopic al frotiului efectuat din cultura pura evidentiaza coci Gram-pozitivi

grupati in lanturi de lugimi diferite. ( aspectul microscopic si al culturii este identic cu S.Pyogenes).

Diferenta fata de S.Pyogenes se face astfel:

Testul la Bacitracina si Biseptol: S. agalactiae este rezistent atat la Bacitracina cat si la Biseptol.

Produce hidroliza hipuratului

CAMP-test - pozitiv: producerea unei proteine ( factorul CAMP), care interactioneaza cu a- hemolizina stafilococica si determina hemoliza completa.

Identificare serologica prin reactii de precipitare sau de aglutinare cu serul de grup B.

Streptococii de grup C sunt identificati preliminar ca Streptococi b-hemolitici rezistenti la bacitracina si sensibili la Biseptol, identificarea de certitudine facanduase prin precipitare sau aglutinare cu ser de grup C.

Alti streptococi b-hemolitici ce pot fi ocazional implicati in infectii la om sunt cei de grup F si G. Acestia se identifica prin reactii de precipitare sau aglutinare cu seruri de grup si pe baza unor reactii biochimice

Streptococii de grup D sunt streptococi care au habitatul normal in intestinul uman: enterococii, precum si specii non-enterococice. Enterococii au fost inclusi intr-un gen aparte, genul Enterococcus, cu 12 specii, dintre care prezinta interes medical E. Fecalis, E. Fecium si E. Durans

Pe geloza sange,enterococii cresc sub forma unor colonii mici, transparente sau semitransparente, cu hemoliza de tip g , mai rar a sau b

Microscopic, enterococii apar ovalari, cu diametrul de 0,5-1 mm, grupati in perechi sau lanturi scurte.

Majoritatea tulpinilor sunt mobile.

Aglutineaza cu serul de grup D.

Testul la bila-esculina. Mediul agar-bila-esculina ( ABE) se insamanteaza cu tulpina streptococica. Dupa incubare de 24 h la 37^o C, aparitia unei coloratii negre pe mai mult de jumatate din mediul insamantat semnifica reactie pozitiva. Toti streptococii de grup d sunt pozitivi la acest test.

Toleranta la mediu hipersalin . Acest test permite diferentierea enterococilor de alti

streptococi de grup D. Doar enterococii se dezvolta usor, in 24 h pe mediu hiperclorurat ( Na Cl

Alte teste folosite in identificarea enterococilor: testul de hidroliza a argininei, testul de

hidroliza a hipuratului, fermentarea unor zaharuri.

Cresterea la 50 ^o C ( E. Fecalis, E. Faecium), cresterea in mediu alcalin, cu ph:9,6.

Streptococii viridans

Pe mediul geloza-sange produc hemoliza incompleta, verzuie de tip a

Nu aglutineaza cu serurile de grup

Se diferentiaza de pneumococi, care produc acelasi tip de hemoliza , prin testul la Optochin, negativ pentru streptococii viridans si pozitiv pentru pneumococi.

Speciile pot fi diferentiate intre ele pe baza unor rectii biochimice: fermenterea unor zaharuri - manitol si sorbitol, hidroliza ureei, a esculinei si argininei.

Diagnosticul infectiilor pneumococice

Streptococcus pneumoniae (pneumococul) este o specie de streptococi de forma lanceolata, grupati in perechi (diplo),imobili, incapsulati, alfa-hemolitici. Ca toti streptococii alfa-hemolitici, nu poseda antigen specific de grup, dar pe baza antigenelor capsulare sunt grupati in 80 de serotipuri.

Fig. Pneumococi in sputa

Pneumococii sunt sensibili la actiunea bilei si sarurilor biliare, care-i lizeaza. De asemenea , la pneumococi apare fenomenul de autoliza, in culturile vechi in mediu lichid.

Pneumococii sunt bacterii conditionat patogene, ce determina pneumonia pneumococica, otita medie, mastoidita. Pneumonia se poate complica cu pleurezie, bacteriemie si consecutiv bacteriemiei: meningita, endocardita, mai rar artrita septica.

Principalel produse patologice in care se poate identifica Str. pneumoniae sunt: sputa, exudatul faringian, secretie otica, L.C.R., hemocultura.

Frotiul colorat Gram din produsul patologic se efectueaza pentru sputa si L.C. R. Pneumococii apar Gram-pozitivi, de forma lanceolata, grupati in diplo, incapsulati. Alaturi de ei, pe aceste frotiuri apar leucocite polinucleare, pneumococii fiind situati extracelular. In coloratia albastru de metilen sete evidentiata bine capsula pneumococilor, ca un halou clar in jurul perechilor de coci.

Cultura pe mediul geloza-sange : peumococii produc colonii mai mari dectt ceilalti streptococi, aplatizate, cu marginile ridicate si centrul deprimat, inconjurate de hemoliza viridans.

Testul la optochin : 2-3 colonii din cultura primara se insamanteaza in panza pe un sector de placa cu geloza-sange. In centrul sectorului se aplica un microcomprimat cu 5m optochin ( etil-hidro-cupreina). Se incubeaza 24 h la 37 ^O C. Pneumococii sunt foarte sensibili la optochin, in jurul comprimatului formandu-se o zona de inhibitie de minim 10 mm diametru. Ceilalti streptococi viridans sunt rezistenti la Optochin sau formeaza o zona de inhibitie foarte mica.

Biloliza: in doua eprubete se pipeteaza cate 1 ml cultura in bulion din tulpina streptococica obtinuta in cultura primara. In prima eprubeta se adauga 1 ml bila sterila sau 1 ml solutie 10% de saruri biliare ( dezoxicolat de sodiu). In cea de a doua eprubeta se adauga 1 ml ser fiziologic steril. Dupa 30 min, in primul tub se observa clarificarea mediului, datorita lizei bacteriilor. Daca reactia ramane negativa, se pot introduce tuburile in termostat, la 37 ^O C , apoi se repeta citirea.

Fermentarea inulinei - test biochimic facultativ, nefiind strict specific pentru pneumococ.

Aglutinarea cu seruri antipneumococice si cu seruri specifice de tip este o metoda rapida de identificare a antigenelor capsulare. Se efectueaza prin metoda latex-aglutinarii.

Reactia de umflare a capsulei - se realizeaza pe lama, prin punerea in contact a1-2 colonii bacteriene cu ser antipneumococic.

Antibiograma este necesara. Desi pneumococii sunt sensibili la Penicilina, alte beta lactamice, macrolide, etc, exista un procent de aproximativ 10% tulpini intermediar sensibile si rezistente la aceste antibiotice.