Detectarea micotoxinelor hepatotoxice la pacienti cu ciroza hepatica

Detectarea micotoxinelor hepatotoxice la pacienti cu ciroza hepatica

C. Hutanasu¹, C. Sfarti¹, Anca Trifan¹, Camelia Cojocariu¹, A. Spac², M. Apostu³, V. Dorneanu³, C Stanciu¹

Universitatea de Medicina si Farmacie "Gr. T. Popa" Iasi - Facultatea de Medicina Generala - Disciplina de Semiologie Medicala, Institutul de Gastroenterologie si Hepatologie Iasi

Universitatea de Medicina si Farmacie "Gr. T. Popa" Iasi - Facultatea de Farmacie - Disciplina de Chimie Fizica

Universitatea de Medicina si Farmacie "Gr. T. Popa" Iasi - Facultatea de Farmacie - Disciplina de Chimie Analitica

HIGH BLOOD AND URINE CONCENTRATION OF HEPATOTOXIC MYCOTOXINS (AFLATOXIN B1, STERIGMATOCYSTIN) IN PATIENTS WITH LIVER CIRRHOSIS (Abstract): Aflatoxins and sterigmatocystin are potent carcinogens, certainly involved in pathogenesis of liver cancer. AIMS. To evaluate the risk of mycotoxin intake and to determine the presence of aflatoxin B1 (AFB1) and sterigmatocystin (STC) in patients with liver cirrhosis. METHODS. The study included 92 patients (33 controls, 59 liver cirrhosis) that completed a food frequency questionnaire (FFQ). Blood and urine samples were collected and mycotoxins determined by high performance liquid chromatography. RESULTS.18,18% samples in controls and 72,88% in cirrhosis group presented detectable levels of mycotoxins. The mean values of AFB1 in blood were 0,7 ng/ml in controls and 1,67 ng/ml in test group (p=0,11); STC presented 60 times higher levels in second group (p<0,01). AFB1 presented a mean level of 1,2 ng/ml in urine of test group (not detected in controls); STC presented 256 time higher concentration in urine of cirrhotic patients, with a perfect correlation between blood and urine levels in control (r=1) and no correlation in test group (r=0,05). There were no correlations between mycotoxin, liver enzymes, ά-fetoprotein and mycotoxin intake risk estimated by FFQ. CONCLUSIONS. Most of the patients presented detectable levels of mycotoxins, significantly increased in cases with liver cirrhosis, probable due to a specific metabolic pattern.

Key words: AFLATOXIN B1, STERIGMATOCYSTIN, LIVER CIRRHOSIS, HPLC

INTRODUCERE. Micotoxinele sunt produsi toxici de metabolism ai fungilor, a caror prezenta in alimentele de larg consum nu poate fi prevenita (1-2). Dintre micotoxine se remarca aflatoxina B1 (AFB1), substanta cu cel mai puternic efect carcinogen hepatic (carcinogen de ordinul I), considerata agent etiologic principal al carcinomului hepatocelular (CHC) in unele zone din Africa si Asia (2,3). Sterigmatocistina (STC) este un precursor al AFB1, conversia intre cele doua forme fiind independenta de prezenta unui sistem enzimatic (4). Avand in vedere faptul ca o proportie insemnata dintre CH (circa 10%) nu au o etiologie clara (5), precum si faptul ca micotoxinele pot induce leziuni hepatice severe (2,6), este utila investigarea legaturii dintre intoxicatia cronica cu micotoxine si procesul de generare a CH, la ora actuala neexistand date care sa evalueze impactul acestora asupra evolutiei hepatopatiilor cronice.

SCOP. Studiul a urmarit evaluarea riscului de ingestie a micotoxinelor de catre pacientii internati, determinarea prezentei acestora in produse biologice recoltate de la cazurile cu afectare hepatica avansata si stabilirea rolului lor in producerea acestei afectari.

MATERIAL SI METODA. In studiu au intrat 92 pacienti, divizati in doua loturi: 33 de pacienti fara afectare hepatica cronica semnificativa (varsta medie - 57,83 ani); 59 de pacienti, diagnosticati cu CH (varsta medie - 57,24 ani). Toti pacientii au declarat obiceiuri alimentare constante in ultimul an si au semnat un consimtamant de participare. De la toti pacientii au fost recoltate 20 ml de sange periferic pe EDTA si 50 ml de urina. Folosind metoda chimiei umede (Hitachi), au fost determinate enzimele de citoliza hepatica (TGP, TGO) si de colestaza (FA, GGT), precum si α-fetoproteina serica (AFP) prin electrochemiluminiscenta (Modular E 170).

Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC). S-a folosit un cromatograf de lichide tip HP 1090 cu detectie simultana in UV la 251 nm si in fluorescenta (excitatie la 228 nm si emisie la 423 nm) prevazut cu o coloana C18 tip Zorbax (15 cm x 4,5 mm, 5 µm), cu o faza mobila formata din amestec acetonitril : metanol : apa (99 : 99 : 2) la un debit de 0,7 ml/min, conform metodei descrise anterior (13), dupa precipitarea proteinelor din sange cu acetonitril, purificare cu izooctan, extractie cu cloroform si reluarea reziduului obtinut, dupa evaporarea la sec, cu metanol. Folosind ecuatia curbei de calibrare obtinuta la studiul liniaritatii din cadrul validarii metodei de analiza, utilizand solutii de AFB1 si STC in concentratii cunoscute, s-a calculat concentratia in micotoxine din probele de sange recoltate de la pacienti. Precizia metodei (RSD) este de 16,9629% cu o regasire medie de 99,2%.

Chestionarul de frecventa alimentara (CFA). Chestionarul a fost alcatuit din 23 de intrebari de tip complement simplu, cu 6 variante de raspuns si a evaluat obiceiurile alimentare de baza, gradul de ingestie a alimentelor considerate cu risc maxim de contaminare directa cu micotoxine (fructe oleaginoase, cafea, porumb, condimente), si al alimentelor de baza (lactate, carne, oua) - cu risc de contaminare indirecta, prin consumul hranei afectate de catre animale. S-a alcatuit ulterior un scor de evaluare a riscului, comparat cu datele obtinute la analiza probelor biologice.

Analiza statistica a datelor. Datele obtinute au fost introduse intr-o baza de date in SPSS v. 1.3, program cu care s-au efectuat testele statistice.

REZULTATE. Nu s-a reusit stabilirea unor profiluri distincte de risc pentru ingestia de micotoxine prin metoda chestionarului de frecventa alimentara. Toti participantii la studiu au dat raspunsuri similare, fara a se putea atribui pacientilor cu CH un regim alimentar diferit fata de martor. Din totalul de 184 probe analizate, 61 (33,15 %) au prezentat nivele detectabile de micotoxine: 47,45% in lotul cu CH si 7,57% in lotul martor (tabelul I). Cel mai frecvent a fost detectata STC (23 probe de urina, 17 de sange).

TABEL I.

Repartitia probelor depistate pozitiv

La lotul martor, concentratia medie a AFB1 a fost de 0,7 ng/ml in sange, aceasta nefiind detectata in urina. Nivelele medii de STC au fost de 0,0115 ng/ml in sange si 0,0041 ng/ml in urina. In lotul cu CH, AFB1 a avut o concentratie medie de 1,68 ng/ml in sange si 1,20 ng/ml in urina, iar nivelul mediu de STC fost de 0,63 ng/ml si respectiv 1,05 ng/ml. Se constata diferente semnificative statistic intre nivelele medii ale micotoxinelor urinare la cele doua loturi, precum si intre concentratiile medii ale STC plasmatice (tabelul II). La lotul martor, nu s-a putut stabili o corelatie intre valorile AFB1 in sange si urina, datorita absentei acesteia in urina. Se remarca insa corelatia pozitiva perfecta intre variatiile STC in cele doua produse biologice testate (r=1). La lotul cu CH, nu se poate stabili o corelatie semnificativa intre nivelele de micotoxine detectate in sange si urina (r<0,3).

TABELUL II.

Corelatia dintre nivelul micotoxinelor (ng/ml) determinate in sange

si urina la cele doua loturi

^*coeficientul de corelatie (testul Pearson); **nedeterminabil datorita absentei probelor pozitive la martor

La o valoare considerata normala a laboratorului de 7 ng/ml, in lotul martor s-a inregistrat un nivel mediu al AFP de 4,74 ng/ml si de 14,89 ng/ml la pacientii cu CH. Gradul mare de dispersie a valorilor in lotul cu CH face insa ca diferenta sa nu atinga pragul de semnificatie statistica (p=0,09). Nivelul mediu al TGP a fost de 65,43 UI/L in lotul martor si de 69,13 UI/L in lotul cu CH (p=0,43), in timp ce pentru TGO s-au inregistrat valori medii de 44,93 UI/L si respectiv 87,97 UI/L (p=0,003). GGT si FA au avut valori medii de 166,73 UI/L la martor si 146,19 la lotul cu CH (p=0,17), respectiv 56,83 UI/L si 159,42 UI/L pentru FA (p=0,004).

S-a efectuat testul Pearson pentru determinarea corelatiei variatiilor concentratiei de micotoxine cu cele ale AFP si enzimelor hepatice (tabelul III). Desi la pacientii cu CH atat valorile micotoxinelor, cat si cele ale AFP si enzimelor hepatice sunt mult mai ridicate, nu s-a putut stabili o corelatie directa intre parametrii mentionati, coeficientul de corelatie avand valori apropiate de 0. Exceptie face relatia dintre TGO si STC urinara, unde s-a inregistrat o slaba corelatie pozitiva (r=0,38).

TABELUL III

Analiza statistica a variatiilor parametrilor hepatici in raport cu nivelul de

micotoxine la cele doua loturi

nu s-a putut calcula corelatia datorita nivelului mic/absent de micotoxina; ⁺ concentratia de micotoxina exprimata in ng/ml; ^d comparatie statistica intre cele doua loturi (t-Test)

DISCUTII. Numeroase studii au pus in evidenta metaboliti ai micotoxinelor in urina pacientilor, mai ales in zonele cu risc major de contaminare a alimentelor sau cu incidenta crescuta a hepatocarcinomului. Determinarea formelor parentale ale micotoxinelor a fost folosita ca marker de intoxicatie acuta, acestea avand un timp de injumatatire de aproximativ 48 de ore (2,7). Metodele traditionale de evaluare a intoxicatiei cu aflatoxine sunt reprezentate de determinarea produsilor de metabolism in urina - pentru intoxicatia acuta (7,8) si a adductilor AFB1-albumina in plasma sau compusilor AFB1-N⁷-guanina in urina - pentru intoxicatia cronica (2,8,12). Prin determinarea formelor parentale prin metode de o mare sensibilitate, studiul nostru a urmarit punerea in evidenta si cuantificarea nivelului "cronic" de expunere al pacientilor, date care la ora actuala nu sunt disponibile in tara noastra si sunt foarte putin reprezentate in literatura de specialitate. Prin chestionarul alimentar, s-a incercat determinarea indirecta a gradului de intoxicatie cronica prin ingestia de alimente cu risc major de contaminare cu micotoxine, fara a se pune insa in evidenta un risc crescut la pacientii cu CH. In afara gradului inerent de imprecizie a metodei (10), motivatiile ar putea fi reprezentate de loturile mici de pacienti care nu au permis o analiza statistica de amploare sau de completarea retrospectiva a chestionarelor, cuprinzand modificarile induse in stilul de alimentatie de diagnosticul de CH, fapt care poate limita acuratetea datelor introduse. Pe de alta parte, este posibil ca principiile alimentare cu risc de contaminare consumate de pacienti sa fie similare cantitativ, dar gradul de contaminare, determinat de modul de productie, ambalare si conservare, sa difere semnificativ.

Pentru prima data in tara s-a reusit demonstrarea clara a aportului constant de micotoxine, prin detectarea acestora in probe biologice recoltate de la om. Probele pozitive la lotul fara afectare hepatica arata expunerea generala, rezultatele nefiind influentate de conditii patologice asociate. Atfel, sunt mult mai semnificative nivelele crescute de toxine depistate la pacientii cirotici. Chiar in conditiile in care etiologia principala a CH a fost reprezentata de virusuri si etanol, nivelele crescute de micotoxine demonstreaza actiunea continua a unui factor suplimentar de risc la pacientul cirotic. Lipsa corelatiei dintre testele functionale hepatice si nivelul AFP (ca marker de regenerare hepatica) cu nivelele de micotoxine la pacientii cirotici, precum si absenta unor date care sa indice un nivel crescut de ingestie a acestora la acesti pacienti duc la concluzia ca intoxicatia cronica cu micotoxine nu este un factor determinant al procesului cirogenetic, fiind dificil de estimat daca nivele crescute de forme parentale depistate in lotul cu CH reprezinta cauza sau mai degraba consecinta acesteia. Cand micotoxina a fost prezenta atat in sangele cat si in urina lotului martor, cum este cazul STC, a existat o concordanta perfecta intre cele doua seturi de valori (r=1), sugerand o relatie puternica intre aportul si eliminarea toxinei la persoanele cu functie hepatica normala. Lipsa concordantei intre valorile depistate in sangele si in urina pacientilor cirotici indica o particularitate de metabolizare a toxinei in acest caz. Fenomenul poate fi explicat printr-un deficit de absorbtie la nivel intestinal (congestia mucoasei in contextul hipertensiunii portale) sau prin scaderea ratei de metabolizare hepatica a toxinei (in contextul insuficientei hepatocelulare), care determina o eliminare crescuta a formei parentale. Prezenta unei cantitati apreciabile de AFB1 in urina pacientilor cu CH sugereaza acelasi lucru, mai ales in contextul absentei totale a acesteia la lotul martor, unde probabil a fost metabolizata hepatic.

CONCLUZII. Pentru prima data in tara este pusa in evidenta ingestia constanta de micotoxine hepatotoxice si caracterul cronic al intoxicatiei. Concentratia de micotoxine este semnificativ mai crescuta la pacientii cirotici, ca urmare a unei particularitati de metabolizare a micotoxinelor, nefiind demonstrat un nivel crescut de ingestie fata de  lotul fara ciroza hepatica.

Bibliografie

Bennett JW, Klich M. Mycotoxins. Clinical microbiology reviews

Eaton DL, Groopman JD. The toxicology of aflatoxins: human health, veterinary, and agricultural significance San Diego, Academic Press, 1994

DeVries HR, Lamplugh SM. Aflatoxins in liver biopsies from Kenya. Trop Geogr Med 1989; 41: 26-30

Singh R, Hsieh DP. Enzimatic conversion of sterigmatocystin in to aflatoxin B1 by cell-free extracts of Aspergillus parasiticus. Appl Environ Microbiol 1976;31;5:743-5

Pascu O. Cirozele hepatice. In Grigorescu M editor. Tratat de Hepatologie. Bucuresti, Romania; Ed. Medicala Nationala 2004

Tandon BN, Krishnamurty L, Tandon HD, Ramaligswami V, Bhandari JR, Mathur MM et al. Study of an epidemic jaundice, presumably due to toxic hepatitis in Northwest India. Gastroenterology 1977; 72: 488-494

Mykkanen H, Zhu H, Salminen E, Juvonen RO, Lin W, Ma J, Polychronaki N et al. Fecal and urinary excretion of aflatoxin B1 metabolites (AFQ1, AFM1 and AFB-N⁷-guanine) in young Chinese males. Internat J of Canc 2005; 115; 6: 879-884

Said HB, Awad A, Mostafa M, Shank R. Novel adenine adducts, N⁷-guanine-AFB1 adducts and p53 mutation in patients with schistosomiasis and aflatoxin exposure. Cancer detection and prevention 2006; 30; 6: 491-498

Van Rensburg SJ, Cook-Mazaffari P, van Schalkwyk DJ, van der Watt JJ, Vincent TJ, Purchase IF. Hepatocellular carcinoma and dietary aflatoxin in Mozambique and Transkei. Br. J. Cancer 1985; 51:713-720.

Ritenbaugh C, Aickin M, Taren D, Teufel N, Graver E, Woolf K et al. Use of food frequency questionnaire to screen for dietary eligibility in a randomized cancer prevention phase III trial. Cancer Epidemiol Biomarker Prev 1997, 6; 5: 347-354

Mandravel C, Stanescu-Dumitru R. Metode fizico-chimice aplicate la masurarea noxelor in mediul professional. Editura Academiei Romane, Bucuresti, 2003

Chen SY, Chen CJ, Tsai WY et al. Associations of plasma aflatoxin B1-albumin adduct level with plasma selenium level and genetic polymorphisms of glutathione S-transferase M1 and T1. Nutr Cancer 2000; 38:179-85

Bulea Delia, Spac A, Dorneanu V. Determinarea Ochratoxinei A din cafea boabe prin metoda HPLC. Fungi & Mycotoxins 2008, Vol. 2, No. 1, 157 - 163