PROCEDURA SPECIFICA

IZOLAREA SI IDENTIFICAREA GERMENILOR DIN GENUL STAPHYLOCOCCUS

COD : PS-LBT-0

CAP. 1. SCOP. DOMENIU DE APLICARE

SCOP

Prezenta procedura stabileste modul in care se efectueaza incercarea pentru izolarea germenilor din genul Staphylococcus din materiale patologice de origine animala.

DOMENIU DE APLICARE

Procedura se aplica in cadrul Compartimentului de Sanatate Animala pentru diferite categorii de probe de materiale patologice, receptionate si procesate in cadrul sectiei de Bacteriologie a LSVSA Cluj.

CAP. 2. DOCUMENTE DE REFERINTA SI CONEXE

DOCUMENTE DE REFERINTA

Metoda omologata- cod 1.4. Metoda de izolare si identificare a speciilor din genul Staphylococcus

PG-L-01: Controlul documentelor

PG-L-02: Analiza cererilor de oferta, ofertei si contractelor

PG-L-07: Controlul inregistrarilor

PG-L-10: Controlul echipamentelor de analiza

PG-L-11:Managementul probelor:

PG-L14: Localuri, conditii de mediu si protectia personalului

PG-L-15: Executia analizelor si asigurarea calitatii rezultatelor analizelor:

PG-L-16: Controlul datelor

DOCUMENTE CONEXE

IL-LBT-01-Instructiune de lucru Termostat MIM- 37⁰C, serie LP 1222725181, nr. inv. 2235

IL-LBT-11- Instructiune de lucru Termostat LP - 30⁰C, serie LP 123836208, nr. inv. 3111

IL-LBT-02 - Instructiune de lucru Autoclav model RAYPA AES - 75, seria : 17084,nr. Inv. 2260

IL-LBT-03 - Instructiune de lucru Balanta cu taler Gibertini,serie 107443

IL-LBT-04 - Instructiune de lucru Etuva Veb Mlw Medizinische HS 200, serie 15-191, nr. inv. 3142

IL-LBT-05 - Instructiune de lucru Microscop tip Olympus model CHS, seria 4A0274, nr. inv. 3017

IL-LBT-06- Instructiune de lucru Hota cu flux laminar Optofina, Bucuresti, nr. Inv. 2183

CAP. 3. DEFINITII SI ABREVIERI

DEFINITII

Stafilococii sunt germeni de forma rotunda, dispusi in gramezi neregulate cu aspect de ciorchine (staphylos), Gram pozitivi, cu tropism marcant pentru tesutul dermic si anexele pielii, dar cu posibilitatea de a invada orice alt tesut, avand o larga raspandire in mediul exterior.

ABREVIERI

MC MANUALUL CALITATII;

PG - PROCEDURA GENERALA DE SISTEM;

PO - PROCEDURA OPERATIONALA;

PS - PROCEDURA SPECIFICA DE INCERCARE ;

IL - INSTRUCTIUNI DE LUCRU ;

SC - SISTEMUL CALITATII ;

AC - ASIGURAREA CALITATII;

HG - HOTARARE GUVERNAMENTALA;

AI - AUDITUL INTERN ;

LBT - LABORATOR BACTERIOLOGIE;

BA - BULETIN DE ANALIZE ;

RAC - RESPONSABIL ASIGURAREA CALITATII;

EIMI - ECHIPAMENTE INCERCARE ;

DC - DOCUMENTELE CALITATII

RTL - RESPONSABILUL TEHNIC DE LABORATOR

CAP. 4. DESCRIEREA ACTIVITATII PROCEDURATE

CONDITII PREALABILE

Modul de analiza, acceptare si inregistrare a cererilor de incercare (analiza) este conform MC si PG-L-02

Receptia, verificarea, circuitul, inscriptionarea si esantionarea probelor de analizat se face conform MC si PG-L-11.

Protectia personalului

Este obligatorie purtarea halatului alb (din bumbac) de protectie si a bonetei.

Deoarece suspensiile obtinute din probele ce urmeaza a fi analizate analizate, culturile si subculturile realizate in diferite etape ale procesului analitic, cat si culturile microbiene martor folosite sunt potential contaminante, manipularea acestora se va face cu maxima precautie.

Pentru a se evita ingerarea materialului potential patogen, pipetele folosite in procesul analitic se vor asigura cu dop de vata. Dupa utilizare, pipetele se vor depune in recipiente din sticla cu solutie dezinfectanta.

Protectia mijloacelor de incercare si/sau masurare

Toata sticlaria care se foloseste in aceasta determinare se pastreaza numai sterilizata, in dulapuri sau sertare speciale, pentru a evita prafuirea, contaminarea sau deteriorarea ambalajului in care au fost sterilizate.

Balantele cu care se efectueaza cantaririle se instaleaza pe suprafete plane, fara trepidatii, in mediu lipsit de praf si schimbari bruste de temperatura.

Termostatele pentru incubarea mediilor insamantate se urmaresc zilnic si se inregistreaza in caiete speciale.

Verificarea starii de functionare si confirmare metrologica a mijloacelor de masurare si/sau incercare

Balantele, in perioada de valabilitate a verificarii metrologice/ etalonarii, se verifica periodic conform instructiunilor prevazute in Manualul Calitatii, conform PG-L-10.

In cazul termostatelor, in perioada de valabilitate a verificarii metrologice, inregistrarea temperaturii se face de doua ori/zi in fisele de monitorizare a temperaturii FG-L-14-11.

Se verifica starea tehnica a sticlariei care se va folosi la determinare.

Nu se vor utiliza mijloace de masurare a caror perioada de valabilitate metrologica este depasita, care nu functioneaza la parametrii corespunzatori sau care nu se incadreaza in clasa de precizie impusa de standardul de lucru.

Lampa bacteriologica-UV se verifica pentru eficienta sterilizarii prin teste de sanitatie de pe suprafetele asupra carora a actionat.

RESURSE NECESARE

ECHIPAMENTE DE INCERCARE SI MIJLOACE DE MASURARE

Termostat MIM- 37⁰C, serie LP 1222725181, nr. inv. 2235- IL-LBT-01

Termostat LP - 30⁰C, serie LP 123836208, nr. inv. 3111- IL-LBT-11

Termostat la 41.5^oC tip MIM, seria LP- 11612862603 - IL-LBT-12

Autoclav RAYPA AES - 75, seria 17084, nr. inv. 2260 -IL-LBT

Balanta cu taler Gibertini,serie 107443- IL-LSR-14

Etuva tip Veb Mlw Medizinische HS 200, serie 15-191, nr. inv. 3142- IL-LBT

Microscop tip Olympus model CHS, nr. 4A0274, nr. inv. 3017   - IL-LBT-05

Hota cu flux laminar tip Optofina, Bucuresti, nr. Inv. 2183 - IL-LBT

MATERIALE SI STICLARIE DE LABORATOR

eprubete sterile cu diametre diferite (16/160 mm, 18/180mm, 10/100mm);

pipete gradate sterile de 1ml;

placi Petri sterile, cu diametrul de 90 mm;

anse bacteriologice cu bucla cu diametru de aprox. 3 mm, din nichel-crom si/sau ace de insamantare si baghete sterile;

lame microscopice;

stative pentru eprubete;

pense/spatule;

MEDII DE CULTURA SI REACTIVI

Agar nutritiv- preparat conform Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Bulion nutritiv- Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Mediu Baird-Parker - Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Agar Columbia- Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Bulion cu tioglicolat- Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

mediu Vogel - Johnson - Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

medii zaharate- Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

agar cu fosfat de fenolftaleina - Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

agar Mueller - Hinton - Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

agar cu hidrati de carbon - Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Agar de sange de oaie - preparat conform Anexei B7 din SR ISO 11 290 1/2000 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Solutie de peroxid de hidrogen - preparat la cerere in laboratorul de chimie alimentara;

Glucoza

Lactoza

Maltoza

Zaharoza

Manitol

Sucroza

Trehaloza

Manoza

fosfat de fenolftaleina

citrat de sodiu sau EDTA

EXECUTIA ANALIZEI, ACTIVITATII

Pregatirea probelor se realizeaza de catre personalul executant de incercare sub supravegherea responsabilului de incercare.

Probele supuse analizei sunt reprezentate de :

secretii purulente viscerale sau cutanate, lichide cavitare, secretii si excretii, fainuri proteice, alimente, lapte mastitic, organe (cord, pulmon, ficat, rinichi, splina, tesut muscular, os lung s.a.) si tesuturi (ex. glanda mamara la bovine, ovine, caprine) etc., recoltate pe tampoane, in tuburi, serinigi, respectiv pungi din plastic cu respectarea normelor de asepsie si privind transportul de laborator.

Pentru determinare se folosesc mijloace de masurare si/sau incercare prevazute la

izolarea bacteriei

Insamantarile de fac pe medii uzuale simple (geloza, bulion nutritiv, geloza cu sange de oaie) si medii selective (hiperclorurat lichid, Chapman, agar cu piruvat de sodiu, clorura de litiu si glicocol - Baird - Parker, agar cu colistina si acid nalidixic - Columbia agar, agar cu clorura de litiu, glycol si manita - Vogel - Johnson, bulion tioglicolat etc.). Mediile selective se vor utiliza indeosebi in cazul materialelor patologice intens contaminate.

Mediile insamantate se incubeaza la 37°C timp de 24 h cu prelungirea incubatiei pana la 72 h in cazul mediilor solide atat simple cat si selective. Prelungirea incubatiei este necesara intru-cat la 24 h speciile de stafilococi nu pot fi diferentiate dupa morfologia coloniala si in plus alte specii cresc mai lent. Mentinerea placilor timp de inca 2 zile la temperatura camerei face posibila si studierea pigmentogenezei, carcateristica ce poate fi utila in identificarea unor specii.

Culturile pure se obtin prin repicarea unei singure colonii isolate - replicarea a doua sau mai multor colonii chiar si identice poate conduce la obtinerea unei culturi mixte cuprinzand, eventual si specii care nu sunt implicate in procesul infectios. Daca in culturile primare nu sunt colonii izolate se vor face dispersii din culturile in medii lichide pe geloza cu sange si/sau medii selective care vor fi incubate in aceleasi conditii.

identificarea speciilor si subspeciilor

- se face pe baza caracterelor culturale indeosebi a morfologiei coloniale (formei coloniei), caracteristicilor mofotinctoriale, a proprietatilor metabolice si de patogenitatea experimantala. Dintre multiplele teste necesare diferentierii se inscriu in anexa cele mai importante pentru principalele specii semnificative pentru patologie.

Caractere culturale:

In mediile de cultura lichide stafilococii cresc abundent, cu o turbiditate uniforma si depozit usor omogenizabil, in timp mediu devenind limpede. Destul de frecvent, la suprafta formeaza o pelicula inelara.

Pe suprafata mediilor solide majoritatea stafilicocilor formeaza in 24 h, in conditii de aerobioza, colonii cu diametrul de pana la 3 mm, iar in decurs de 4-5 zile marimea lor este de 3 pana la 10 mm. Unele specii, cum ar fi S. auricularis, S. sacharolyticus, S. equorum, S. lentus si S. aureus subsp. anaerobius formeaza colonii mici detectabile numai dupa 24-36 h.

S. aureus creste sub forma de colonii mari (pana la 8 mm in diametru), netede, rotunde, opace, cremoase si usor bombate. Majoritatea tulpinilor produc colonii pigmentate> alb, gri, galben-pai, galben-auriu, galben-citrin, galben-portocaliu. Tulpinile care poseda capsula mai abundenta formeaza colonii mai mici si mai convexe si suprafata de aspect umed, iar in timp devin vascoase si aluneca pe suprafata mediului. Unele tulpini, indeosebi cele izolate din cazuri de mamite ale vacilor, formeaza colonii pitice, transparente. Pe mediile cu manitol tulpinile manito-pozitive produc colonii galbene si colorarea in galben a mediului din jur urmare a acidifierii.

Pigmentogeneza ofera unele informatii privind originea si patogenitatea tulpinilor. Astfel, pigmentul galben-auriu este caracteristic tulpinilor patogene de origine umana, pigmentul alb-cenusiu este produs de tulpinile patogene de origine animala, iar pigmentii alb-cretaceu, galben-citrin si galben-portocaliu caracterizeaza, in general, tulpinile nepatogene. In anaerobioza S. aureus nu produce pigment.

Coloniile produse de S. epidermidis sunt mai mici (diametru de 2-6 mm) si nepigmentate. Unele tulpini pot sa produca colonii galbui, maronii sau violet, coloratia fiind mai intensa in centrul coloniei.

S. saprophyticus formeaza colonii mari, de 5-8 mm in diametru, netede, lucioase, opace, untoase si mai convexe In proportie de aprox. 50% tulpinile apartinand acestei specii produc pigment de la crem la galben-potocaliu.

S. intermedius si S. hyicus produc colonii mari (diametrul de 5 pana la 8 mm), usor convexe, netede, lucioase cu margini regulate si de obicei nepigmentate.

S. haemolitycus produce, de obicei, colonii mari (5-9 mm), netede, untoase, opace, aproximativ jumatate din tulpini formand colonii pigmentate de la crem la galben.

S. lugdunensis formeaza colonii mari de 4-7 mm, netede, lucioase colorate de la crem la galben-portocaliu, alte tulpini fiind nepigmentate. Marginea coloniilor este usor aplatizata, iar centrul bombat sau ascutit.

Caractere morfologice

In frotiurile colorate Gram, efectuate din culturi, stafilococii se prezinta sub forma sferica de coci, Gram-pozitivi, grupati in gramezi mari (in cazul mediilor solide) sau mici (in mediile lichide sau materialele patologice). In frotiurile efectuate din materiale patologice se pot observa si coci fagocitati de neutrofile. In culturile vechi precum si in cazul stafilococilor fagocitati din materialele patologice apar colorati Gram-negativi datorita proceselor de degradare a peretelui celular. Frotiurile din materiale patologice este indicat a fi colorate cu albastru de metilen. Pentru evidentierea capsulei prezenta la unele tulpini, frotiurile se coloreaza cu tus de China.

Caractere biochimice si biologice

Activitatea hemolitica

S. aureus elaboreaza 4 tipuri de hemolizine care actioneaza asupra hematiilor de oaie, iepure sau bou (hemolizina alfa, beta, gamma si delta) ultima fiind produsa numai in cazul culturii bacteriei in anaerobioza. In mod curent studiul activitatii hemolitice se face pe geloza cu 5% sange de oaie defibrinat.

Hemolizina a produce o zona de hemoliza totala, iar hemolizina b o zona de hemoliza partiala, dar care se intensifica devenind totala in situatia in care culturile se trec de la 37 C la 4 C.

In afara de S. aureus si alte specii prezinta activitate hemolitica> S. delfini, S. schleiferi subsp. coagulans, S. caprae, S. haemolyticus.

Activitate zaharolitica

S.aureus fermenteaza in aerobioza lactoza, glucoza, maltoza sucroza, trehaloza, manoza, zaharoza, manitolul. Fermentarea manitolului ofera si unele indicii privind patogenitatea tulpinii cercetate.

Activitatea catalazica

Cu exceptia S. aureus subspecia anaerobius si S. sacharolyticus, toate celelalte specii si subspecii prezinta activitate catalazica prompta. Testulu este util si pentru diferentierea primara a stafilococilor de streptococi care sunt catalazo-negativi.

Activitatea coagulazica

Studiul capacitatii de producere a coagulazei reprezinta testul cel mai utilizat pentru aprecierea patogenitatii tulpinilor de S. aureus, S. intermedius, S. delfini si S. hycus.

In mod curent se efectueaza testul de coagulare in tub care evidentiaza coaglaza libera si consta ln amestecarea a 0,9 ml suspensie de germeni cu 0,1 ml plasma recoltata pe EDTA, incubarea amestecului la 37 C si urmarirea formarii coagului in intreval de 30 de minute - 3 ore. In cazul prelungirii incubatiei pana la 24 ore pot apare rezultate fals - negative (unele tulpini produc stafilokinaza care poate liza coagulul) sau fals - pozitive ( suspensia de germeni nu este pura). Folosirea plasmei citrate, deasemeni, prezinta dezavantajul ca poate conduce la rezultate fals - pozitive daca inoculul contine si bacterii (ex. streptococi) care prin utilizarea citratului determina coagularea plasmei.

Ca alternativa, se poate recurge la testul de coagulare pe lama, mai rapid (aparitia coagului in 10 sec.) si mai economic ( suspensia de germeni se amesteca cu o picatura de plasma) dar el trebuie verficat prin testul de coagulare in tub intrucat 10-15% din tulpinele de S. aureus dau rezultate negative iar in cazul prelevarii de pe medii hiperclorurate pot apare reactii fals pozitive urmare a autoaglutinarii.

Activitatea fosfatazica

S. aureus, S. intermedius, S. schleiferi, S.hyicus si 85-90% din tulpinile de S. epidermidis produc fosfataza alcalina iar S. lugdunensis, S. saprophyticus si S. haemolyticus sunt fosfatazo-negative. Activitatea fosfatazica se studiaza pe medii care contin fenolftaleina difosfat sau fenolftaleina monofosfat. Aceste substraturi sunt descompuse de fosfataza cu eliberare de fenolftaleina a carei prezenta se pune in evidenta prin adaugarea la cultura a 0,5 ml solutie de aminoantipirina (6%) si solutie 2,4% de ferocianura de potasiu sau prin utilizarea benzilor imbibate cu amoniac 25%. Culoarea rosu intens indica activitate fosfatazica.

Alte teste biologice

Pentru identificarea diferitelor specii de stafilococi pot fi utilizate si alte teste complementare cum ar fi> activitatea pirolidonil-arilamilazica, ornitin-decarboxilazica, ureazica, b-galactozidazica, productia de acetoina din glucoza sau piruvat, rezistenta la novobiocina, rezistenta la polimixin B, rezistenta la meticilina s.a.

De asemeni, in cadrul studiilor epidemiologice, se recurge la tipizarea fagica a tulpinilor izolate, la determinarea compozitiei plasmidice sau la determinarea tipului enzimatic plasmidic si tipului cromozomial al ADN, lucrari care, in prezent nu fac obiectul activitatii laboratoarelor de diagnostic curent.

Teste importante pentru identificarea principalelor specii ale genului Staphylococcus

a simboluri> 90% sau mai mult, tulpini pozitive< 90% sau mai mult, tulpini slab pozitive< - 90% sau mai mult, tulpini negative< d, 11 pana la 89%, tulpini pozitive< ( - ), reactii tardive.

CAP. 5. ACTIVITATI FINALE

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Conform interpretarii rezultatelor, se raporteaza prezenta sau absenta germenilor din genul Staphylococcus in proba examinata, indicand dupa caz specia identificata.

CAP. 6. RESPONSABILITATI

Limite de autoritate

Pentru executarea in bune conditii a prezentei proceduri limitele de autoritate sunt:

Responsbalitati

Director Executiv

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura.

Sef de Laborator

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura si coraboreaza datele prezentate in buletinul de analiza.

Sef Birou Sanatate Animala

aproba cererea de analiza si primirea probei pentru incercare,

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura si coraboreaza datele prezentate in buletinul de analiza,

verifica prin sondaj, rezultatele incercarilor

Responsabilul de incercare

supervizeaza executia incercarii;

raspunde de corectitudinea executiei;

elaboreaza opinii si interpretari asupra rezultatelor inscrise in buletinul de analiza, prin compararea cu reglementari si normative in vigoare,

redacteaza buletinele de analiza, cu observatiile si concluziile aferente;

valideaza executia incercarii;

confirma rezultatul prin semnatura.

verifica nutritivitatea si selectivitatea mediilor de cultura;

gestioneaza tulpinile de referinta

Executantii de analiza

inregistreaza proba in registrul de analiza;

completeaza fisele analitice ale probelor si toate inregistrarile calitatii referitoare la incercarea din prezenta procedura specifica

inregistreaza in fisele de temperaturi ale aparatelor valorile citite

executa sub supravegherea specialistilor operatiile de pregatire a probelor;

executa incercarea conform regulilor din procedura specifica;

verifica functionarea mijloacelor de masurare si/sau incercare;

pregatesc si aseptizeaza spatiile si suprafetele de lucru;

conditioneaza si verifica starea sticlariei utilizata in incercare;

tehnoredacteaza buletinul de analiza

comunica responsabilului de incercare orice problema aparuta in timpul operatiilor efectuate;

CAP. 7. INREGISTRARI

Registru unic primire probe diagnostic cod R-L-11-1

Registru de diagnostic Necropsic si Bacteriologic cod R-L-11-55

buletine de analiza FG-L-13-01

fisa de diagnostic bacteriologic FL-LBT-01

fisa de monitorizare a temperaturii FG-L-14-11

fisa pentru evidenta tulpinilor de referinta FL-LBT-54

fisa de evidenta a materialelor sterilizate la etuva FL-LBT-56

fisa de solicitare medii de cultura Fl-LBT-57

fisa preparare si aprovizionare cu solutii FL-LBT-58

fisa pentru evidenta control sterilitate si valoare nutritiva a mediilor de cultura FL-LBT-59

fisa pentru evidenta autoclavarii infectelor FL-LBT-60

fisa interna de gestionare a deseurilor din laboratoare FO-L-08-09

CAP.8. ANEXE

Fisa pentru evidenta tulpinilor de referinta FL-LBT-54

Fisa de diagnostic bacteriologic FL-LBT-01

Fisa de evidenta a materialelor sterilzate la etuva FL-LBT-56

Fisa de solicitare medii de cultura: FL-LBT-57

Fisa preparare si aprovizionare cu solutii FL-LBT-58

Fisa pentru evidenta control sterilitate si valoare nutritiva a mediilor de cultura FL-LBT-59

ANEXA 1

ANEXA 2

ANEXA 3

ANEXA 4

MEDII DE CULTURA

ANEXA 5

Nr. crt	Data prepararii	CANTITATEA	pH-ul	Valabilitatea	Laboratorul unde se prepara	Semnatura
Directia Sanitara Veterinara si pentru Siguranta Alimentelor Cluj Laborator Sanitar Veterinar de Stat CLUJ   Pag:  din

ANEXA 6

ANEXA 7