Enzime proteolitice (proteaze)
Proteazele microbiene reprezinta un grup complex de enzime hidrolitice care difera prin specificitatea de substrat si mecanism de reactie. Activitatea enzimei si stabilitatea ei depinde de pH si temperatura. Productia si caracteristicile pot fi influentate de selectia sursei producatoare si alegerea conditiilor de cultivare a acestora.
Enzimele din aceasta categorie hidrolizeaza majoritatea proteinelor: cazeine, hemoglobina, gelatine, albumina din oua, glutenul, proteinele din soia si alte proteine vegetale sau animale. Conditile de hidrolizare si randamentul depind de natura, caracteristicile si gradul de puritate al prepararii enzimelor.
Aceste enzime scindeaza legaturile peptidice din proteine, peptide cu mase moleculare mici sau la aminoacizi.
In functie de provenienta lor, proteazele pot fi de origine:
microbiana (bacterii, fungi, actinomicete);
vegetala (ficus latex, ananas, papaia);
animala (pancreas, rinichi, suc gastric).
Dupa locul de actiune, pot fi:
intracelular;
extracelular.
Prima clasificare (1914) a enzimelor proteolitice a fost:
peptidaze, prin degradarea peptidelor;
proteinaze, prin degradarea proteinelor.
A doua clasificare (1942) a fost:
endopeptidaze, grupul cel mai mare de enzime proteolitice;
exopeptidaze.
Din categoria endopeptidazelor fac parte:
proteaze serinice - chimotripsina, tripsina, elastaza, urokinaza, proteaza alcalina;
sulfhidril proteaze - papaina, ficina, chimopapaina;
proteaze carboxilice acide - pepsinele (A, B, C), proteaze carboxilice microbiene;
metalproteaze - colagenaza microbiana, proteaze neutre, colagonaza intestinala.
Microorganisme producatoare de enzime proteolitice
Bacterii: Bacillus subtilis, Bacillus pumillus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophylus, Bacillus lichemiformis.
Fungii: Aspergillus sojae, Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Rhyzopus oryzae.
Actinomicete: Streptomyces lichefaciens, Streptomyces grisene.
Cele mai utilizate sunt Bacillus subtilis si Aspergillus oryzae.
In general, tulpinele de microorganisme produc un amestec de enzime proteice care difera intre ele prin pH optim (acid, neutru, alcalin) cat si prin specific de actiune. De aceea pentru fiecare microorganism se va specifica tipul de proteaze produs cu preponderenta. Astfel, microorganismele speciei Bacillus subtilis produc proteaze neutre sau alcaline, iar Aspergillus oryzae proteaze neutre, acide si alcaline.
Proteazele neutre si alcaline produse de Bacillus subtilis sunt enzime extracelulare.
Proteaze bacteriene sintetizate de Bacillus subtilis:
Proteazele sintetizate de Bacillus subtilis sunt amestec de proteaze alcaline si neutre. Aceste difera intre ele prin proprietati distincte.
Proteazele alcaline fac parte dintre proteazele serinice care au in centrul activ serina si lizina. Aceasta grupa a fost divizata in 4 subgrupe:
a) proteaze similare tripsinei. Cuprind in afara de tripsina si chimotripsina si enzime care hidrolizeaza legaturile peptidice din lantul B a insulinei, aceasta specificitate de substrat fiind o trasatura distinctiva. Ele actioneaza la pH=8; toptim=50°C.
b) proteaze alcaline. Au actiune specifica fata de resturi de aminoacizi aromatici sau cu catene laterale hidrofobe si care participa prin gruparea - COOH la formarea legaturilor peptidice. pHoptim=9-11, dar raman active si in domeniul de pH=5-9.
c) proteaze Myxobacter -litice.
d) proteaze stafilococice.
Metaloproteaze - au ioni metalici legati de centrul catalitic al enzimei: Ca, Zn, Mg, Fe. Se impart in metaloproteaze neutre si alcaline.
Metaloproteazele neutre contin zinc si prezinta specificitate de substrat fata de aminoacizii cu radicali hidrofobi care implica gruparea - NH2 in legatura peptidica.
Metaloproteazele alcaline au pHoptim=7-9, fiind putin inactivate de EDTA.
Biosinteza proteazelor bacteriene in sistem submersibil
Aceste enzime sunt folosite in industria alimentara, farmaceutica si a detergentilor enzimatici.
Mediul de cultura este alcatuit din medii sintetice care contin surse standardizate de carbon, azot, saruri minerale sau mediile de cultura care pot fi medii naturale care contin ca si surse de carbon si azot subproduse din industria agroalimentara: srot de soia, tarate de grau, melasa, hidrolizate cu continut de glucide.
Avantaje: pret de cost scazut, compozitie complexa de carbon si azot, contin vitamine, aminoacizi, minerale.
Exemplu: cultivarea tulpinii de Baxillus subtilis
- se utilizeaza mediu cu geloza simpla: peptona, extract de carne, agar-agar, NaCl;
- mediu minimal: glucoza, hidrolizat de cazeina, K2 + HPO4, citrat de sodiu, MgSO4.7H2O;
- mediu de lactoza: lactoza, peptona, NaCl, MgSO4.7H2O, CaCl2, K2HPO4, KH2PO4, Na2SO4, MnCl2;
- mediu de hidrolizat acid de malai: hidrolizat acid de malai, faina de soia, MgSO4.7H2O;
- mediu de srot de soia: faina de porumb, srot de soia, MgSO4;
- mediu cu glucoza nu este asa des folosit ca srotul de soia: glucoza, amidon solubil, faina de soia, MgSO4.
La mediile cu hidrolizat acid de malai si cu srot de soia, concentratia hidrolizatului de porumb si a srotului variaza intre 1-3%.
Se alege acel mediu de cultura care prezinta activitate enzimatica maxima. Prelucrarea culturilor de bacterii pe mediile de mai sus s-a facut prin separarea biomasei bacteriene prin centrifugare timp de 10 minute la 4000 rot/minut si prelevarea supernatantului din care se determina apoi activitatea enzimatica.
Parametrii de cultivare: procedeul de cultivare submersibila este cel mai folosit in biosinteza proteazelor cu tulpini de bacterii.
Factorii cei mai importanti sunt forma de mediu nutritiv si conditiile de cultivare. Dintre substantele care intra in compozitie, actiunea cea mai eficace o are glucoza dar pe langa ea mai poate fi folosit ca si componenta glucidica amidonul (exista variante cu diglucide in loc de glucoza). Concentratia glucidelor este intre 0,1-15% in functie de disprsia microorganismelor.
Sursa de azot: tulpinile ce produc proteaze folosesc substantele din proteine si produsele de hidroliza ale proteinelor: peptide, aminoacizi, faina de soia, srotul de soia, extract de plante; se folosesc in mod curent in productia de proteaze cu Bacillus subtilis. Introducerea in mediu a aminoacizilor induce producerea de proteaze, eficienta cea mai mare o are leucina. Actiunea stimulativa asupra sintezei proteazelor o au si vitaminele (tiamina, biotina, acidul folic, nicotinamida). Pe langa sursele de carbon, azot, aminoacizi, vitamine, mai sunt introduse in medii macro- si microelemente (Ca, K, Fe, Mg, Mn, P) sub forma de saruri de diferite concentratii. Calciul joaca rol de tampon si stabilizator al enzimelor proteolitice, favorizand eliminarea lor din celule si are un rol important in formarea sporilor.
pH. Producerea de proteaze neutre si alcaline se dezvolta bine la valori neutre si usor alcaline ale pH. Pentru cultivarea Bacillus subtilis pH=6-6,5.
Temperatura. Optimul favoabil cresterii si dezvoltarii microorganismelor este si temperatura optima de sintetizare a enzimelor. Pentru bacterii mezofile este intre 35-40°C iar pentru cele termofile 45-60°C. Bacillus subtilis este mezofila.
Aerarea. Pentru sinteza maxima a enzimelor proteice de catre bacterii este nevoie de o aerare intensa. Necesarul de aer este mai mare la inceputul sporularii bacililor se mareste cantitatea de aer adusa in mediu acum.
Aspergillus oryzae - Conditii de mediu
Tulpinile producatoare de proteaze acide si neutre sau neutre si alcaline. Proteazele producatoare de Aspergillus oryzae sunt intra - si extracelulare.
Introducerea sintezei enzimatice proteolitice in culturile de microorganisme este determinat nu numai de compozitia mediului nutritiv ci si de parametrii tehnologici de cultura (pH, temperatura, cantitatea de oxigen, cantitatea si calitatea materialului biologic). Microorganismele ce produc proteaze neutre se dezvolta la pH≈7, cele alcaline la pH=9-11, cele acide la pH=3,5-5. In timpul procesului pH-ul scade deoarece se foloseste tampon fosfat, NH3, NaOH. Sinteza proteazelor are loc intr-un domeniu ingust de pH, deoarece este importanta durata de timp al mentinerii pH-ului. La temperatura de 35-38°C timpul de mentinere este de 48-72 ore.
Pentru sinteza enzimelor proteice in culturi submerse de microorganisme, se utilizeaza bioreactoare cu un volum de 20-200 m3.
Calitatea si cantitatea inoculului. Se folosesc inocule standardizate. La bacteriile din genul Bacillus subtilis inoculul este extras din cele tinere in faza de crestere 12-14 ore de la incubare (nivel crescut de ADN) sau din spori. Se obtin de 4 ori mai multe proteaze cu prima varianta. Masa de inocul pentru biosinteza cu tulpini de Bacillus subtilis este de maximum 5% din mediul de cultural
Biosinteza proteazelor fungice in sistem submersibil
Sursa de carbon (glucoza) din compozitia mediilor de cultura reprezinta sursa de energie care participa activ la metabolismul celulelor. Concentratia sursei de carbon poate varia intre 1-15% fiind reprezentat de glicide, lactoze, amidon. Pentru cultivarea fungiilor de Aoryzae se pot utiliza urmatoarele formule de mediu nutritiv:
glucide + NaNO3 + K2HPO4 + MgSO4 + KCl + FeSO4 + agar-agar;
extract drojdie + peptona + glucide + agar-agar;
glucide + NaNO3 + KH2PO4 + MgSO4 + KCl + FeSO4 + ZnSO4 - agar-agar;
faina de soia + lactoza + KH2PO4 + MgSO4;
faina de soia + glucide + KH2PO4 + MgSO4;
faina de soia + melasa + KH2PO4 + MgSO4;
faina de soia + solutie amidon + extract de plante + KH2PO4 + MgSO4
Conditii de cultivare
Fungii din genul Aspergillus dezvolta biomasa specifica in care se acumuleaza enzime proteice la diferite valori ale pH-ului. Astfel, sunt enzime in cultura de Aspergillus soiae, Aspergillus oryzae si Aspergillus niger pH=5-5,5, iar Aspergillus terrens: pH=6-6,5. Acumularea enzimelor proteolitice in mediu este insotit de cresterea brusca a pH-ului. Temperatura: 26-32°C.
- Stabilirea unei corelatii optime intre agitarea si aerarea mediului.
- Cantitatea si calitatea inoculului.
Procedee de izolare si purificare a enzimelor proteolitice fungice
Separarea biomasei de Asp. oryzae nu prezinta dificultati, data fiind structura filamentoasa a miceliului.
filtrare, urmata de filtrare la presiune redusa, sau
ultrafiltrare prin membrane speciale.
Prima varianta: pentru ca se face la 40-45°C, apare denaturare termica, iar enzimele isi pierd activitatea catalitica. Cea de-a doua varianta permite remedierea acestui inconvenient, realizandu-se si o purificare suplimentara de cca 2,5 ori a proteazelor microbiene.
Filtratul este apoi trecut peste o coloana cromatografica continand hidroxilapatita care retine proteazele si care sunt apoi eluate cu solutii tampon fosfat 0,1 M.
Proteazele astfel purificate se folosesc pentru obtinerea unor medicamente active in tratamentul plagilor necrotice. Produsul enzimatic conditionat se foloseste la indepartarea cheagurilor de fibrina.
Afectiuni gastrice: marea majoritate a afectiunilor gastrice sunt asociate cu un deficit enzimatic pancreatic: amilaze, proteaze, lipaze, celuloze, avand ca efect perturbari ale principalelor etape ale digestiei si adsorbtia glucidelor, lipidelor, proteinelor. Cresterea concentratiei de substante nedigerate, deci neabsorbite, favorizeaza aparitia unor afectiuni la nivelul aparatului digestiv.
Speciile de Aspergillus oryzae snt produse de complexe enzimatice (proteaze, lipaze, amilaze). Pentru obtinerea unui preparat multivalent:
- culturi submerse de Aspergillus oryzae in medii care contin: faina de soia + amidon; faina de soia + lactoza; faina de soia + glucoza si in toate: KH2PO4 si MgSO4
Preparatul enzimatic a fost izolat din mediu prin precipitare cu acetona, filtrare, rezultand un concentrat care se centrifugheaza, iar supernatantul se arunca. Precipitatul este dizolvat in apa distilata, din nou filtrat, iar apoi este precipitat cu acetona. Rezulta preparatul enzimatic multivalent care prezinta activitate amilolitica, proteolitica, lipolitica si celulozolitica. Aceasta este solubila in apa si ser fiziologic.
