Efectele combinate ale amestecurilor de micotoxina pe functia de celule T umane

Efectele combinate ale amestecurilor de micotoxina pe functia de celule T umane.

Rezumat

Efectele combinate ale amestecurilor de micotoxine sunt de preocupare majora, cauzata de aparitia pe scara larga a expunerii umane la amestecuri. Datorita lipsei de date suficiente cu privire la functia imuna a a omului, scopul acestui studiu a fost de a specifica, evalua si sa prevede efectele combinate ale amestecurilor de micotoxina functionale la activitatea celulelor imune. Prin urmare,a fost aplicat un model de bine stabilite pentru studiile immunotoxice umane, folosind celulele sanguine mononucleare periferice (PBMC)stimulate. Pentru a estima efectul combinat al amestecului au fost utilizate concepte de concentrare plus si de reactie plus. Comparabil cu micotoxine individuale de amestec, acestea sunt suprimate de citokine de productie intr-un mod dependent de concentratie. Efectul amestecului a fost mai puternic decat efectele cauzate de toxinele aplicate individual. In plus, conceptul de raspuns a descris amestecul de date cu caracter experimental de incertitudine. Testul model   in vitro prezentat aici a fost util pentru a detecta si cuantifica efectele combinate. Efectele slabe de concentratii de micotoxine pot provoca efecte puternice inhibitoare asupra functiilor imune atunci cand apar impreuna. Experimentele de proiectare, utilizand conceptele de concentrare plus si de reactie plus, au fost potrivite pentru estimarea efectelor combinate micotoxinice in expertise de amestecuri functionale in vitro.

Introducere

Contaminarea alimentelor si a mancarii cu micotoxine (metabolisme secundare de mecegai) este o problema majora pentru sanatatea umana si animal. Ingerarea de micotoxine poate cauza o raza de raspunsuri toxice, de la toxicitare acuta la tulburari de sanatate pe termen lung sau cornice (revazut in Bennett si Klich, 2003). Tulburarile acute precum sindromul toxic cauzat de mucegai, micotoxicoza pulmonara sau sindromul de praf organictoxic au fost descrise(Khalili et al., 2005; May et al., 1986). Pentru tulburarile cornice, exista o asociere intre expunerea la micotoxina ochratoxina A si boala de rinichi neuropatie endemic Baklan, ale caror simptome sunt tumori la rinichi si tractul urinar (Clark si Snedeker, 2006), cat si intre inhalarea de aflatoxina si cancerul uman (Olsen et al., 2001). Micotoxina se poate comporta deasemeni ca agent imunosupresiv si poate creste susceptibilitatea bolii (Berek et al., 2001). Micotoxinele patrund de obicei in corp prin ingerare sau alimente contaminate, dar inhalarea sporilor toxigenici si contactul dermal direct sunt deasemeni cai importante de expunere (Bennett si Klich, 2003). Speciile de fungi ce contamineaza alimentele, ce se gasesc deasemeni si in locuinte sunt   Aspergillus si Penicillium (Flannigan et al., 1991; Jarvis si Miller, 2005; Blunden et al., 1991). Depinzand de conditiile de crestere, mai multe micotoxine pot fi produse de un singur tip de fungi, de ex.: Aspergillius si Penicillium , specii ce pot produce simultan citrinina, gliotoxina, ochratoxina A si patulin. Pentru toate aceste micotoxine au fost demonstrate proprietati immunomodulate. S-a aratat ca Gliotoxina poate suprima functiile macrofagilor cat si inhiba generatia de limfocite citotoxice T alloreactive si activarea NFkB in celulele T si B (Mullbacher si Eichner, 1984; Pahl et al., 1996). Efectele imunosupresive ale patulinei asupra sistemului imun celularal soarecilor si iepurilor au fost demonstrate (Escuola et al., 1996). Pentru ochratoxina A, inducerea de schimbari structurale precum reducerea marimii timusului ai descresterea maduvei osoase, pe langa alte schimbari functionale au fost demonstrate (Boorman et al., 1984; Gupta et al., 1983). S-a aratat ca citrina stimuleaza blastogenesis limfocotele in culturile celulelor splinei si creste raspunsul anticorpilor in cazul aplicatiilor interperitonale la soareci (Reddy et al., 1988).

Studii asupra efectelor toxice combinate pentru expunerea la amestecurile de micotoxine au fost efectuate folosind modele animale. Mai putine studii au raportat sistemul de testare in vitro pentru analiza toxicitatii amestecurilor micotoxice. Pentru analiza efectelor combinate au fost folositi diversi parametri toxicologici si procedure experimentale. De exemplu pentru folosind un soarece drept model, efectele sinergetice ale unei combinatii de citrina si ochratoxina A au fost observate in ceea ce priveste nevrotoxicitatea si carcinogeneza renala. Efecte suplimentare asupra manifestarilor embriotoxicitatii si durerii organelor pentru aceeasi combinatie au fost gasite in cazul embrionilor de pui. Diferite efecte imunobiologice au fost provocate de combinarea de aflatoxina B1 (AFB 1) si fumonisin B1 (FB 1) in comparatie cu actiunile individuale ale acelorasi toxine, au fost detectate la sobolani. De exemplu, macrofagii peritoniali de la animalele hranite cu AFB 1 au expirat mai putin hydrogen peroxidic, similar cu ceea ce s-a intamplat la asimilarea de FB 1. Oricum, Comsumarea de amestec AFB 1 - FB 1 a inversat aceasta descrestere in eliberarea de hydrogen paroxidic. Asadar, schimbarile in producerea de hydrogen peroxide nu au fost aditionale la efectele produse individual de aceste toxine. Nici unul din aceste studii nu a redat o teorie explicita despre ce inseamna aditionalitate si synergie. De obicei, evaluarile efecdtelor combinate ar trebui bazate pe comparatia unui effect asteptat al unui amestec bazat pe cunostinte despre comportamentul componentele individuale si efectele observate intr-un experiment cu aceste combinatii. Si, desi, exista mai multe modele pentru calcularea efectelor combinate asteptate, ex.: existenta adaugarii, petru aceleasi date despre amestecuri predomina. Din studiul prezentat mai sus, este evident ca necesitatea evaluarii amestecurilor este apreciata. In vivo studiaza efectele combinate, datorita lipsei de putere analitica pe subiect despre mai multe observatii despre amestecuri specific. Datorita numarului mare de posibile combinatii ce se pot intampla, este tipic, desi, ii lipseste o sfera previzibila. Pentru investigatii sistematice trebuie deci sa stabilim unelte si incercari biologice, cat si o parte despre prevederea modelului. Oricum, concept explicite despre cum a atrage dupa sine un effect combinat asteptat sunt necesare pentru a putea compara rezutatele gasite din diferite surse si pentru a folosi rezultatele pentru a prezice concentratii netestate in prospective riscului de intoxicare cu amestecurii micotoxinice. Numai cateva studii redau designul experimental potrivit pentru imperecherea unui effect individual si unuia combinat, oricum, sunt folosite diferite proceduri experimentale si statistice diferite. De exemplu efectele combinate ale perechilor micotoxinice bazate pe concentratii de inhibitie de 20% (IC20) au fost iliustrate in diagrame isobolice si calculate statistic, in timp ce cuburile corticale renale de porci in miniatura au fost analizate folosind o functie logistica pentru a testa efectele combinate synergetic sau antagonic, si in final folosind design factorial si suprafata de analiza [entru a studia interactiunea ochratoxinelor si a altor micotoxine asupra citotoxinelor in culturile renale porcine.

Din studii in toxicology si ecotoxicologie exista probe ca toxinele si chimicalele cu o concentratie mica ce compusi, poate duce la efecte toxice semnificante cand sunt aplicate impreuna. Asecte studii folosesc de obicei conceptele de prezicere de concentratii aditionale si raspuns additional pentru a analiza efectele combinate ale micotoxinelor. Folosind cele 2 concepte, o prezicere a toxicitatii combinatiilor bazata pe datele toxicitatii a componentelor individuale poate fi calculate. Avantajul acelor studii este acela ca presupunerile despre actiunea farmacodinamica a componentelor amestecate intrinsic in conceptele prevazute cuconcentratie aditionala si raspuns additional pot fi potrivite in in observatiile experimnentale si cu substante variate cu mod de actiune cunoscut.

Obiectivul acestui studiu este de a examina, specifica, evalua si prezice efectele amestecurilor combinate a 4 micotoxine, patulina, gliotoxina, citrinina si ochratoxina A asupra actiivitatii functionale a celulelor functiionale uname immune. Celulele mononucleare periferale umane (PBMC) interactioneaza intre ele si cu alte cellule prin intermediul cytocinelor. O cytocina, Interferon-gamma (IFN-y) este implicat in reglarea raspunsurilor inflamatorii si immune, si este produs in celulele natural T si celulele naturale criminale. Recruteaza leucocite la locul unei infectii, rezultand in cresterea inflamatiei si deasemenea stimularea macrofagilor pentru a omori bacteria ce a fost inghitita. PBMC poate fi strimulata pentru a produce IFN-y de catre anticorpi impotriva celulelor T receptoare si alteratiilor induse de micotoxinele lansate de IFN-y a PBMC ce a fost folosot pentru a determina efectul imunotoxic. Este sugerat ca conceptele de prezicere a efectelor combinate ale amestecurilor micotoxinelor pot fi folosite deasemeni productive pentru raspunsurile celulelor-baza imunologice.

2. Materiale si metode

2.1 Micotoxine

Citrinina [CAS RN 518-75-2] din Penicillium citrininum, gliotoxina [CAS RN 67-99-2] din Gliocladium fimbriatium, ochratoxina A [CAS RN 303-47-9] din Aspergillus ochraceus si patulina [CAS RN 149-29-1] au fost aduse din Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinfeld, Germania). Micotoxinele au fost mai intai dizolvate in methanol si apoi diluate in culture de cellule complete medii continand 0.05%(v/v)methanol. Controlul mediu a fost preparat cu 0.05% methanol fara micotoxine si a aratat tipic sau fara deviatii fata de cele netratate.

2.2 Testarea celulara

Celulele sangvine mononucleare umabe (PBMC) au fost isolate de mostrele de sange centrifugarea gradual a densitatii folosind Ficoll. Cum este obisnuit, nici o mostra contaminate nu a fost folosita. Celulule au fost modificate la densitatea de 1x10³ml¯¹RPMI 1640 continut mediu 5% caldura dezactivata ser de fat bovin. Aceasta suspensie de cellule a fost cultivate in 48 de recipient cu fundul perfect drept cu 1 ml/ stimulate cu anticorpi mononucleari la CD3 si CD28, fiecare la o concentratie finala de 100ng/ml. PBMC stimulate au fost expuse imediat la dilujari serilale cu citrinina, gliotoxina, ochratoxina A, patulina si o combinatie a acestora. Ceea ce s-a ridicat la suprafata a fost cules dupa 24 de ore si pastrat la 24 ore la -80˚C pana la masuratorile ELISA.

Experimentele au fost repetate de cel putin 6 ori in triplicate pentru fiecare micotoxina sau amestec si cu 6 controale pentru fiecare experiment. Pentru amestec o fost aleasa o cota fixa pentru analiza de raspuns la concentratie a amestecului de micotoxine. Cota este bazata pe valori individuale EC20 a celor patru componente.

2.3 ELISA

Concentratiile IFN-y in culturile recoltate au fost masurate de ELISA (OptEIA tm Kit, BD Bioscience, Heidelberg, Germany) urmand instructiunile fabricantului. Limita minima de detectie a fost 4pg/ml. 3,3' , 5,5' - Tetrametilbenzadina - a fost folosita ca substrat. Densitatea optica a fost masurata pe un cititor ELISA la o lungime a undei de 450nm. Datele au fost analizate cu EasyWin Kinetics 32. Rezultatele au fost expimate ca procente de productie cytocine ale culturilor de productie.

2.4 Testul MTT

Scotand apoi 750 µl de cultura rezultata din fiecare recipient, 10 µl de MTT (-(4,5-diametil-tiazol-2-yl)-2,5-diafenil-tetrazoliumromid; Serva Heidelberg,Germany; 5mg/ml PBS) au fost adaugate. Dupa a 4-a incubarela 37˚C, 300µl din o solutie de stopare (10% w/v sodium dodecysulfat in 50% v/v N,N' - dymetisulformamide; Serva, Heidelberg, Germany) au fost aplicate in fiecare recipient si incubate peste noapte la 37˚C. Densitatea optica a fost citita cu un cititor ELSA (Spectra Image; Tecan, Crailsheim, Germany) la o lungime de unda de 570 nm. Rezultatul a fost exprimat ca:

Vitalitate = 100 x micotoxina OD in mostra  solvent OD controlat

2.5 Analiza datelor

2.5.1 Designul combinatiilor

Designul amestecurilor experimentale este o conditie prealabila pentru rezultate optime. Cum scopul studiului a fost de a stabili previzibilitatea efectelor combinate bazate pe comparatia dintre efectele observate si efectele prevazute de la 2 modele fara interactiune, am selectat un asa numit design raza. Designul raza furnizeaza proportii cinstante de amestecuri, de ex., in termini de EC50 se permite considerarea relatiilor explicite concentratie - raspuns. Design-ul este cel mai potrivit pentru conpararea raspunsurilor cu adios de concentratie, desi permite de asemeni interpretarea in concordant cu adaosul de raspuns daca raspunsurile individuale sunt estimate. Stategiile de design alternative ar fi designul n x n sau designul compozit. Amestecurile de compoziti sunt apoi selectate de o stratgegie de design factorial ce permite selectionarea rationala de amestecuri pentru un numar limitat de puncte de observatie optimizate pentru descrierea de interactiuni mutuale. In timp ce primul permite evaluarea efectelor combinate numai cu referire la adaosul de raspuns, designul compozit se concentreaza pe detectarea de posibile interactiuni la o anumita cota de amestec.

Relatia concentratie - raspuns a substantelorindividuale a fost modelata biometric folosing o metoda din pas in pas. Modelul Hill a fost potrivit setului de date experimental.

Cele 2 functii - parametri folosite:

E(%inh) = 100 1+(x/EC50)-p

Unde E = effect in %; p = panta; EC = efectul concentratiei; x = concventratie(nM).

2.5.2 Modelarea efectelor concentratiilor

Pe baza functiilor de concentratie - raspuns a micotoxinelor individuale, previziunile efectelor concentratiilor au fost calculate pentru amestecuri continand 4 micotoxine intr-o cota definite (bazata pe EC20). O cpncentratie totala de amestec, la care este generat un anumit effect, poate fi calculate folosind adaosul de concentratie in concordant cu:

ECx mix = (ΣⁿPi / ECxi)-1

Efectul la totalul concentratiei amestecului, E(Cmix), este bazat pe efectele componentelor pe care le genereaza la concentratia x la care sunt prenete in amestec (E(ci)). Daca cea din urma este exprimata ca o fractie (Pi) a totalului concentratiei amestecului, se retine:

E(Cmix) = 1 - II (1 - E(PiCmix))

Aceasta permite calcularea unui effect asteptat in concordanta cu adaosul de raspuns pentru orice concentratie de amestec.

3. Rezultate

Determinarea efectelor cu siguranta pentru micotoxinele individuale este esentiala pentru prezicerea de amestecuri toxice. Pentru a evalua influenta micotoxinelor asupra activitatilor functionale umane PBMC, aceste cellule au fost stimulate cu anti -CD3/28 si dupa 24 de ore de cultura supernatanta au fost analizate pentru producerea de IFN-y pe un aparat ELISA. Celulele ramase au fost folosite pentru analizarea efectelor citotoxice. Fig. 1 compara efectele micotoxinelor asupra italitarii si productiei de IFN-y. Toate micotoxinele au inhibat producerea de IFN-y (depinzand de nivelul de concentratie) in anti - CD3/28 stimulate cu PBMC. O inhibare de 50% a productiei de IFN-y a fost gasita concentratia fata efecte citotoxice. De aceea, inhibarea vitalitatii nu a fost luata in considerare in calcularea IFN-y.

Un exemplu despre calitatea datelor produse de testarea in vitro, datele experimentale si curba calculate a concentratiei-raspuns a ochratoxinei A este aratata in Fig . 2. Odata cu cresterea concentratiei micotoxinei, inhibarea productiei de IFN-y a PBMC-ului stimulat a crescut monoton. Deviatiile standard pentru toate concentratiile de ochratoxina A au avut o medie de 11% cu exceptia celor 2 concentratii celor mai mari. Aceste 2 concentratii, in care suspensia producerii de IFN-y a fost 100%, deviate din curba Hill este aranjata la 5 - 10%.

Fig. 3 arata curbele observate ale concentratiei - raspuns potrivite de functia Hill si sumarizate experimental pentru cele 4 micotoxine investigate. Curbele concentratiei - raspuns ale micotoxinelor sunt toate sigmoide, dar au diferite efecte si trepte (Fig. 3). Parametrii calculati pentru functia Hill sunt calculati in tabelul 1, impreuna cu calculul valorilor EC20 si ale fractiilor folosite in amestecurile experimentale. Regresia bazata pe valorile EC50 a micotoxinelor individuale difera mult de 2 ordine de magnitudine (tabelul 1) cu gliotoxina fiind cea mai eficienta componenta cu un EC50 de 60.7 n.M si citrinina fiind cea mai putin eficienta cu un EC50 de 30.100 n.M. In plus, panta pentru diferitii compusi variaza de la 1.04 pentru ochratoxina A la 5.24 pentru citrinina. Pentru panta in trepte asta inseamna ca dubland nivelurile de concentratie IC50 la aproape 100% inhibitiea productiei de IFN-y in timp ce pentru cea mai lina panta aceasta duce la o crestere de la 50% la aproximativ 67% inhibitie.

O cota fixa pentru amestecuri a fost aleasa pentru o analiza concentratie - raspuns a amestecului de micotoxine. Aceasta cota este bazata pe toxicitatea relativa a celor 4 componente. Amestecul de micotoxine a fost proiectat intr-o cota molara a vlalorilor lor individuale EC20 (vezi tabelul 1). Pentru reanalizarea datelor individuale, intr-adevar citrinina a fost putin mai inactiva (EC15) decat valoarea anticipata de EC20. Cea mai mare concentratie de amestgec a fost de aproximativ 32 µM. Pentru a investiga daca amestecurile testate au provocat un effect combinat detectabil, inhibitia observata a IFN-y cauzata de amestec este comparata cu efectele modelate ale micotoxinelor individuale la concentratiile la care sunt prezente in amestec (Fig. 4). Pentru a putea comparata efectul proportional asupra inhibitiei IFN-y a fiecarei micotoxine individuale cu efectul amestecului, efectele fiecarei micotoxine individuale sunt aratate facand legatura cu concentratia individuala in amestec la totalul concentratiei amestecului. Concentratia amestecului intre aproximativ 8 si 32µM, clar produce efectele amestecului ce sunt diferite de efectele micotoxinelor individuale. Inhibitia amestecului IFN-y observant poate fi deci atribuita unui effect combinat. Mai jos de 8 µM nu se observa nici o diferenta intre efectele prevazute individual si efectgele combinate. Functiile prevazute pentru adaosul de concentratie si adaosul de raspuns sunt incluse. In ariile de concentratie mai joase modelul de adios de raspuns descrie amestecul foarte bine. In aria de concentatie superioara contributia individuala a celor patru micotoxine la efectul total sunt diferite. Aceste rezultate arata ca contributia toxinelor individuale la efectele amestecului poate depinde de aria de concentratie expusa. Pentru controlul calitatii 4 din 10 amestecuri binare si tertiare posibile au fost facute (datele nu au fost aratate). Rezultatul acestor amestecuri au fost calificate in functie de rezultatele amestecului cuaternar. Oricum, asa cum era de asteptat, diferenta intre previzibilitate si conceptele adaosului de concentratie si adaosului de raspuns este cea mai mare pentru amestecul cuaternar.

Fig. 5 arata ca calculele prevazute pentru toxicitatea amestecurilor pentru adaosul de concentratie si adaosul de raspuns cat si efectul combinat observant experimental al unui effect individual al unei micotoxine in amestec. Un amestec de concentratii EC20 a celor 4 toxine a au cauzat o inhibare a producerii IFN-y de 69%. Valoarea prevazuta este de 79% pentru adaosul de concentratie si de 59% pentru adaosul de raspuns.

4. Discutii

Pentru a putea analiza previzibilitatea efectelor combinate ale unuiamestec de patulina,citrinina,gliotoxina si ochratoxina A, este necesara analiza efectelor individuale a fiecarei micotoxine asupra activitatii functionale a limfocitelor umane stimulate. Rezultatele arata ca micotoxinele testate inhiba producerea de IFN-y in limfocitele umane T intr-o maniera concentrat dependenta in aria de la nano la macro molar. Clasificarea imunotoxicitatii pentru micotoxinele individuale este gliotoxina > patulina > ochratoxina A > citrinina, cu citrinina fiind cel putin de 500 de ori mai putin activa in process decat gliotoxina. Efecte imunotoxice similare ale micotoxinelor precum se observa aici au fost raportate pentru patulina, gliotoxina si citrinina. Valori comparabile IC50 au fost demonstrate de Wichmann et al. (2002) cu 105 nM pentru gliotoxina si 33 µM pentru citrinina, numai IC50 pentru patulina difera cu o valoare mai mare cu 3. Prin reanalizarea datelor acestora s-a observat ca efectele notate sunt in aceeasi raza pentru patulina astfel incat pot fi atribuite diferitelor modele aplicate concentratie - raspuns.

Valori mai mari IC50 comparate cu valorile prezentate in acest studio (inhibarea IFN-y) au fost detectate intr-un test de profilerare asupra limfocitelor porcine. Clasificarea activitatii a fost patulina (IC50 = 1.2 µM) > ochratoxina A (IC50 = 1.3 µM) >citrinina (IC50 = 38µM). IC50 pentru citrinina a fost aproape identic, dar IC50 pentru ochratoxina A si patulina difera cu un factor de 2 si respective 9. Aceeasi clasificare dar cu un IC50 mai mare a fost deasemeni observant pentru efectele patulinei, gliotoxinei, ochratoxinei A si citrininei la celulele epitaliale pulmonare umane folosind metoda MTT. Valorile IC 50 pentru patulina si ochratoxina A au deviat puternic cu un factor de 40 si respective 50, comparand cu rezultatele obtinute aici. Valorile IC50 mai mari comparate cu inhibarea IFN-y sunt in accord cu datele prezentate. Se pare ca micotoxinele afecteaza activitatea functionala (producerea de IFN-y) mai puternic decat vitalitatea celulelor. Efectele micotoxinelor individuale puteau fi reproduse si clasificarea prin activitati specific ale acelorasi micotoxine au fost in general aceleasi.

Concentratiile de expunere folosite pentru experimente de combinare reprezinta concentratii effective pentru oameni. Analiza sangelui uman nu dezminte acest lucru. Tarile europene au aratat o greutate intre 100 si 14.400 ng/l (0.247 - 35.7 nM) cu ochratoxina A in concentratie. Cea mai mare concentratie de ochratoxina A gasita in serul sangelui uman nu ar mari semnificant efectele inhibitiei IFN-y a PBMC-ului stimulat conform studiilor noastre. Oricum, patulina poate fi gasita in sucurile de fructe in concentratii de peste 50ng/ml (324.4 nM), factor ce este mai mare decat IC50 gasit pentru patulina. Consumarea regulata de sucuri de fructe poate deci duce la expunere continua la doze relevante de micotoxine.

Rezultatul prezentat aici arata ca un effect combinat al celor 4 micotoxine este observabil. Inhibarea IFN-y dupa expunerea amestecului este mai puternica decat cea cauzata de toxinele aplicate individual. Numai cateva studii pana acumiau in considerare efectele combinate ale micotoxinelor asuprea celulelor immune competente. Efectul proliferarii capacitatii limfocitelor a fost deci investigat. Intr-un system uman un effect combinat a 2 micotoxine din clasa trichothecenelor cu o inhibare mai puternica a proliferatiei prin amestecul comparat cu diferitre substante a fost observat. Acestea indica faptul ca efectele combinate ale amestecurilor micotoxinelor sunt in general observabile. Efectele combinate printr-o amestecare de deoxinivaneol si si aflatoxina A sau fumonisin B1 asupra proliferarii celulelor in limfocitele umane stimulate nu s-a putut detecta un asemenea effect, dar s-a fasit acelasi nivel de effect cauzat doar de deoxinivaneol. Heussner et al. (2006) a demonstrate similar ca efectele combinate pentru amestecurile binare si trinare de ochratoxina A si B, patulina si citrinina au putut fi detectate intr-o testare MTT pentru citotoxicitate in linia celulara LLC-PK1 renala porcina. In concordant cu suma de efecte de la componentele individuale au fost obsevate efecte mai mari. Mai departe, asa cum Heussner et al. (2006) nici nu a facut edisponivil modelul aplicat pentru estimarea functiilor individuale doza-raspuns, nici valorile parametrilor estimati, este deci imposibil sa compari descoperirile lor cu datele prezente aici.

Daca efectele combinate ale amestecurilor sunt pentru a fi evaluate Cantitativ, determinarea sistematica a relatiei doza-raspuns sunt folositoare nu numai pentru substantele individuale dar si pentru efectele combinate. Un model descriind efectele combinate asteptate trebuie formulat. In acest studio, 2 concepte, adaos de concentratie si adaos de raspuns, s-au angajat cu success in studiul ecotoxicologiei si si au implicat rationamentul farmacodinamic. Ambele concepte au permis calcularea efectelor asteptate de la date despre effectul compusilor individuali. Daca compusii din amestec au moduri de actiune similar, adaosul de concentratie este in general folosit pentru prezicerea efectelor combinate din amestecuri. Activitatile si efectele nu sunt schimbate daca unul din compusi este partial inlocuit, sau diluat de o cantiate oarecare echipotenta. Adaosul de raspuns este acum considerat alocat pentru amestecurile unde componentele unde comnponentele au trasaturi similar si moduri de actiune diferite. Prin prisma acestor viziuni conceptele efectelor combinate ale amestecurilor cu multipli compusi pot fi prevazute si verificate. Magnitudinea efectelor combinate ale amestecurilor de micotoxine studiate aici a fost prevazuta mai précis prin modelul de adaos de raspuns decat prin modelul de adios de concentratie. De aceea pare plauzibil sugerarea ca micotoxinele testate sa actioneze independent. Presupunerea alternativa ar fi ca sunt antagonistice la asteptarile unei concentratii de aditiv cu effect combinat, pentru care nu putem gasi o explicatie buna. Un studio recent arata ca efectele amenstecurilor de citrinina, ochratoxina, patulina si alte toxine Penicillium in vitro asupra proliferatiei induse limfocitelor porcine. Diluari cu cote fixe a toxinelor au fost folosite bazate pe concentratii cauzand efecte similare. Reanalizarea acestor reprezentatii isobiografice arata ca sub nici o forma de deviatie pentru concentratia adaugata nu se observa variatii. Doua amestecuri cu patulina au fost estimate sa fie mai putin posibil additive (Betford et al., 2004) si acelasi lucru a fost descoperit in cazul amestecului cu patulina, gliotoxina, ochratoxina Asi citrinina in studiul aratat aici. Cu precadedre pentru previziune, cu cat mai multe substante sunt prezente in amestec, cu atat mai clara este diferenta intre efectele combinate si efectele individuale ale amestecului rezultat. Mai mult decat atat, discriminarea intre previziunile privind conceptele de adios de raspuns si adaosul de concentratie va fi mai mare.

In concluzie, modelele de prezicere de adaos de raspuns si adaos de concentratie folosite in studiile de ecotoxicologie pot fi aplicate in studiul prezentat aici ca fiind curbele raspuns - concentratie ar fi de o calitate suficienta. Ambele concepte par a fi acceptabile pentru asumarea riscului ca amestecul de micotoxine pentru care modul de actiune a micotoxinelor testate este necunoscut. Ei lasa o fereastra pentru formularea de preziceri pentru efectele asteptate ale combinatiilor deschisa (Walter et al., 2002).