Fluxul informatiei genetice

FLUXUL INFORMATIEI GENETICE

1.1. Ierarhizarea biomacromoleculelor

Referindu-se la ierarhia macromoleculelor ce conditioneaza miracolul vietii, oamenii de stiinta au acceptat ca la baza vietii stau proteinele, deasupra acestora sta acidul ribonucleic (ARN), deasupra ARN sta acidul deoxiribonucleic (ADN), iar deasupra stau . enzimele (proteinele). Deci in ierarhia care exista in lumea biomacromoleculelor, din interactiunea carora rezulta "viata" se porneste de la proteine cu rol structural si se ajunge la proteine cu rol enzimatic, reglator.

In realitate, in varful ierarhiei biomacromoleculelor legate de procesele vietii sta ADN, detinatorul informatiei genetice si deci a totalitatii caracterelor ereditare care se transmit de la generatie la generatie si conditioneaza exprimarea insusirilor specifice (anatomice, biochimice, fiziologice si de comportament) ale fiecarui organism.

Trecerea informatiei genetice de la ADN spre proteine necesita un intermediar - acidul ribonucleic mesager (ARNm) - care actionand coordonat cu un alt tip de acid ribonucleic numit ARN solubil sau de transfer (ARNt), conditioneaza traducerea mesajului genetic din ADN intr-o secventa de aminoacizi din proteine.

Informatia continuta in ADN se traduce deci in sinteza de proteine care indeplinesc variate roluri: structural (proteinele structurale constituie suportul material al vietii) sau functional (catalitic, hormonal, de transport, de aparare etc.). Pentru realizarea functiilor celulare este evidenta importanta vitala a proteinelor cu rol catalitic, enzimele.

Desi sinteza enzimelor in celula este dirijata tot de ADN, ele conditioneaza functionarea celorlalte biomacromolecule implicate in realizarea mecanismelor vietii, incluzand din nou ADN.

1.2. Dogma centrala a biologiei moleculare

Intreaga biologie moleculara, inclusiv ingineria genetica, se bazeaza pe relatia care exista intre acizii nucleici si proteine, pe mecanismul prin care informatia genetica existenta in acizii nucleici este transmisa proteinelor.

Informatia genetica, determinata chimic de structura acidului deoxiribonucleic (ADN) este transferata la celulele-fiica prin reproducerea (copierea) de ADN si este exprimata prin transcriptie (transferul informatiei genetice de la ADN la ARN-mesager) urmata de translatie (transferul informatiei genetice de la ARN la proteina).

Acest grupaj de procese este intalnit in toate celulele si decurge, in general, in moduri similare fiind unul din conceptele unificatoare in biologia celulara. Pionierii biologiei moleculare au denumit aceasta serie de procese "dogma centrala" a biologiei moleculare.

Formula initiala a acestei dogme postula ca informatia genetica se transmite doar intr-o singura directie si anume ADN ARN Proteine.

La baza acestei conceptii au stat descoperirile lui Avery et al. (1944) care au dovedit ca ADN este purtatorul proprietatilor genetice, cat si cele ale lui Watson si Crick (1953), care prin elucidarea structurii dublu-elicoidale pentru ADN au permis intelegerea modului in care o secventa de nucleotide din ADN este convertita intr-o secventa de aminoacizi in proteine.

Mai tarziu Benzer si Yanofski (1960) au formulat principiul colinearitatii dintre gena si produsul ei proteic (secventa bazelor din orice gena fiind continua), principiul care a ramas valabil la toate genele procariote functionale examinate. Aceste conceptii de baza in biologie au fost apoi completate in virtutea rezultatelor unor cercetari ulterioare, pastrandu-si totusi valabilitatea.

Asa de exemplu s-a constatat ca retrovirusurile, o clasa speciala de virusuri cu ARN, poseda o enzima care catalizeaza transformarea ARN in ADN-complementar. Aceasta enzima a fost denumita reverstranscriptaza sau transcriptaza inversa deoarece ea directioneaza trecerea informatiei genetice de la ARN la ADN (deci invers transcriptiei de la majoritatea celulelor eucariote).

De asemenea, pana relativ recent, s-a considerat ca genele procariotelor si eucariotelor au o structura asemanatoare; in ambele cazuri, ele ar consta dintr-un fragment continuu de ADN continand informatia genetica pentru sinteza unei singure proteine. Secventa bazelor din fragmentul de ADN corespunzator direct cu secventa lineara a aminoacizilor din proteina. Ulterior s-a constatat ca in organismele eucariote multe gene sunt exprimate diferit fata de ceea ce se prevazuse prin intermediul dogmei centrale in sens strict si care a fost stabilita prin cercetari realizate pe bacterii si virusuri. In timp ce genele procariote sunt continue, iar in cazul lor principiul coliniaritatii mentionat mai sus se respecta, genele eucariote sunt discontinue si ele nu respecta deci principiul coliniaritatii.

Astfel, in unele cazuri, ARN-ul derivat prin transcriptia unui segment eucariotic al ADNui este supus unui proces denumit "innadire" sau imbinare cap la cap, inainte de a parasi nucleul. In cursul acestui proces, anumite parti asa numitii introni ai moleculelor de ARN in stare nascanda sunt indepartati, dupa care celelalte parti (exonii) sunt legati unul de celalalt si formeaza ARN-ul efectiv denumit si ARN-matur pentru sinteza proteinei.

In plus, este important sa se realizeze ca o proteina in stare nascanda, rezultatul direct al translatiei, nu este in mod necesar identica cu proteina functionala in celula ca enzima sau ca proteina structurala. Cele mai multe proteine, asa cum se gasesc in celula, sunt modificate prin procese post-translationale. Astfel polipeptidele in stare nascanda sunt, de exemplu, "aranjate", "puse in ordine" de peptidaze; in unele cazuri de proteine se leaga grupari lipidice, in timp ce in celulele eucariotelor glicozilarea proteinelor este un proces obisnuit. Asemenea modificari post-translationale sunt caracteristici importante in ceea ce priveste functiile specifice ale proteinelor.

Cunoasterea precisa a fluxului de informatie genetica care are loc in celula este foarte importanta pentru biotehnologie, deoarece ea ofera posibilitatea de a controla procesele celulare la nivelul exprimarii genei.

1.3. Acidul deoxiribonucleic (ADN) - molecula vietii

Molecula de ADN este un polimer de unitati numite nucleotide, formate dintr-o pentoza (deoxiriboza), o grupare fosfat si o baza azotata. Nucleotidele se deosebesc prin natura bazei azotate. Bazele din structura ADN sunt: adenina (A) si guanina (G) (baze purinice); timina (T) si citozina (C) (baze pirimidinice).

Deoxiriboza legata la baza azotata printr-o legatura N-glicozidica (intre pozitia 1' a pentozei si azotul din pozitia 3, respectiv 9 a unei baze azotate pirimidinice sau purinice) formeaza un nucleozid. Fosfatul se fixeaza pe carbonul 5' al pentozei intregind structura nucleotidului.

In macromolecula de ADN nucleotidele sunt atasate unele de altele prin legaturi covalente de tip ester fosforic care leaga 5' fosfatul unei nucleotide cu gruparea 3'-OH a nucleotidului invecinat. Lantul plonucleotidic este format astfel dintr-un schelet corespunzator unei insiruiri pentoza-fosfat cu succesiune de baze azotate situate lateral. Secventa nucleotidelor constituie structura primara ADN si reprezinta insasi suportul material al informatiei genetic pe care acesta o contine. Deci exista doar patru nucleotide diferite, ele pot genera un numar foarte mare de secvente (exista 4n secvente posibile). Astfel teoretic se pot constitui 420 secvente diferite cu 20 de nucleotide. Aceasta confera macromoleculelor de ADN o mare diversitate si posibilitati inepuizabile pentru rolul lor de codificare si transmitere a informatiei genetice.

Molecula de ADN are o structura bicatenara fiind alcatuita din doua lanturi polinucleotidice unite prin punti de hidrogen care se stabilesc intre bazele azotate ale celor doua catene. Imperecherea bazelor azotate nu se face la intamplare. Ele sunt intotdeauna astfel dispuse incat o baza purinica se afla in fata unei baze pirimidinice de pe catena opusa, mai precis adenina este asociata cu timina, iar guanina cu citozina.

Aceasta complementaritate stricta asigura un numar maxim de legaturi de hidrogen (2 pentru perechea A-T, respectiv 3 pentru perechea G-C) si implicit conformatia cea mai stabila a molecule ADN. Exista astfel o constrangere totala intre cele doua catene fiindca secventa uneia o determina pe a celeilalte. Structura secundara formata prin respectarea stricta a complementaritatii bazelor fundamenteaza mecanismul de replicare semiconservativa a ADN (fiecare catena servind ca matrita pentru sinteza unei catene noi complementare) ca si de reparare a moleculei de ADN cand aceasta a suferit distrugeri.

Structura tertiara pentru ADN a fost elucidata de Watson si Crick (1953) si se refera la dispozitia spatiala a catenelor complementare din macromolecula de ADN. Potrivit acestui model lanturile polinucleotidice sunt dispuse antiparalel (un lant orientat 5'-fosfat → 3'-OH, iar celalalt 3'-OH → 5' fosfat), ceea ce confera o structura spatiala in dubla elice (dublu helix) cu cele doua catene spiralizate in jurul unui ax ipotetic comun, cu rotatie orientata spre dreapta. Bazele azotate (hidrofobe) sunt orientate spre interior si perpendicular pe axul moleculei, in timp ce coloana fosfo-glucidica formeaza exteriorul macromoleculei si ii asigura polaritatea (la pH neutru toate gruparile fosfat sunt ionizate).

In interiorul elicei distanta dintre bazele azotate este constanta - 0,34 nm (3,4 Å), iar unghiul de rotire este de 36°; o spira completa realizeaza pe o distanta de 34 Å (rasucire de 360°) cuprinde 10 perechi de baze.

Legaturile de hidrogen cat si interactiunile hidrofobe dintre bazele azotate, desi de energie scazuta, prin numarul lor ridicat confera o stabilitate ridicata, fara a limita flexibilitatea lui conformationala.

Modelul Watson-Crick reprezinta forma predominanta a ADN-lui (forma B). S-au pus in evidenta insa si alte conformatii pentru macromolecula de ADN:

- conformatia de tip A - corespunzatoare tot unei duble elice rasucite spre dreapta, dar mult mai compacte (11 baze pe spira, respectiv 2,8 nm, 28 Å):

- conformatia de tip Z - elice stanga cu 12 perechi pe spira si 4,56 nm (45,6 Å). Forma Z este determinata de prezenta unor secvente speciale de purine si pirimidine. Conformatia sin a guanidinei si anti a citozinei intr-o succesiune GC imprima o alternanta (zig-zag) intre cele 2 conformatii. Se pare ca aceasta conformatie ar reprezenta un semnal de recunoastere sau ar fi implicata in variabilitatea genetica.

Cea mai mare parte din ADN este localizat in nucleu si anume in cromozomi, unde indeplineste functia de depozitare si transmitere a informatiei genetice.

Unitatea functionala a cromozomilor este gena.

Teoriile referitoare la relatia existenta intre informatia genetica si expresia sa finala au evoluat in timp de la ipoteza 'o gena - un caracter mendelean' trecand prin teoria 'o gena - enzima' si pana la conceptul actual, fundamentat experimental, 'o gena - un lant polipeptidic'.

Gena poate fi definita deci ca un fragment din molecula de ADN care contine informatia genetica necesara pentru sinteza unui lant polipeptidic cu structura si functie specifice.

Totalitatea genelor prezente intr-o celula constituie genomul acesteia.

1.4. Organizarea genomului de tip procariot

Procariotele, organisme primitive, in general unicelulare, din care fac parte si bacteriile reprezinta cele mai simple celule din natura.

De fapt, o celula procariota nu este altceva decat citoplasma inconjurata de unele straturi de suprafata descrise, in general, ca fiind invelisul celulei.

In "lumea" bacteriilor se disting doua tipuri principale de organisme denumite Gram-pozitiv si Gram-negativ pe baza comportarii lor diferite fata de o tehnica clasica de colorare a celulei.

Diferentele fundamentale intre aceste doua tipuri de bacterii sunt evidente in principal in structura invelisului celulei. Invelisul celulei bacteriene consta dintr-o membrana citoplasmatica si o structura foarte caracteristica a peretelui numita strat peptidoglicanic (PG). Celulele organismelor Gram-pozitive sunt multistratificate cu peptidoglicani, in timp ce la organismele Gram-negative se gaseste doar un singur strat sau cel mult doua. Cu toate acestea, distinctia cea mai clara intre cele doua tipuri de celule bacteriene consta in faptul ca in cazul organismelor Gram-negative celula este inconjurata de un strat foarte specific denumit membrana exterioara.

Situata alaturi sau aproape de membrana citoplasmatica, denumita de asemenea si membrana interioara (IM = inner membrane), membrana exterioara (OM = outer membrane) reprezinta o bariera pentru substantele care sunt transportate spre sau in afara celulei.

Un constituent chimic important si cu un caracter foarte particular al membranei exterioare sunt compusii denumiti lipopolizaharide (LPS).

Produsele biofarmaceutice obtinute din organismele Gram-negative trebuie sa fie purificate in mod particular, mai ales atunci cand ele sunt utilizate ca medicament, deoarece lipopolizaharidele eliberate in timpul izolarii produsului au, chiar in concentratie foarte mica, efecte toxice grave pentru oameni si animale.

In celula bacteriana cea mai mare parte de ADN este organizat sub forma unei singure molecule circulare mari care alcatuieste un cromozom. ADN-ul bacterian nu este inconjurat de o membrana nucleara si nu are o organizare atat de complexa ca a ADN-ului din celulele eucariote.

Lungimea cromozomului este de aproximativ 1100 mm (1,1 mm) in timp ce diametrul nucleoidului (regiunea purtatoare a materialului genetic bacterian, neizolata de citoplasma prin nici o structura membranara) este de aproximativ 1000 de ori mai mic. Aceasta inseamna ca, in interiorul nucleoidului, ADN este puternic impachetat prin numeroase plieri si rasuciri.

In cazul bacteriei Escherichia coli molecula de ADN (cromozomul) contine 3x106 perechi de baze.

In cadrul secventelor cu functie de reglare sunt evidentiate genele care constituie zona promotoare precum si genele care constituie zona operatoare cu sublinierea locului de initiere a transcrierii si a locului de legare de ribozomi. Promotorul si terminatorul reprezinta locurile la care enzima ARN polimeraza ADN dependenta incepe si termina sinteza ARNm; operatorul este locul specific de legare a represorului (proteina reglatoare ce impiedica sinteza ARNm).

Un operator contine aproximativ 20 de perechi de baze, iar pentru a fi recunoscut usor de represor, prezinta o structura speciala cu o axa dubla de simetrie. Operatorul lac, de exemplu, este foarte bine cunoscut, motiv pentru care multe clonari de gene se realizeaza cu ajutorul acestui semnal.

In secventele cu functie de codificare, rolul principal il are gena structurala. Gena structurala este definita ca 'un fragment discret sau continuu de ADN care contine informatia genetica ce specifica sinteza unui produs functional' (un polipeptid proteina). Inceputul genei structurale este marcat de codonul ATG, care odata transmis in molecula ARN-m, devine codonul AUG, responsabil de codificarea primului aminoacid din proteina (un codon reprezentand secventa a trei nucleotide care codifica un aminoacid specific).

Capatul terminal al genei este semnalat de unul din cei patru codoni "non sens" existenti, care sunt semnale de oprire a sintezei proteice.

In afara de ADN-ul cromozomial, bacteriile pot "gazdui" in mod autonom molecule mici de ADN care s-au reprodus (prin copiere) denumite plasmide.

Functiile care sunt esentiale pentru o celula bacteriana sunt, in general, codificate de cromozom, in timp ce functiile codificate de plasmide nu sunt, in general, esentiale.

Cu toate acestea, plasmidele inzestreaza celula bacteriana cu proprietati care pot fi foarte importante pentru supravietuirea bacteriilor. Plasmidele pot fi transferate de la o celula la alta, pot suferi mutatii si pot fi pierdute sau dobandite de catre celulele bacteriene, ceea ce le confera un rol important in adaptarea la mediu a bacteriilor. Rezistenta fata de antibiotice si producerea de proteine toxice, de exemplu, sunt caracteristici bine cunoscute codificate de plasmide.

Importanta plasmidelor este deosebita pentru biotehnologie, intrucat reprezinta mijloace de baza in tehnologie ADN-recombinat, fiind utilizate ca vehicule pentru introducerea in celula bacteriana a unor gene provenite de la eucariote.

Atunci cand se face referire la plasmide ca fiind molecule mici de ADN, lucrul acesta este, desigur, facut prin comparatie cu dimensiunea ADN-ului cromozomial.

Plasmidele variaza ca marime. Plasmidele mici, considerate in general ca fiind cele relevante pentru biotehnologie contin aproximativ 6000 de nucleotide.

ADN-ul cromozomial al unei bacterii contine cel putin de o mie de ori mai multe necleotide. Pe de alta parte, continutul de ADN al unui animal sau al unei plante depaseste de mai multe sute de ori pe acela al unei celule bacteriene.

Celulele bacteriene, ca si alte celule contin in citoplasma lor ribozomii ca structuri esentiale pentru sinteza proteinelor precum si o varietate de enzime si de alte biomacromolecule necesare pentru fiziologia celulei.

Totusi, in afara de cromozom, ribozomi si uneori de plasmide, in general, in citoplasma celulei bacteriene nu sunt vizibile nici un fel de alte structuri distincte, chiar si la microscopul electronic. In plus, in citoplasma celulelor procariote nu sunt prezente compartimente subcelulare.

1.5. Organizarea genomului de tip eucariot

Structura schematica a unei celule eucariote vegetale, respectiv animale este reprezentata in figurile 1.9 si 1.10.

Celula eucariota are o structura foarte complexa nu numai prin prezenta nucleului, mitocondriilor si cloroplastului (gasit in mod exclusiv in celulele vegetale) dar si prin prezenta membranelor interne specifice si a vacuolelor. De altfel, prezenta in celulele eucariotelor a membranei nucleare care delimiteaza nucleul de citoplasma reprezinta o distinctie de baza intre ecariote si procariote.

Structura complexa si compartimentala a celulei eucariote implica o comportare functionala complicata si reprezinta unul din motivele pentru care in faza initiala a biotehnologiei moderne au fost folosite, in principal, celule bacteriene simple, mai usor de manevrat si mai simplu de modificat.

In general, modul de organizare a genelor structurale din celulele de tip eucariot este mai putin cunoscut decat al genelor procariote.

Numeroase analize au dovedit ca marea majoritate a genelor structurale eucariote sunt discontinui ("split genes"), in sensul ca fragmentul de ADN din genom care codifica o proteina (exonii) este intrerupt de secvente fara echivalent proteic (intronii) si care sunt excizate printr-un proces complex de prelucrare avand ca rezultat obtinerea unui ARN-mesager matur, care, in final, este tradus intr-o proteina.

Materialul genetic (ADN) al eucariotelor este localizat la nivelul nucleului, in cromozomi. Exista de asemenea o cantitate mica de ADN citoplasmatic localizat in anumite organite, ca mitocondriile si cloroplastele , care poseda o anumita autonomie legata de existenta unei informatii ereditare proprii.

Marimea genomului la eucariote (cantitatea totala de ADN) creste in general cu gradul de complexitate a organismului.

La eucariotele superioare cum sunt mamiferele genomul poate sa contina 3-4 x 109 perechi de baza si este distribuit intr-un set de cromozomi al caror numar depinde de specie (46 de cromozomi in cazul omului).

In organizarea materialului genetic il au histonele, proteine bazice (bogate in Lys, Arg si Ala) cu masa moleculara mica si care sunt asociate cu ADN nuclear. Structura de baza a cromatinei (comozomii interfazici) corespunde nucleofilamentelor. Unitatile repetitive ale nucleofilamentelor sunt nucleozomii, care au un diametru de 10 nm si sunt formati dintr-un segment de ADN de cca. 200 perechi de baze asociat cu 8 molecule de histona (4 histone diferite, fiecare existand in dublu exemplar). ADN-ul este astfel dispus incat infasoara de doua ori partea histonica a nucleozomului. Asocierea intre 2 nuclozomi succesivi necesita un al 5-lea tip de histona care se leaga la filamentul de ADN liber cuprinzand 20-60 perechi de baze.

Polinucleozomii sunt dispusi sub forma unor super-helixuri constituind o structura complexa numita selenoid; selenoizii la randul lor pot fi organizati in configuratii de ordin superior.

Gradul de compactare a ADN-ului in nucleofilament este de 7, ceea ce insemna ca molecula de ADN este de 7 ori mai lunga decat nucleofilamentul care il contine. Acest tip complex de organizare confera ADN-ului o forma si dimensiuni compatibile cu spatiul oferit de nucleul celulei.

 1.6. Procesele implicate in fluxul informational genetic

1.6.1. Replicarea ADN-ului (copierea ADN-ului)

In timpul diviziunii celulare, informatia genetica dintr-o celula mama e transferata la celulele-fiice prin procesul numit replicarea ADN-ului.

Structura macromoleculei de ADN permite sinteza de noi molecule identice cu molecula de origine printr-un proces de copiere care consta intr-o succesiune de operatii programate genetic si care incep prin separarea celor doua catene ale ADN. Fiecare dintre cele doua catene separate serveste apoi ca matrita pentru sinteza unei noi catene complementare care se desfasoara antiparalel. Rezulta astfel 2 molecule ADN fiice identice intre ele si identice cu ADN-ul de origine, fiecare continand o catena parentala (din molecula initiala de ADN) si catena nou sintetizata (replicare 'semiconservativa').

Inalta precizie a procesului de replicare este asigurata de imperecherea specifica a nucleotidelor in noua catena, potrivit complementaritatii lor cu bazele azotate din secventa de pe matrita.

In procesul de sinteza un rol deosebit revine enzimei ADN-polimeraza care catalizeaza fixarea monomerilor deoxiribonucleotidici prin formarea de punti fosfodiesterice, cu cresterea lantului de ADN in directia 5'→ 3'.

Initierea procesului de replicare implica actiunea enzimei helicaza care intervine in despiralizarea dublului helix al ADN.

Replicarea ADN-ului incepe de la locuri specifice, denumite originile replicarii ('ori'). Cromozomul bacterian si multe plasmide au doar un singur loc ori. La genoamele eucariote care sunt mult mai mari pot exista sute de ori.

In cazul moleculelor circulare ale ADN cum ar fi cromozomii bacterieni si plasmidele exista doua cai posibile pentru replicare.

Una din cai este replicarea semiconservativa care decurge intr-un circuit inchis ca atare. Fortarea produsa de rotatie ca o consecinta a despiralarii (nu exista capat liber!) este rezolvata prin activitatea unei clase speciale de enzime, topoizomerazele.

In alte cazuri, replicarea decurge pe calea unui model de tip circuit rulant. In acest caz, replicarea incepe prin taierea uneia din catenele ADN-ului in regiunea ori.

Plasmidele bacteriene sunt definite ca fiind molecule de ADN care se replica in mod autonom. Baza acestei afirmatii este prezenta unui loc ori in plasmide. Calificativul de autonom, nu inseamna totusi ca o plasmida este independenta de factorii gazdei pentru replicare si exprimare. Unele plasmide depind de factori foarte specifici ai gazdei si in consecinta ele se pot reproduce doar in gazde specifice. Alte plasmide sunt mai putin specifice in ceea ce priveste factorul gazda, respectiv, in ceea ce priveste conditiile lor pentru factorul gazda si au capacitatea sa se replice avand un grup larg de gazde. Aceasta diferenta in ceea ce priveste domeniul gazdei este foarte importanta atunci cand plasmidele sunt exploatate in biotehnologie.

1.6.2. Transcriptia

Transcriptia (transcrierea) reprezinta procesul de sinteza al unui lant de ARN pe o matrita de ADN, sub actiunea unei enzime specifice, ARN-polimeraza.

Transcriptia ADN rezulta in molecule de ARNm care servesc ca 'intermediari' intre gena si proteina (ARNm specifica secventa aminoacizilor din proteinele ce urmeaza a fi sintetizate in procesul de translatie) dar si in alte molecule de ARN, ARN ribozomal (ARNr) si ARNt care participa ca molecule auxiliare de translatie.

Transcriptia incepe cu cuplarea enzimei ARN-polimeraza la un loc specific numit promotor sau initiator situat imediat inaintea genei operatoare care regleaza activitatea grupului de gene structurale, elemente care alcatuiesc o unitate operationala (un operon).

Initiatorii (promotorii) variaza in ceea ce priveste eficienta lor de a cupla ARN-polimeraza. Unii promotori, promotorii puternici sunt foarte eficienti, in timp ce altii sunt slabi si adesea au nevoie de factori suplimentari pentru a cupla in mod eficient ARN-polimeraza. Structurile promotoare din procariote cat si din eucariote au fost studiate in detaliu, astfel incat, in prezent, este posibil ca in biotehnologie sa se fuzioneze structurile promotoare eficace cu orice gena care se doreste a fi exprimata.

Dupa cuplarea ARN-polimerazei, helixul ADN-ului este partial despiralat si deci incepe procesul de transcriptie al unei dintre cele doua catene de ADN care serveste ca matrita pentru sinteza ARN. Spre deosebirea de replicare transcriptia este localizata la nivelul unei portiuni limitate a ADN (in functie de nevoile celulei de proteine la un moment dat).

Sinteza ARN decurge prin insiruirea ribonucleotidelor AMP, GMP, CMP si UMP ca unitati constitutive pe principiu complementaritatii bazelor azotate si conduce la o catena de ARN complementara cu catena ADN matrita si orientata antiparalel (5'→ 3'). Molecula de ARN nou sintetizata este mult mai scurta decat intreaga molecula de ADN de care se deosebeste totodata prin substitutia timinei cu uracil si deoxiribozei cu riboza si prin configuratia monocatenara.

Un semnal de sfarsit de transcriptie determina oprirea sintezei moleculei de ARN care se detaseaza de pe matrita pentru a migra in citoplasma. Acest semnal este marcat de secvente la capatul genei sau al operonului care se traduc in particularitati structurale ale ARN ce fac dificila continuarea transcrierii. O alta modalitate de terminare a transcrierii consta in interventia unui factor proteic care elibereaza lantul de ARN sintetizat. Transcriptele primare sufera apoi prelucrari posttranscriptionale care conduc la obtinerea moleculelor de ARNm, ARNr si ARNt functionale.

Reglarea transcriptiei se poate realiza la nivelul diferitelor stadii ale procesului. Astfel, proprietatile intrinseci ale initiatorului sau ale promotorului, alaturi de diferitele tipuri de proteine care pot reprima sau stimula cuplarea ARN-polimerazei, regleaza etapa de initiere a transcriptiei.

Terminarea transcriptiei este de asemenea supusa proceselor de reglare. Sub influenta unor factori fiziologici, transcriptia poate apare ca o faza prematura. Alternativ, semnalul normal pentru terminarea transcriptiei poate fi ignorat (in procesul denumit "a citi de la un cap la altul"). Acest lucru poate duce la lungimi variate ale copiilor (transcriptelor) provenite de la acelasi promotor.

In final, activitatea genei poate fi reglata, de asemenea, la nivelul ARNm format. Toate copiile sunt supuse la reactii degradare, dar vitezele acestor transformari pot varia foarte mult; unele copii au o perioada de injumatatire scurta in timp ce altele sunt foarte stabile.

Biotehnologia incearca sa influenteze exprimarea unei gene care codifica o proteina relevanta la fiecare nivel de reglare in scopul realizarii unei productii optime.

1.6.3. Translatia

Codul genetic

Informatia genetica continuta in ADN, respectiv in ARNm dupa transcriere este codificata sub forma unei secvente de nucleotide. Decodificarea acesteia se face la nivelul ribozomilor unde secventa de nucleotide din ARNm este tradusa intr-un lant polipeptidic.

Descoperirea modului in care aranjamentul specific al nucleotidelor in gena codifica secventa de aminoacizi intr-un polipeptid, respectiv descifrarera codului genetic se datoreaza cercetarilor lui Nirenberg, Ochoa, Khorana si Matthaei si reprezinta unul din evenimentele majore ale stiintei ereditatii.

In codul genetic informatia pentru sinteza unui aminoacid corespunde unui triplet de nucleotide numit codon. Cele 4 baze azotate (U, C, A, G) corespunzatoare nucleotidelor din ARNm ofera 43 = 64 posibilitati de combinare sub forma de triplete; exista deci 64 codoni mai mult decat numarul aminoacizilor esentiali (20).

Codul genetic este universal: acelasi codon specifica acelasi aminoacid la toate speciile vegetale si animale. Se poate observa existenta a 3 codoni 'non sens' care anunta terminarea sintezei proteinelor, precum si caracterul redundant al codului genetic, deoarece pentru anumiti aminoacizi exista mai multi codoni.

Ori de cate ori exista o optiune intre diferiti codoni pentru un aminoacid, diferite organisme pot avea diferite preferinte. Aceasta preferinta dependenta de organism are consecinte interesante pentru anumite procese biotehnologice.

Translatia este un proces celular extrem de complex in care moleculele de ARNm, ribozomii, aminoacizii, aminoacil-ARNt-sintetazele si o serie de factori de translatie actioneaza impreuna intr-un mod extrem de coordonat pentru sinteza unui polipeptid.

Sediul sintezei proteice, ribozomii, sunt structuri celulare formate din molecule de ARNr si proteine in asociere cu diferiti compusi (aminoacizi, enzime etc.) necesari pentru sinteza proteica.

In procesul complex de biosinteza a proteinelor se pot distinge 5 etape: activarea aminoacizilor, initierea, elongarea, terminarea sintezei si modificari posttraductionale ale proteinei.

Pentru a interactiona cu ARNm si a participa la sinteza proteinelor aminoacizii trebuie sa fie activati. Activarea aminoacizilor se realizeaza prin cuplarea lor cu o molecula specifica de ARNt datorita interventiei catalitice a enzimelor aminoacil-ARNt-sintetaze specifice si in prezenta de ATP. Aminoacidul activat este legat de capatul 3' - OH terminal al unei molecule specifice de ARNt. Fiecare molecula de ARNt contine un triplet specific intr-o bucla caracteristica in conformatia moleculei. Acest triplet este complementar si se desfasoara paralel cu codonul caracteristic pentru aminoacidul legat fiind desemnat ca anticodon.

Cuplarea printr-o asociere complementara a bazelor anticodonului din ARNt cu codonul ARNm reprezinta modul in care aminoacizii ocupa pozitii conform codului inscris in ARNm.

Translatia incepe cu formarea unui complex specific de initiere. Intr-o celula bacteriana acesta consta intr-o subunitate ribozomala 30 S, un ARNt care transporta si activeaza aminoacidul metionina, GTP si diferiti factori de initiere aflati toti la pozitia codonului de pornire AUG din structura ARNm. Pentru formarea acestui complex specific de initiere este foarte importanta regiunea capatului 5' a ARNm bacterian. Aceasta regiune, care ea insasi nu este translata, adaposteste un loc specific de legare a ribozomului. La complexul de initiere este legata ulterior o subunitate ribozomala 50S, ceea ce duce la formarea unui ribozom 70S functional.

In continuare translatia decurge cu ajutorul factorilor de elongatie specifici in asa fel incat ribozomii 70S sunt transportati treptat de-a lungul moleculei de ARNm pe distanta de un codon (triplet). Aminoacizii pusi in libertate de moleculele de ARNt specifici sunt legati unul dupa altul, prin formarea de legaturi de tip peptida. Intre timp transportorii ARNt sunt din nou pusi in libertate, pregatiti pentru a activa alte molecule de aminoacizi.

La capatul moleculei de ARNm exista unul sau mai multi codoni de oprire. Acesti tripleti nu accepta nici un fel de molecula de ARNt-aminoacil si sunt prin urmare semnale care termina sinteza proteinei. Dupa incheierea procesului, polipeptidul sintetizat este eliberat din ribozomul 70S. In continuare ribozomii revin la subunitatile lor 30S si 50S, revenirea facandu-se separat; aceste subunitati pot fi folosite in cadrul unui alt ciclu de translatie.

Pentru a deveni proteine functionale, polipeptidele obtinute prin translatie sufera adesea modificari posttranslationale ca de exemplu: indepartarea aminoacidului N-terminal (metionina la eucariote, formilmetionina la procariote), fosforilare, glicozilare, acilare, scindarea unor oligopeptide etc.

Desi exista o imagine generala comuna pentru translatie la procariote si eucariote, totusi apar si diferite deosebiri specifice, mai ales in ceea ce priveste natura factorilor de initiere si de elongatie. O distinctie evidenta este reprezentata de diferenta de organizare a ADN-ului intre procariote si eucariote. In celula procariota ARNm-ul apare deja disponibil ribozomilor desi el este inca in procesul de transcriptie. In celula eucariota, ARNm este disponibil translatiei numai dupa ce el a fost complet sintetizat si transportat prin membrana nucleara. In consecinta, transcriptia si translatia sunt procese cuplate in celula procariota in timp ce ele apar ca procese separate in celula eucariota.