BIOLOGIA DEZVOLTARII

BIOLOGIA DEZVOLTARII

Ce este echivalenta genomica, unde a fost demonstratea experimental si cu ce tipuri de nuclei?

Echivalenta genomica este reprezentata de toate celulele care contin genomul complet al unui zigot si au ceeasi informatie genetica cu a zigotului insa celulele sunt diferite si sunt caracterizate prin produsii genetici diferiti.

Aceasta a fost demonstrata in 1997 de catre Ian Wilmut de la Institutul Roslin din Scotia folosind urmatoarele tipuri de nuclei: pentru clonarea oi Dolly s-au folosit nuclei somatici si pentru clonarea soarecinlor : nuclei de neuroni, nuclei d ecelule Sertoli si nuclei de celule Cumulus cophorus.

Enumerati anomalii asociate clonarii.

Anomalii asociate clonarii sunt: obezitatea, placenta marita, tumorii pulmonare si renale, malformatii cardiace; fiind determinate epigenetic.

Apar si abateri de la regula echivalentei genomice in care are loc metilarea aberanta a ADN-ului rezultand diminuarea numarului de cromozomi.

Ce intelegeti prin reprogramare nucleara?

Reprogramarea nucleara reprezinta inducerea unor modificari in activitatea genelor induse experimentalprin introducerea unor nuclei intr-un mediu citoplasmatic nou. Adica activarea unor gene inactive in cersul diferentierii embrionale.

Care este diferenta dintre o celula specificata si una determinata?

Celula determinata are capacitatea de a se divide activ pentru a genera o clona celulara.

Celula specificata are capacitatea de a se diferentia autonom intr-un mediu neutru si destinul acesteia poate fi modificat de celulele vecine.

Cum se mentine starea determinata pe parcursul diviziunilor celulare?

Starea determinata pe parcursul diviziunii celulare se mentine cu ajutorul memoriei celulare care este de 2 tipuri: memorie citoplasmatica ( freeback pozitiv) si memorie nucleara.

In citoplasma exista un ansamblu de proteine care controleaza activitatea genelor. In cazul memoriei citoplasmatice se considera ca prima celula determinata e activata de o gena care produce un factor transcriptional care are capacitatea de a se lega de propriul promoter insa aceasta proteina se poate lega si d epromoterul altor gene pe care le activeaza sau le blochiaza.

Memoria nucleara depinde de modificari intrinseci ale genomului implicand mentinerea unor anumite modele de gene active si inactive. Aceasta memorie permite expresia a 2 gene diferite chiar daca ele sunt expuse la acelasi mediu citoplasmatic.

Ce este transdiferentierea? Exemple. Prin ce se deosebeste de dediferentiere?

Transdiferentierea este un proces observat in tesuturile regenerante und eun tip de celula se poate modifica in lat tip de celula inrudita.

Exemplu: regenerarea cristalinului de triton care s eface prin recrutarea celulelor din regiunea dorsala a epiteliului picmentat al irisului.

In cultura celulele picmentare retiniene prezinta in polul apical microvili si in citoplasma granule de picment. Daca in mediul d ecultura se adauga hialuromidaza, ser fetal si fenil-tiureecelulele pierd micrivilii si pigmentul. Daca in continuare se adauga acid ascorbic celulele se transdiferentiaza in celule cristaliniene care produc proteine " cristalin".

Transdiferentierea are loc intotdeauna intre celulele inrudite, iar dediferentierea are loc intre celule neinrudite.

Care este diferenta dintre motivele zinc-finger ale factorilor transcriptionali din clasele: C2H2, receptori nucleari, GATA si LIM?

Clasa C2H2:moleculele de zinc finger joaca un rol important in stabilizarea domeniilor scurte prin interactii ionice ce implica 2 resturi de Cys dintr-o structura antiparelela β si 2 resturi de Hys dintr-un α- helix.

Receptorii nucleari (C4) contine 2 motive zing finger asociate cu 4 resturi de Cys. Aminoacizii de la baza α-helixului inpreuna cu primul motiv zinc-finger sunt pozitionati in adancitura majora a ADNului si interactioneaza cu promoterul. (Rbox). Amoniacizii de la baza structurii β a celui de al 2 lea motiv zinc-fingersunt implicati in dimerizare. (Dbox).

Clasa GATA: recunoaste o secventa consens G, A,T, A si se leaga la ADN prin intermediul a 2 motive zing-finger in care Zn este asociat cu 4 Cys.

Clasa LIM: acest domeniu este format din 2 motive zinc-finger unite intr ele prin 2 aminoacizi zincul fiind asociat cu 3 Cys si o Hys in primul motiv, iar in al 2 lea de 3 Cys si un acid aspatic.

Enumerati factorii transcriptionali ce contin motive: zinc-finger, leucin-zipper, HLH si HTH.

Zing-finger: Leucin-zipper:

Clasa C2H2: TFIIIA, Kruppel AP-1

Clasa C4 C/EBP: LAP si LIP

Clasa GATA

Clasa LIM

HLH: HTH:

MyoD Clasa factorilor transcriptionali cu homodomeniu:

Mif 5 Pou, PBC, RXD

Clasa PAX, FOX, ETS si TEA

Definiti termenul de potentare genica.

Potentarea genica este procesul in care fcatorii transcriptionali se leaga de genele foitei embrionare inaintea exprimarii lor sau inainte sa se exprime ca gene specifice.

Indicati factorii transcriptionali care se lega sub forma dimerica si monomerica de ADN?

Factorii transcriptionali care se leaga la sub forma dimerica si monomerica de ADN:

Sub forma monomerica: Sub forma dimerica:

Kuppel Clasa C2H2:FTIIIA

GATA Clasa C4

Factorii transcriptionali cu homodomeniu: Pou Clasa Leucin-zipper:AP-1, C/EBP

HTH: ETS si FOX HLH

Clasa MADS BOX

Indicati factorii transcriptionali care depind de cofactori transcriptionali.

Factorii transcriptionali care depind de cofactori transcriptionali sunt factori clasei C4, adica receptorii nucleari.

Ce factori transcriptionali contacteaza fosa majora din ADN? Dar pe cea minora?

Cei care contacteaza fosa majora: Cei care contacteaz afosa minora:

Clasa Leucin-zipper Clasa C4

Clasa C4 Clasa HTH: REL, T-BOX, MADS-

Clasa HTH DOX, HMG si FOX

Daca in celule exista urmatoarele proteine: Id, MyoD, Myf5, Rb, AP1, ce fac ele, prolifereaza sau se diferentiaza? Explicati de ce.

Se diferentiaza deoarece proteina Id se leaga de Myo D, Mif 5 blocand accesul la ADN. Proteinele AP1 si Rb interactioneaza, initiaza si mentin starea diferentiata impidicand celulele sa revina in ciclul celular.

Cand receptorii pentru factorii de crestere nu mai sunt prezenti in membrana se sintetizeaza o cantitate mare de Myo D si Mif 5 car se pot lega la proteina E12 si E47 si induc diferentierea celulara, in timp ce altele se leaga la AP1 siRb blocand diviziune a celulara.

Ce factori transcriptionali sunt activati dupa fosforilare?

Urmatorii factori sunt activati dupa fosforilare: Foactorii transcriptonali Kruppel calsa HTH cu homodomeniu; Clasa HTH: ETS, FOX si REL.

Indicati un tip de factor transcriptional sechestrat in citoplasma in forma inactiva si precizati mecanismul de activare.

Clasa REL care este reprezentata de catre proteinele p50(NFkB1) si p52(NFkB2). Ambele proteine pot formahomo sau heterodineri. Dimerii care contin proteine neprocesate raman sechestrati in citoplasma . Inaintea activarii, in citoplasma se pot gasi 2 tipuri de complexe proteice Rel neprocesate:

heterodimeri formati dintr-o proteina Rel matura si un precursor proteic Rel neprocesat

homo- sau heterodimeri Rel asociati cu un membru al familiei de proteine inhibitoare IkB

Exista cel putin doua mecanisme prin care proteinele IkBinterfera cu functia NFkB:

IkB poate retine complexele NFkB/Relin citoplasma, prin mascarea secventei de localizare nucleara, localizata la capatul C-terminalal regiunii omoloage

Prin inhibarea directa a legarii de secvente specifice din ADN.

Pentru a-si exercita functia activatoare transcriptionala, NfkBtrebuie sa disocieze de IkB.

In prezent s-au propus doua modele de activare a acestuia:

degradarea IkB este precedata de activarea unui set de serin kinaze care fosforileaza IkB din domeniul reglator, N-terminal. Dupa fosforilare IkB este recunoscuta de enzime asociate cu ubiquitina la lizinele N-terminale. Ubiquitinilarea determina disocierea NF-kB de complexul IkB-ubiquitinasi care este translocat la proteozomi si degradat.

Peptidele fosforilate pe resturile de tirozina sunt recunoscute de domeniile SH2 ale proteinelor de semnalizare celulara. Astfel, fosforilarea tirozinei din domeniul reglator N-terminal, determina recunoasterea IkB de catre domeniile SH2

Indicati categorii de factori transcriptionali care coopereaza in procesul transcriptional. Exemple de interactii.

Factorii transcriptionali care coopereaza in procesul transcriptional sunt cei din clasa MADS-Box si cei din clasa HLH.

Proteinele din clasa MADS-Box interactioneaza cu proteine din clasa HLH astfel activand transcrierea.

Indicati mecanisme de remodelare a cromatinei. Ce mecanisme asigura activarea transcriptionala si care blocarea transcriptionala?

Mecanisme de remodelare a cromatinei: metilarea AND care blocheaza transcrierea genelor si acetilarea histonelor care activeaza transcrierea genelor.

Ce intelegeti prin intiparire genomica? Cand are loc? Prin ce mecanisme se realizeaza?

Intiparirea genomica reprezinta procesul de blocare a genelor autozomale in functie de originea lor gametica. . Acest process are loc in cursul diferentierii celulelor germinale permitand expresia unor gene numai din genomul matern sau patern realizandu-se prin metilare.

Care sunt mecanismele de compensare a dozajului?

Exista 3 mecanisme de compensare a dozajului:

a)     Absenta dozajului- este caracteristica pentru genele care apartin unei familii multigenice raspandite in tot genomul sau la genele care se exprima doar la un sex.

b)     Intensificarea activitatii genelor in cromozomii X

c)     Reducerea activitatii genelor in unul din cei doi cromozomi X.

Ce este compensazomul?

Compensazomul reprezinta un complex heteromeric care este format din 5 gene: msl1, msl2, msl3, msl4 si mof de tip mutant.

Enumerati rolurile localizarii ARNm.

Localizarea ARNm permite:

evitarea exprimarii gresite a unui ARNm

impiedicarea formarii heteromerilor in celule care exprima mai multe izoforme ale unei proteine

asigurarea polaritatii unei celule sau a unui embrion

asigura un control mai bun al traducerii locale

Enumerati si definiti mecanismele de localizare a ARNm.

Transportul nucleocitoplasmatic este un mecanism eficient de localizare a ARNm , acesta implica exportarea transcriptilor drintr-o regiune a nucleului si apoi localizarea precum si ancorarea lor in citoplasma adiacenta.

Exportul mitocondrial: ARN ul produs de genomul mitocondrial este sechestrat in partea posterioara a citoplasmei ( Rb Nu Prot) unde se asociaza cu granulele polare din polul posterioar.

Controlul spatial al stabilitatii ARNm: este un mecanism simplu insa neeficient si consta in faptul ca ARNm localizat corespunzator este stabilizat, iar cel localizat necorespunzator este degradat.

Ancorarea ARNm la componentele localizarte anterior: acest mecanism implica ARN oskar (osk) care este prezent in toate ovocitele de la Drosophila nu mai la polul posterior si este asociat cu granulele polare, dupa fecundare ARN osk din celula este tradus.

Transportul citoplasmatic dorectionat: acest mecanism implica un aRN specific bazei mielinice cuplat cu un florocrom formandu-se o particula fluorescenta si s epoate observa deplasarea din regiunea perinucleara in prelungirile oligodentritice.

Transportul dintr-un tip d ecelula in altul: acest mecanism este foarte evident la Drosophila unde ARNm materne sunt sintetizate in celule nutritive si apoi transportate in ovocit pentru a fi localizate. Transportul intracelular depinde de existenta canalelor inelare si a microtubulilor.

Cum se poate regla traducerea prin intermediul proteinelor?

Reglarea traducerii prin intermediul proteinelor se paote face prin raspunsul la concentratia de fier intracelular si depinde de prezenta a cinci elemente IRE localizate in 3'UTR.

Un elent IRE contine o secventa bogata in UA care este considerata situs de recunoaste pentru ribonucleaze. (RbNu).

In prezenta unei concentratii mari de fier IRE nu se poat lega de ARNm si este recunoscut de RbNu si apoi degradat. Daca concentratia de fier este mica IRE se leaga la ARNm si mascheaza secventa de recunoastere de RbNu fiind tradus si stabilizat.

Explicati cum se poate bloca functia unui ARNm in cursul embriogenezei si experimental.

Functia ARNm in embriogeneza poate fi blocata prin reglari la nivelul traducerii ARNm.

Blocarea functiei ARNm experimental se poate face prin: injectarea unui ARNdc, incubarea nematodelor in domenii ce continARNdc si prin hranireacu E.coli producator de ARNm.

Enumerati (in ordinea activarii lor) categoriile de gene care actioneaza in cursul dezvoltarii embrionare la Drosophila.

Gene coordonatoare materne:

Gene zigotice:

Care gene zigotice de la Drosophila sunt activate de factori transcriptionali si care folosesc alte mecanisme (ce mecanisme)?

Genelw zigotice activate de catre factorii transcriptionali sunt genele perchi si genele domeniilor nerepetitive. Activarea genelor polaritatii segmentelor depende de produsii genelor perechi. Adica gena en se exprima nu mai in celulele care contin genele ftz si eve.

Care sunt consecintele moleculare embrionare in urmatoarele situatii (indicati cum sunt afectate procesele embrionare in aceste situatii) :

a.     absenta proteinei nanos:duce la abdomenului cu exceptia tisonului, embrionii ne avand celule polare, acestia fiind sterili

b.     difuzia proteinei gurken pe fata ventrala a ovocitului, in spatiul perivitelin ventral: Gena gurken si produsul ei proteic difuzeaza in spatiul perivitelin din regiunea dorsal: datorita faptului ca lingandul gurken poate difuza doar pe distanta scurta este receptionat de celulele foliculare situate deasupra nucleului in membrana carora exista un receptor tirozin kinazic numit torpedo. Interactia acestora activeaza calea de semnalizare a receptorilor tirozin kinazici necesara adoptarii unui destin dorsal. Adoptarea acestui destin dorsalinhiba exprimarea in celulele foliculare a genelor windbeutel, pipe si nudel.

c.      absenta proteinei knirps: determina pierderea segmentelor abdominale posterioare

d.     absenta proteinei even-skipped (eve): determina pierderea benzilor denticulare de pe segmentele pare

e.      absenta proteinei wingless (wg): In embrionul tarziu lipsa acesteia duce la pierderea aripilor. Regiunile anterioare ale parasegmentelor sunt inlocuite cu o imagine in oglinda a regunii posterioare a parasegmentului repectiv.

Dati exemple de mutatii homeotice, ce particularitate au aceste mutatii?

Mutatiile genelor homeotice produc fenotipuri bizarre in care o parte acorpului este inlocuita cu alta.

In mutatia Antennapedia antenele sunt inlocuite cu picioare. Acest complex este responsabil pentru confirmarea identitatii celor trei segmente ale capului si segmentele toracice T1 si T2 anterioare.

In mutatia Bithorax consta in transformarea halterelor intr-un segment toracic suplimentar, acesta mutatie confera identitate segmentelor T2 si T3 posterior si segmentelor A1-A8.

Definiti colinearitatea spatiala si temporala. Ordonati urmatoarele gene in functie de momentul exprimarii lor spatiale (de-a lungul axei antero-posterioare) si temporale: Hox c.12; Hox a.3; Hox d.1; Hox b.7; Hox a.6; Hox d.8; Hox c.5; Hox b.9; Hox c.11; Hox a.1; Hox. d.13.

Colinearitatea spatiala si temporala reprezinta corespondenta dintre odrdinea cromozamiala si exprimarea spatiala si temporala de-a lungul axei antero-posterioara. Adica, genele aflate la capatul 3' al grupurilor se exprima mai devreme si in regiunile anterioareale embrionului, in timp ce genele localizate in apropirea capatului 5' terminal se exprima progresiv, in domenii din ce in ce mai posterioare.

Ordonarea genelor in functie de momentul exprimarii lor spatiale: Hox a.1;Hox a.3 ; Hox a.6; Hox b.7; Hox b.9; Hox c5; Hox c11; Hox c.12; Hoxd.1;Hox d8 si Hox d13.

Mentionati care din urmatoarele gene se pot exprima in regiunea gatului si care in regiunea cozii unui embrion: Hox. a.1; Hox. d.13; Hox. a.12; Hox b.2; Hox d.1; Hox a.13.

Consideram urmatorul caz teoretic: Gena Hox c.11 se exprima in mezodermul vertebrelor sacrale. Conform caracteristicii dominantei posterioare ce vertebre vor fi afectate in cazul inactivarii acestei gene?

In cazul inactivarii genei HOX c.11 sunt afectate genele specifice regiunii anterioarare, adica zona vertebrelor toracale.

Enumerati genele Hox din grupul paralog 10.

Indicati care din urmatoarele gene sunt mai asemanatoare structural si functional: Hox. c.10; Hox c.11; Hox d.10; Hox c.12; Hox a.11

Genele asemanatoare structural si functional sunt: Hox c.10 cu HOX d.10 si genele HOX c.11 cu HOX a.11.

Definiti inductia prin apozitie si prin intermediul unui gradient morfogenetic. Exemple

Inductia prin apozitie se realizeaza intre doua straturi embrionare adiacente, in care un strate sursa molecularainductoare receptionata de stratul adiacent neangajat de catre o cale de dezvoltare si care in contact cu moleucleleinductoare se diferentiaza intr-o anumita directie. Exemplu: inductia mezodermului la mafibieni.

Inductia prin intermediulunui gradient morfogenetic se realizeazain interiorul unui strat embrionar in care sursa de molecule inductoare este localizatala extremitatea respectivului strat. Moleculele inductoare formeaza un gradient de concentratie de-a lungul stratului, celulele diferentiindu-se in functie de concentratia de morfogen din spatiul extracelular. Exemplu: inductia memebrelor la vertebrate.

Cum testati daca o molecula poate induce mezoderm?

Pentru a demonstra ca o molecula poate induce mezoderm se recolteaza un fragment mic de tesut din emisfera animala si se cultiva in vitro si se va forma ectoderm. Daca se pune tesutul in contact cu tesutul in emisfera vegetativa si s eexamineaza dupa cateva zile, se constata aparitia mezodermului care poate fi identificat histologic.

Prin ce mecanism actioneaza proteinele eliberate din organizatorul Spemann?

Proteinele eliberate din organizatorul Spemann sunt implicate in inductia mezodermului si sunt implicate in inhibarea cailor de semnalizare BMP siWNT.

Proteinele implicate in inhibarea caii de semnalizare BMP se leaga la linganzii BMP blocand legarea acestora la receptorii caii d esemnalizare.

Proteinele implicate in inhibarea caii de semnalizare WNT sunt reprezentate d ecatre proteinele Frizbee blocand legarea la receptorul specific caii de semnalizare.

Indicati moleculele implicate in formarea celor 3 axe ale membrelor la vertebrate si precizati zonele din care sunt eliberate.

Axa antero-posterioara: formarea acesteia depinde de moleculele eliberate din zona de activitate polarizata (ZAP) localizata la marginea posterioara a mugurelui in contact cu peretele corpului.

Axa dorsal-ventrala: formarea ei depinde de molecule eliberate din ectodermul dorsal. Aceste molecule sunt reprezentate de WNT 7a.

Axa posterior-dorsala: formarea ei depinde de moleculele eliberate dincreasta ectoapicala: FGF.

Enumerati caile de semnalizare embrionara si moleculele implicate in fiecare cale cu precizarea functiei acestora.

1.Calea de semnalizare WNT: e implicata in proliferarea, specificarea si determinarea celulelor embrionare. Toate proteinele WNTsunt secretate extracelular si actioneaza prin intermediul unor receptori corespunzatori, iar cel mai cunoscut lingand este proteina wingress (ws).

Componentele caii de semnalizare:

proteoglicani:se presupune ca acestia prin intermediul lanturilor glicoz-amino-glicanice sechestreaza lingandul WNT in apropiereareceptorilor sau ca functioneaza ca un coreceptor formand un complex proteoglican-lingandWNT-receptor.

Receptori Frizzled: are o regiune extracelulara care contine un domenu de legare, 7 domenii transmembranare si o regiune citoplasmatica. Se presupune ca semnalul e transmis prin recrutarea / eliberarea unor moleucle citoplasmatice.

Proteinele Dishevelled (Dsh): contin un domeniu N-terminal Dix, un domeniu bazic, un domeniu DEP si un domeniu PDZ. Dsh codifica pentru o proteina citoplasmatica ubicvista si poate fi o proteina adaptoare, necesara pentru asamblarea unui complex de semnalizare analog in calea de semnalizare RAS. Dsh este si o fosfoproteina, fosforilata intens pe resturile de serina si treonina in prezenta semnalului WNT.

Zeste-wthite(Zw3) / glicogen sintetaze kinaze 3(GSK 3): este o Ser /Tre kinaza citoplasmatica, inactivata de semnalizarea wg/WNT.

Proteina Amadillo: este o proteina bifunctionala sis epoate gasi fie la nivelul membranei plasmatice asociata cu caderine E si caterine α unde este implicata in adeziunea celulara.

APC: este oproteina multifunctionala care prezinta mai multe domenii functionale prin care interactioneaza cu microtubulii su cu alte proteine.

Proteina Pangolin/ TCF/ Lef-1: sunt factori transcriptionali HMG care s ecomporta ca represori, in absenta semnalului WNTdatorita acetilarii unei lizine N-terminale de catre proteine CPB.

2. Calea de semnalizare TGFβ

Aceasta cale de cale cuprind emai multi afctori de crestere polipeptidici, capabili de a controla un numar mare de procese celulare. Care includ: proliferarea, determinarea, migrarea, adeziunea si apoptoza. Principala molecula a caestei ca ia este reprezentata de catre proteina SMAD. Proteinele SMAD au fost impartite in 3 subfamilii:

proteine SMAD care reprezinta substrate directe pentru receptorii TGFβ

Co-SMAD: aceasta participa in semnalizarea celularaprin asociere cu receptorii reglati de SMAD

Anti-SMAD: inhiba functia semnalizatoare a celolalte doua proteine

3. Calea de semnalizare Hedgehog

Aceasta cale are rol important in procesele embrionare dar si post embrionare; implicata in repararea tesuturilor care au suferit leziuni.

Componentele caii se semnalizare Hh:

Receptorul Patched

Receptorul Smoothened: este asociat fizic cu Patched intr-un complex receptor si este activat prin legarea lingandului Hedgehog.

Proteina Costal 2 (Cos 2): este o proteina intudita cu kinaza si are rol de a se ancora un complex proteic la microtubuli.

Proteina Fused (Fu): este o Ser/Tre kinaza

Proteina Cubitus interruptus

4. Calea de semnalizare Notch-Delta

Componente caii;

Liganzii DLS: sunt reprezentati de proteine transmembranare. Contin o regiune extracelulara in care se gaseste o peptida semnal N-terminala, un domeniu DSL, o serie de receptori EGF si unele proteine contin o regiune bogata in cisteine; o regiune transmembranara si o regiune citoplasmatica scurta in care se poate gasi si o secventa PEST de degradare proteolitica rapida.

Receptorul LNG (LIN-12, Notch si Gilp-1): sunt proteine transmembranare. Contin o regiune extracelulara, o regiune transmembranara si o regiune citoplasmatica in care se gasesc sase repetitii ankirin, o secventa PEST si un semnal de localizare nucleara.

Efectorii transcriptionali

Care sunt consecintele moleculare in caile de semnalizare embrionare in cazurile de mai jos. Figurati in fiecare caz calea de semnalizare in respectiva situatie;

a.     Proteina Armadillo/b-Catenin nu prezinta domeniul central ce contine cele 13 repetitii armadillo: nu se mai formeaza un super helix care sa delimiteze o adancitura incarcata prin care β-Catenin interactiona cu regiuni acide ale caderinelor E,APC si Pangolin inhiband transcrierea genei tinta.

b.     Nu exista proteine Co-SMAD: in absenta acestora complexul receptor-SMAD-P nu mai dimerizeaza si nu se mai formeaza dimerii si nu mai are loc activarea transcrierii genelor tinta in calea de semnalizare TGFβ.

c.      Nu are loc adaugarea de colesterol la capatul N-terminal al peptidei N-terminale Hedgehog: in lipsa colesterolului capatul C-terminal numai catalizeaza si nu mai are loc procesul de ancorare in membrana precum nici legarea la receptorul Patched.

d.     Doua celule vecine exprima: una proteina Delta cealalta LAG-2. Ce cale de semnalizare este initiata?

Este initiata calea de semnalizare Notch-delta.

Enumerati si precizati principiul metodelor de detectare a apoptozei

Metode de detectare a apoptozei

1. Detectarea apoptozei pe baza morfologiei celulare

1. Detectarea apoptozei prin microscopia optoca

Detectarea celulelor apoptotice se poate realiza in microscopia optica prin colorarea cu Hematoxilina-eozina. In acest caz, citoplasma si nucleul celulelor moarte apar mai intens colorate decat in celulele viabile. Sensibilitatea metodei este relativ scazuta si poate fi folosita doar pe sectiuni.

2. Detectarea apoptozei prin microscopie electronica

In microscopia electronica, celulele apoptotice sunt mai greu de distins de celule la inceputul metafazei sau de o celula mica, bogata in proteine. Deoarece embrionii contin mai multa apa decat tesuturile adulte este necesara o fixare adecvata. Celula apoptotica trebuie sa indeplineacsa urmatoarele criterii in microscopia electronica:

inceputul apoptozei tipul celular este identificat prin prezenta aspectelor caracteristice de tipul miofibrilelor in cazul cardiomiocitelor

membrana plasmatica intacta

nucleu si citoplasma electrono-dense

inmugurirea celulei

prezinta vacuole mari

dezorganizarea citoplasmei

fragmentare nucleara

in stadii avansate apar corpii apoptotici

2. Detectarea apoptozei prin colorare vitala

Modificarile celulare ce conduc la expunerea fosfatidilserinei pe fata externa a cmembranei plasmatice sunt reflectate de o crestere modesta a permeabilitatii celulelor apoptotice, aspect care permitefolosirea colorantilor vitali pentru identificarea apoptozei.

Metoda este rapida si permite examinarea tridimensionala a mortii celulare. Prezinta un singur dezavantaj care este datorat faprului ca rezultatele sunt concludente doar daca embrionul ramane viu, daca moare numarul celulelor apoptotice vor creste. Metoda este folosita pentru detectarea apoptozei embrionare.

In aceasta metoda se folosesc trei coloranti vitali: Albastru de Nil, Acridin orange si Lyso Tracker Red.

A. Colorarea cu Albastru de Nil

Clorantul se acumuleaza in compartimentele acide ale celulelor, de tipul lizozomilor. Pentru observarea apoptozei in straturile profunde, embrionul poate fi congelat dupa colorare si sectionat pentru a fi observat la microscop. Celulele moarte sau in curs de apoptoza se coloreaza in albastru inchis.

B. Clorarea Acridin orange

Acridin orange este un colorant cationic, care se poate intercala in ADN sau ARN. Colorantul emite fluorescenta verde, cand este asocit cu ADN si rosie cand este asociat cu ARN. Este putin permeabil pentru celule si nu poate colora cromatina condensata. Metoda este eficienta pentru embrionii mici sau cei aflati la inceputul dezvoltarii, deoarece penetrarea colorantului poate fi o problema. Celulele normale nu preiau acest colorant insa corpii apoptotici se coloreaza intens.

Este o metoda rapida si usoara dar prezinta dezavantajul ca nu poate fi facuta o colorare fixa , preparatul fiind prelucrat rapid dupa colorare.

C. Clorarea cu Lyso Tracker Red

Prezinta o actiune similara Albastrului de Nil prin acumularea in compartimentele intracelulare acide si in regiunile unde exista o cantitate mare de activitate fagolizozomala rezulata din fagocitarea corpilor apoptotici de catre celulele vecine. LTR este un colorat cu o florescenta rosie si poate fi fixat cu aldehide penetrand usor tesuturile. Colorantul retine fluorescenta in tesuturile deschidratate in metanol si clarificate in alcool benzilic si benzonat de benzil. Acesta este folosit in microscopia confocala scanning pentru a evidentia o imagine 3D a mortii celulare in embrion.

Dificultatile tehnice ale LTR pot fi evitate prin monitorizarea corecta a colorarii. Colorarea trebuie realizata la 37 de grade C, intr-un mediu d ecultura care contine ser pentru a mentine viabilitatea. Fixarea trebuie realizata in 45 paraformaldehida sau 1% glutaraldehida. Fixarea cu paraformaldehida se realizeaza la 4 grade C iar cea cu glutaraldehida la temperatura camerei.

Dezavantajele LTR:necesita echipamente confocale scumpe; poate colora regiuni acide fara apoptoza, metoda ne fiind recomandata pentru celule care au in mod normal compartimente acide.

3. Detectarea fragmentarii ADN

Se poate realiza prin 3 metode: electroforeza, metoda TUNEL si metosa Comet.

a) Electroforeza

Aceasta este un adin cele mai folosite metode pentru detectarea fragmentarii ADN. Apoptoza este colrelata cu fragmenratrea internucleozamala a ADN.

Metoda este foarte potrivita pentru culturile celulare, insa nu este practica pentru a examina moarte celulara in cursul metamorfozei la insecte si amfibieni.

Eficienta detectarii nu este foarte buna, deoarece este nevoie ca 3% din celula sa fie in stadiul corespunzator al apoptozei.

b) Metoda TUNEL

Aceasta metoda permite marcarea oricarui capat 3' liber la ADN. Marcarea poate fi vizibila in celulele necrotice si in celulele mitotice in faza S. Majoritatea fragmentelor ADN sunt extrase din celulele necrotice si numarul de fragmentele Okasaki in celule aflate in faza S a ciclului celular este mai mic decat numarul capetelor libere dintr-o celula apoptotica. Astefel, aceasta metoda este relativa, din acest motiv necesitatea martorilor pozitivi si negativi este esentiala.

Metoda este folosita atat pe sectiuni inghetate sau incluse in parafina , fixate prin diferite tehnici inclusiv cu etanol/ acid acetic. Pricipiul d ebaz afiind cel de identificare a ADN fragmenatat.

Clivarea ADN furnizeaza fragmente de ADN dublu catenare si brese monocatenare. Aceste brese pot fi detectate prin marcarea enzimatica a capatului 3'-OH, cu nucleotide marcate cu biotina, digoxigenina sau fluoresceina. Enzimele marcate pot fi ADN polimeraza sau terminal deoxinucleotidil transferaza. I metoda ISNT, ADN polimeraza I catalizeaza adaugarea dependenta de matrita a nucleotidelor la bresa monocatenara de aDN. Aceasta reactie detecteaza nu numai ADN din celulele apoptotice dar si fragmentarea intamplatoare a ADN de catre endonucleaze.

Terminalul deoxinucleotidil transferaza este capabila sa mercheze independent de matrita, capetele breselor din ADN dublu catenar.

( continuare maine)

Raspuns intrebari referat

a)     Enumerati modificarile pe care le sufera fiecare tip de histona.

Modificarile pe care le sufera histonele sunt: metilarea, metilarea cu resturi de arginina, acetilarea, fosforilarea, ubiquitarea.

b)    Care modificari sunt asociate cu activarea si care cu blocarea
transcriptionala.