PRINCIPIILE TEHNICILOR DE CLONARE SI ANALIZA A ADN

PRINCIPIILE TEHNICILOR DE CLONARE SI ANALIZA A ADN

Cercetarile medicale din cadrul programului Proiectul genom uman (Human Genome Project), incepute in anul 1990, au fost finalizate in anul 2005. Acest program are ca obiective principalele:

cartografierea genica - stabilirea localizarii pe cromozomi a fiecareia din cele aproximativ 20.000-30.000 de gene;

alcatuirea hartilor fizice - masurarea distantei fizice care separa genele;

secventierea - stabilirea ordinii in care cele peste 3 miliarde de nucleotide care alcatuiesc genomul uman se succed in moleculele ADN.

Termenul ADN recombinant se refera la combinatiile ce pot fi obtinute intre anumite secvente de ADN uman sau de la alte organisme si molecule de ADN bacterian sau de la alte specii; aceste combinatii noi au atat capacitatea de a se replica nelimitat, formand clone de ADN, cat si de a exprima informatia genetica pe care o contin intr-o celula-gazda.

Hibridizarea acizilor nucleici

Hibridizarea reprezinta o etapa oligatorie a multora dintre tehnicile ADN recombinant.

ADN extras din celule este dublu catenar. In conditii fiziologice, molecula de ADN este foarte stabila, in sensul ca legaturile dintre elementele unei catene si dintre cele doua catene de obicei nu se pot separa (conditie esentiala pentru materialul ereditar).

Sub actiunea unor enzime, cele doua catene se pot separa partial, pe segmente scurte, si pot functiona ca matrita pentru sinteza unor molecule noi, complementare: ADN in procesul de replicare si ARNm in cursul transcrierii.

In conditii experimentale, incalzirea la 100^oC sau expunerea la un mediu alcalin (pH>13) determina desfacerea legaturilor de hidrogen dintre nucleotidele complementare, urmata de separarea celor doua catene, proces denumit denaturare. Procesul de reasociere a catenelor pe baza complementaritatii, renaturarea, se produce spontan in conditiile racirii lente. Prin racire brusca, monocatenele ADN raman separate si pot fi folosite, tot pe baza complementaritatii dintre catene, pentru obtinerea de hibrizi ADN-ADN, intre molecule de ADN provenite de la specii diferite sau intre fragmente de ADN obtinute artificial (sonde), sau de hibrizi ADN-ARN.

Asocierea pe baza complementaritatii a unor secvente nucleotidice diferite ca origine se numeste hibridizare. Monocatenelor ADN sau ARN introduse deliberat in mediul de renaturare li se poate atasa sau incorpora un marker; in aceasta situatie ele capata denumirea de sonde genotipice. Marcarea probelor poate fi realizata izotopic (prin incorporare de ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I, ³H) sau nonizotopic (de exemplu, prin incorporare de dioxigenina).

Detectarea marcajului radioactiv se face, de regula, autoradiografic; vizualizarea marcajului nonizotopic presupune cuplarea sondei cu un agent decelabil prin metoda fluorescentei sau prin colorimetrie.

Sensibilitatea si selectivitatea reactiilor de hibridizare sunt deosebit de inalte: o sonda recunoaste o secventa-tinta complementara printre milioane de alte secvente diferite si se fixeaza stabil de aceasta. In acest fel se poate detecta secventa sau gena ce poseda o secventa ADN complementara sondei utilizate.

Cele doua mari categorii de tehnici ale ADN recombinant sunt: clonarea ADN si analiza ADN.

1. Clonarea ADN

Clonarea ADN consta in producerea unui numar mare de copii ale unei secvente de ADN pe baza procesului de replicare a ADN. Clonarea se poate efectua in vivo (clonare celulara), cand este utilizat procesul natural de replicare, sau in vitro (clonare acelulara), prin reactia de polimerizare in lant (PCR).

1.1. Clonarea ADN in vivo

Clonarea ADN in vivo se realizeaza in mai multe etape.

1) Obtinerea fragmentelor de ADN

● Fragmentele de ADN care vor fi amplificate si analizate ulterior pot fi obtinute prin sectionarea ADN cu ajutorul enzimelor de restrictie.

Enzimele de restrictie (ER) sunt endonucleaze bacteriene (tabel 1) care scindeaza moleculele ADN (prin hidroliza legaturilor fosfodiester dintre nucleotide) la nivelul unor zone strict specifice generand fragmente de lungimi variabile, denumite fragmente de restrictie (FR). O caracteristica esentiala a enzimelor de restrictie o constituie specificitatea actiunii lor: o ER isi exercita activitatea endonucleazica numai asupra unei anumite secvente nucleotidice (cu lungime de cateva perechi de baze), denumita situs de restrictie (SR) sau situs de recunoastere si clivare.

Pentru fiecare ER exista in genom numeroase SR, iar distanta care separa aceste situsuri este foarte diferita. In urma actiunii unei anumite ER vor rezulta, deci, o multitudine de FR de lungimi variate, ce pot fi separate electroforetic.

Sectiunile pe care le efectueaza cele mai multe dintre ER nu sunt situate, de obicei, la acelasi nivel pe cele doua catene ale moleculei de ADN; ca urmare, pe o portiune de cateva nucleotide cape-tele fragmentelor vor fi monocatenare: la unul dintre capete vor fi desperecheate nucleo-tidele unei catene, iar la celalalt - nucleotidele catenei opuse (figura 1). Acest mod de actiune are o importanta practica deosebita, deoarece fragmentele ADN generate de o aceeasi ER, avand capete coezive, pot fi facute sa se sudeze intre ele, pe baza de complementaritate, chiar daca au origini complet diferite, rezultand o molecula hibrida de ADN recombinant.

● O alta metoda de a obtine fragmente de ADN sau gene utilizeaza ARN mesager, produsul de transcriptie al genei. Molecula monocatenara de ARNm, extrasa dintr-o celula care il sintetizeaza in cantitati mari, serveste ca matrita pentru sinteza unei catene de ADN complementar (ADNc) sub actiunea enzimei transcriptaza inversa; prin complementaritate, se sintetizeaza si cea de-a doua catena, obtinandu-se astfel o molecula de ADNc bicatenar care corespunde exonilor genei.

Tabel 1. Exemple de enzime de restrictie

2) Formarea moleculelor de ADN recombinant

Dupa obtinerea fragmentelor de ADN uman, este necesara multiplicarea fragmentului. In acest scop, fragmentele sunt inserate in vectori de clonare si cu ajutorul lor sunt introduse intr-o celula-gazda (bacterie etc.), unde se vor multiplica. Unirea a doua fragmente de ADN de origini diferite produce o molecula de ADN recombinant. Pentru aceasta, moleculele de ADN din cele doua surse sunt sectionate cu aceeasi ER, producand capete identice, care se unesc pe baza de complementaritate, iar fragmentele sunt unite cu ajutorul unei ADN-ligaze.

a. Vectorii sunt molecule naturale de ADN utilizate pentru a transporta seventele de ADN de analizat si care au capacitatea de a se replica independent de genomul gazdei. Principalele tipuri de vectori utilizati sunt plasmidele, bacteriofagii si cosmidele.

▫ Plasmidele sunt componente ale bacteriilor, facandu-le rezistente la diferite antibiotice. Sunt alcatuite dintr-o molecula mica de ADN circular, dublu catenar extracromozomial, a carei replicare se produce independent de cromozomul bacterian.

▫ Bacteriofagii sunt virusuri care infecteaza si distrug bacteriile, replicandu-se de asemenea, independent si rapid; sunt alcatuiti din ADN dublu catenar liniar. In tehnicicle de clonare cel mai frecvent se utilizeaza bacteriofagul lambda (λ) care ataca E. coli.

▫ Cosmidele sunt vectori artificiali - hibrizi formati dintr-un plasmid si situs cos al bacteriofagului λ.

Vectorii in care s-a introdus un fragment de ADN exogen se numesc vectori recombinanti.

3) Transformarea si amplificarea

Moleculele de ADN recombinant sunt transferate in celule-gazda (cel mai frecvent bacterii nepatogene modificate) in care vectorii recombinanti se vor multiplica independent de cromozomul bacterian, producand mai multe copii identice. Introducerea unui vector intr-o celula bacteriana se numeste transformare.

Bacteriile transformate sunt multiplicate. In cazul utilizarii vectorilor plasmidici, celulele bacteriene sunt insamantate pe o placa de agar, in care se plaseaza si o gena de rezistenta la antibiotic, precum si antibioticul fata de care s-a indus rezistenta. Bacteriile transformate devin rezistente si isi continua multiplicarea, fiecare dintre ele formand o colonie sau clona (populatie de celule identice, provenite dintr-o singura celula). Totalitatea coloniilor, respectiv a fragmentelor de restrictie clonate, care contin si ADN de analizat, formeaza o asa-numita banca sau biblioteca de clone ADN (DNA library). In functie de colectia de FR pe care o contin, acestea sunt biblioteci de ADNc (care cuprind numai secventele nucleotidice ale genelor active transcriptional) si biblioteci genomice.

Intrucat clona continatoare a FR de interes nu are nici un caracter distinctiv (bibliotecile sunt "fara catalog"), se procedeaza la screening-ul sistematic al tuturor coloniilor sau placilor de liza. Secventa cautata poate fi identificata direct (prin hibridizare cu sonde complementare) sau indirect (prin purificarea proteinelor produse de clonele bacteriene si recunoasterea lor cu anticorpi monoclonali).

Amplificarea prin clonare ramane insa o procedura laborioasa, complicata si mare consumatoare de timp.

1. Clonarea ADN in vitro (metoda PCR)

Clonarea ADN prin reactia polimerizarii in lant (PCR - polymerase chain reaction) este o metoda al carei principiu se bazeaza pe procesul replicarii semiconservative in vitro si prin care se realizeaza amplificarea selectiva si rapida a unei secvente scurte de ADN sau ARN (a carei structura nucleotidica este partial cunoscuta). Procedura este extrem de simpla, economica si in intregime automatizata.

Esantionul ADN, intr-o cantitate foarte mica (care poate proveni dintr-o singura celula), este introdus intr-un tub continand urmatorii reactivi: o ADN - polimeraza termostabila - Taq (extrasa din bacteria termofila Thermus aquaticus), cele patru dezoxiribonucleotide trifosfat si doua oligonucleotide sintetice denumite amorse sau primeri. Amorsele, a caror secventa nucleotidica trebuie sa fie complementara cu secventele ADN care flancheaza capetele segmentului ce urmeaza sa fie amplificat, constituie punctele la nivelul carora se initiaza activitatea ADN polimerazei. Intr-o prima etapa, segmentul de ADN de amplificat este denaturat termic (la 95°C), rezultand un amestec de fragmente monocatenare. In al doilea timp, prin racire usoara, amorsele se pozitioneaza si hibridizeaza cu secventele complementare (situate la capatul 3') de pe fiecare catena. In a treia etapa, pornind de la amorse, ADN-polimeraza incepe sa adauge dezoxiribonucleotide in sensul 5'-3' pe matritele reprezentate de monocatenele segmentului tinta. Reincalzirea mediului determina initierea unei noi reactii de polimerizare. Procesul se desfasoara ciclic: la sfarsitul a n cicluri, in mediul de reactie vor exista 2ⁿ molecule de ADN dublu catenar, copii ale sectiunii ADN aflata intre amorse.

Cantitatea optima este obtinuta dupa mai putin de 30 cicluri de reactie, cand in tub vor exista cate 10⁹ copii ale secventei initiale. Durata unui ciclu fiind de 5 minute, rezulta ca aceasta cantitate va fi obtinuta in aproximativ 3 ore.

Metoda accepta ADN provenit din cele mai variate surse (celule din frotiuri, pete de sange, sperma sau foliculi pilosi etc.). Dezavantajele majore ale metodei sunt necesitatea cunoasterii secventelor capetelor ADN-tinta (pentru fabricarea amorselor), cantitatea foarte mica de produs si frecventa destul de mare a erorilor de imperechere.

Metoda PCR este aplicata si pentru molecule de ADN complementar: RT-PCR (reverse transcriptase PCR).

Metode de analiza a acizilor nucleici

La nivel de cercetare, analiza ADN permite studiul structurii genelor si a genomului uman. In practica medicala, permite, in principal, studiul bolilor produse de mutatii ale ADN si diagnosticul unor boli (prenatal sau inainte de instalarea simptomelor). In acest scop, genele din bibliotecile de ADN trebuiesc recunoscute pe baza principiului hibridizarii acizilor nucleici.

1. Analiza ADN genomic uman prin tehnica Southern blot

Cele cateva sute de mii de fragmente de restrictie care rezulta din digestia genomului uman cu enzime de restrictie (ER) pot fi separate prin metoda electroforezei in gel. Moleculele ADN au o incarcatura electrica negativa, migrand astfel catre anod, cu o viteza invers proportionala cu greutatea lor moleculara. Fragmentele de restrictie separate electroforetic se dispun intr-un ansamblu reproductibil de benzi ADN care sunt invizibile in gelul de agaroza; evidentierea lor se realizeaza prin impregnarea gelului cu un colorant specific pentru ADN (bromura de etidiu) care in lumina ultravioleta devine fluorescent.

Analiza structurii fragmentelor rezultate prin digestie cu ER se realizeaza prin metoda marcarii radioactive a ADN, cunoscuta sub numele de Southern blot. Ea se desfasoara in mai multe etape (figura 4):

1) fragmentarea ADN genomic extras din celule, prin clivarea cu o enzima de restrictie corespunzatoare;

2) separarea fragmentelor de restrictie prin electroforeza, pe baza dimensiunii lor;

3) denaturarea chimica a fragmentelor ADN bicatenare incluse in gel;

4) transferarea prin capilaritate (blotting) a monocatenelor de pe gelul de agaroza pe o membrana de nailon sau de nitroceluloza; se obtine, astfel, o replica a modelului de benzi din gelul de agaroza;

5) hibridizarea moleculelor ADN de pe membrana cu o sonda ADN sau ARN marcata radioactiv, complementara cu secventa urmarita; se vor forma complexe dublu catenare stabile in zonele membranei in care se afla secventele complementare;

6) detectarea autoradiografica a complexelor dublu catenare (dupa contactul membranei cu un film foto).

Prin aceasta tehnica se poate evidentia prezenta sau absenta unui fragment de ADN-tinta, obtinut din ADN genomic. Importanta majora pentru medicina a analizei Southern blotting consta in capacitatea ei de a detecta polimorfismele lungimii fragmentelor de restrictie (restriction fragment length polymorphisms - RFLPs) si, prin aceasta, de a functiona ca instrument de diagnostic ADN indirect.

Aceeasi procedura poate fi aplicata si pentru ARN, purtand denumirea de Northern Blot, iar pentru proteine - Western Blot.

Analiza cu sonde oligonucleotidice specifice alelelor (allele specific oligonucleotides - ASO).

ASO reprezinta o metoda importanta de diagnostic a bolilor monogenice produse de mutatii a caror baza moleculara este cunoscuta. Metoda utilizeaza ca sonde doua sau mai multe oligonucleotide sintetice (15-20 pb), dintre care unul corespunde (in sensul complementaritatii bazelor) secventei genice normale, iar celelalte secventelor modificate prin mutatie.

Metoda ASO este larg utilizata in diagnosticul prenatal al unor afectiuni produse de mutatii punctiforme. Un exemplu de boala genetica al carei diagnostic poate fi stabilit in primul trimestru al sarcinii prin analiza ASO este cel al anemiei drepanocitare. Boala are drept cauza o mutatie punctiforma interesand codonul 6 - GAG - al genei care codifica lanturile b-globinice ale hemoglobinei. In urma mutatiei, codonul GAG se transforma in GTG, consecinta fiind substituirea acidului glutamic cu valina in pozitia 6 a lantului aminoacidic al b-globinei. Diagnosticul presupune utilizarea unei sonde complementare cu secventa specifica genei normale (sonda contine in portiunea centrala tripleta CTC) si a unei sonde in a carei secventa se afla tripleta CAC (aceasta va interactiona specific cu codonul alterat al genei patologice). Daca ADN extras din celulele lichidului amniotic hibridizeaza numai cu sonda specifica mutatiei, afectarea fatului este certa; hibridizarea cu ambele sonde releva starea de heterozigot, iar reactia negativa cu sonda pentru gena patologica exclude prezenta bolii.

3. Hibridizarea in situ

Hibridizarea in situ reprezinta o tehnica in care, dupa hibridizare cu secventele specifice din moleculele ADN sau ARN, sondele marcate izotopic sau chimic sunt vizualizate direct pe preparatele celulare sau cromozomiale. Datorita rezolutiei insuficiente si perioadei lungi de timp necesara obtinerii rezultatelor, tehnicile care folosesc probe marcate radioactiv tind sa fie complet abandonate, in locul lor fiind utilizata tehnica denumita FISH (fluorescence in situ hibridization) sau hibridizare in situ prin marcare fluorescenta, relativ simpla si nu foarte costisitoare. Fluorocromii utilizati sunt acidul 7-amino-4-metilcumarin-3 acetic (AMCA) (fluorescenta albastra), fluoresceina (fluorescenta verde) sau Texas red (fluorescenta rosie).

Tehnica FISH este aplicata in citogenetica moleculara pentru:

analiza cromozomilor metafazici sau a nucleilor interfazici cu sonde ADN;

"pictarea" cromozomilor (chromosome painting), care detecteaza cromozomi singulari sau numai parti componente (centromer, telomere);

detectarea intregului genom - de exemplu M-FISH (Multicolor-FISH: 24 culori)