Biocatalizatori in medii neconventionale. aplicatie in valorificarea bio-glicerolului ca precursor in domeniul biorafinariei

BIOCATALIZATORI IN MEDII NECONVENTIONALE. APLICATIE IN VALORIFICAREA BIO-GLICEROLULUI CA PRECURSOR IN DOMENIUL BIORAFINARIEI

Abstract

Proiectul propune realizarea si caracterizarea unor noi tipuri de catalizatori enzimatici pe baza de lipaze aplicati in domeniul valorificarii bio-glicerolului ca produs secundar cu pondere majora rezultat in urma fabricarii biodieselului. Proiectul are un caracter dual. In primul rand, se propune un studiu teoretic asupra comportamentului catalitic al biocatalizatorilor construiti prin imobilizarea enzimei lipaza pe suprafata micro/nano-particulelor magnetice in medii neconventionale de tip lichide ionice si apa saraca in deuteriu. Din punct de vedere practic, proiectul propune o noua metoda de sinteza biocatalitica a carbonatului de glicerol prin transesterificarea biocatalitica a bio-glicerolului in prezenta catalizatorilor de tip lipaza studiati. Astfel, se lanseaza ideea unei noi metode de valorificare a bio-glicerolului avand rol de precursor al unui produs de biorafinarie, carbonatul de glicerol.

Biocatalizatorii rezultati vor fi caracterizati cu tehnici precum SPR si detectie Electrochimica. Se va realiza un studiu laborios al comportamentului catalitic al biocatalizatorilor (activitate catalitica, chemo-, regio- si enantioselectivitate) in medii neconventionale (ex. lichide ionice si apa saraca in deuteriu) in scopul elucidarii mecanismului catalitic in conditiile mentionate.

Aplicarea biocatalizatorilor-lipaza in sinteza biocatalitica a carbonatului de glicerol implica generarea unor sisteme experimentale biocatalitice originale atat prin design-ul bioreactorului (structuri de tip lipaza-particula magnetica actionate de un camp magnetic alternativ) cat si prin principiul de functionare al sistemului bazat pe recircularea unui flux continuu a amestecului de reactie (glicerol si dimetil carbonat) in interiorul sistemului. Experimentele propuse vor permite optimizarea sistemelor biocatalitice si in final valorificarea lor in obtinerea eficienta a carbonatului de glicerol.

Introducere

Traim o era dominata de necesitatea descoperirii de noi surse regenerabile de energie a caror utilizare sa nu aduca un prejudiciu mediului inconjurator ci, chiar mai mult, sa permita crearea unui parteneriat intre productia de energie si Chimia Verde ^[1]. In acest context, biomasa, sursa regenerabila de carbon, are un loc important in noul portofoliu al surselor de energie pentru un viitor previzibil. Un exemplu in acest sens este biomasa produsa in industria alimentara care, desi constitue reziduu in procesul de fabricare al alimentelor, este considerata hrana pentru industria energetica. Astfel, uleiul rezidual generat de fast-food-uri poate fi re-utilizat pentru generare de energie prin transformarea acestuia in biodiesel ^[2]. Uleiul vegetal crud (nerafinat) cat si anumite tipuri de plante sunt, deasemenea, biocarburanti in fabricarea biodiesel-ului. In prezent exista o strategie politica la nivel european care incurajeaza utilizarea biocarburantilor pentru industria energetica. Acelasi proces biodiesel - sursa de energie, produce si bio-glicerol ca produs secundar utilizat ca precursor pentru obtinerea unor produse chimice valoroase si folosite pe scara larga intitulate generic produse de biorafinarie.

Biorafinaria este un nou concept al zilelor noastre analog rafinariei petrolului (carburanti si produse petroliere). In domeniul Biorafinarie sunt inclusi carburantii, energia si chimicalele generate pe baza procesului de conversie a biomasei. Astfel, industria biorafinariei este identificata ca o ramura de viitor a industriei care se bazeaza pe bio-resurse. Toate acestea sunt doar cateva aspecte din realitatea cotidiana in care conceptul de energie este strans legat de conceptul de biomasa si biorafinarie.

Bio-Glicerolul este cel mai important produs secundar in productia biodieselului din biomasa ^[3]. In ultima perioada, productia biodieselului la nivel mondial a cunoscut o crestere exploziva. Astfel, productia biodieselului in Europa anului 2009 a depasit valoarea de 20 909 milioane de tone ^[4]. Ca o consecinta directa, glicerolul crud (nepurificat) a fost produs in cantitati care, in curand, vor depasi cerintele actuale ale pietei de desfacere constitutind o serioasa problema de mediu prin stocarea lui. Ideea producerii unei cantitati enorme de bio-glicerol este automat asociata cu pierderi enorme de energie si resurse materiale. Mai mult, o hiperproductie de glicerol poate genera o scadere semnificativa a pretului acestuia. Pe baza acestor perspective, in 2008 Bryan Sims trage un semnal de alarma in Biodiesel Magazin: In ciuda cerintei continue de glicerol crud pe piata de export, in special in China si America, producatorii implicati in domeniul productiei de biodiesel trebuie sa gaseasca alternative de utilizare a produsului secundar bio-glicerol, cu preponderenta acolo unde nu este necesara purificarea glicerolului, aceasta fiind o procedura foarte costisitoare. In sprijinul acestei idei, se incearca exploatarea de metode alternative in cadrul activitatii de cercetare pentru descoperirea de noi domenii de utilizare a glicerolului crud ^[5].

In acest context activitatea de cercetare la nivel industrial a fost deja directionata catre noi aplicatii ale bio-glicerolului, ca sursa ieftina, in concordanta cu politica Chimiei Verzi si tehnologiilor corespunzatoare. Astfel, s-a lansat ideea producerii unor derivati functionali ca produsi de baza sau ca precursori in sintezele organice fine ^[6]. Ca exemple concrete pot fi amintite bateriile calculatoarelor de tip laptop si iPod, cat si solutiile de antigel care in curand vor contine bio-glicerol. Deasemenea, numeroase articole publicate in jurnalul Biodiesel Magazine descriu studii de cercetare recente care pun in evidenta posibilitatile multiple de valorificare a bio-glicerolului prin conversie in hidrogen, lapte imbunatatit, etanol, produse din plastic si lubrifianti (Biodiesel Magazine 2005-2008) ^[7]. Toate aceste aspecte demonstreaza faptul ca un rol crucial in domeniul biorafinariei il joaca chimia bio-glicerolului ^[8], ceea ce motiveaza interesul cercetatorilor in domeniul valorificarii bio-glicerolului.

Avand in vedere cerintele si tendintele actuale expuse, acest proiect propune generarea de noi biocatalizatori integrati intr-un sistem biocatalitic cu design original pentru valorificarea bio-glicerolului nepurificat prin transformarea acestuia in carbonat de glicerol. Avantajele economice ale sintezei propuse sunt in primul rand utilizarea unei materii prime ieftine (bio-glicerolul), a unor reactivi netoxici pentru mediul inconjurator (ex. catalizatori de tip lipaza, dimetil carbonat, lichide ionice, apa saraca in deuteriu, etc.), generarea unor cantitati scazute de reziduuri, consum energetic scazut, in concordanta cu principiile Chimiei Verzi.

Carbonatul de glicerol (4-hidroximetil-1,3-dioxalan-2-ona) este un material relativ nou introdus in industria chimica dar cu un potential larg de utilizare: componenta a membranelor de separare in faza gazoasa, solvent nevolatil pentru mai multe tipuri de materiale (ex. coloranti, lacuri, medicamente, detergenti, adezivi si produse cosmetice), precursor in aplicatii biomedicale, etc. Este, de asemenea, considerat un bun biolubrifiant datorita faptului ca adera usor la suprafete metalice si rezista la presiuni ridicate cat si la actiunea unor agenti de oxidare sau hidroliza ^[9]. Mai mult, carbonatul de glicerol este utilizat ca materie prima in sinteza materialelor polimerice de tip glicidol - precursor important al industriei polimerice ^[10]. Unul dintre furnizorii importanti pe piata europeana ai polimerilor de tip glicidol este compania germana Hyperpolymers ^[12]. O alta aplicatie importanta a compusilor de tip poliglicerol este producerea de cosmetice si medicamente ^[11].

In prezent, sinteza la scara industriala a carbonatului de glicerol implica 2 etape. In prima etapa oxidul de etilena reactioneaza cu dioxidul de carbon cu formarea carbonatului ciclic de etilena. In a doua etapa, carbonatul de glicerol si etilenglicerolul sunt generate in urma reactiei glicerolului cu carbonatul de etilena ^[13].

Cunoscand reactiile care stau la baza tehnologiei industriale de obtinere a carbonatului de glicerol, putem discuta constructiv optimizarea metodei care sa permita imbunatatirea fezabilitatii procesului industrial cu referire directa la reducerea numarului de etape, diminuarea toxicitatii reactivilor si a cantitatii de reziduu format. Un studiu al literaturii de specialitate a scos in evidenta faptul ca nu exista inca date experimentale publicate care sa satisfaca aceste cerinte. In mod traditional, carbonatii cu structura ciclica sunt preparati pe baza reactiei dintre glicerol si fosgen. Natura toxica si coroziva a fosgenului constitue principalele dezavantaje ale acestei metode. In continuare, se vor prezenta succint alternativele propuse pana in prezent, in literatura de specialitate, pentru sinteza carbonatului de glicerol. O metoda presupune carbonatarea directa a glicerolului cu dioxid de carbon in conditii supercritice. Reactia se desfasoara in prezenta catalizatorilor de tip zeoliti, rasini schimbatoare de ioni ^[14], sau complexi de tipul n-Bu₂Sn(OCH₃)₂, n-Bu₂SnO and Sn(OMe)₂ ^[15]. O alta metoda de sinteza propune utilizarea ureei in reactie cu glicerolul folosind catalizatori de tip oxizi metalici cu proprietati bazice, fosfat de -zirconiu sau hidrotalcit ^[16]. Alchil si di-alchil carbonatii sunt reactivi de transesterificare pentru glicerol in sinteza carbonatului de glicerol. Ca exemplu, dietil/dimetil carbonatul sunt frecvent utilizati in carbonatarea glicerolului in prezenta catalizatorilor alcalini ^[17]. Ca o caracteristica generala, sintezele amintite mai sus necesita conditii "dure" de reactie cat si etape suplimentare pentru purificarea produsilor de reactie (distilare sau extractie). Deasemenea, sintezele supuse discutiei nu permit obtinerea unor conversii mari pentru produsul de interes.

Proiectul propus lanseaza ideea unei noi alternative pentru sinteza carbonatului de glicerol care sa elimine inconvenientele enumerate mai sus. Astfel, se propune utilizarea de materii prime netoxice (glicerol si dimetil carbonat) si biocatalizatori (lipaze) capabili sa promoteze reactia de carbonatare propusa in conditii blande de reactie (ex. mediu de reactie la pH neutru/solvent organic, temperatura si presiune ambianta, etc.). Mai mult, mediul de reactie propus este de tip lichid ionic sau mediu apos (apa saraca in deuteriu) ca alternativa la utilizarea solventilor organic volatili, potential toxici pentru mediul inconjurator.

Referinte bibliografice:

[1] J. H. Clark, V. Budarin, F. E. I. Deswarte, J. J. E. Hardy, F. M. Kerton, A. J. Hunt, R. Luque, D. J. Macquarrie, K. Milkowski, A. Rodriguez, O. Samuel, S. J. Tavener, R. J. White and A. J. Wilson, Green Chemistry 2006, 8, 853-860.

[2] www.biodiesel.org.

[3] M. A. Dasari, P. P. Kiatsimkul, W. R. Sutterlin and G. J. Suppes, Applied Catalysis A: General 2005, 281, 225-231.

[4] https://www.ebb-eu.org/biodiesel.php.

[5] https://www.biodieselmagazine.com/article.jsp?article_id=2866.

[6] M. Rossi, M. Pagliaro, R. Ciriminna, C. Della Pina and W. Kesber, WO2006051574 2004.

[7] https://www.biodieselmagazine.com/index.jsp.

[8] https://www.nrel.gov/biomass/biorefinery.html.

[9] D. Herault, A. Eggers, A. Strube and J. Reinhard, DE101108855A1 2002.

[10] G. Rokicki, P. Rakoxzy, P. Parzuchowski and M. Sobiecki, Green Chemistry 2005, 7, 529.

[11] M. Pagliaro, R. Ciriminna, H. Kimura, M. Rossi and C. Della Pina, Angewandte Chemie International Edition 2007, 46, 4434-4440.

[12] www.hyperpolymers.com.

[13] A. Behr, J. Eilting, K. Irawadi, J. Leschinski and F. Lindner, Green Chemistry 2008, 10, 13.

[14] C. Vieville, J. W. Yoo, S. Pelet and Z. Mouloungui, Catal. Lett.

[15] a) M. Aresta, A. Dibenedetto, F. Nocito and C. Pastore, J. Mol. Catal. A: Chem. , 257, 149; b) J. George, Y. Patel, S. M. Pillai and P. Munshi, Journal of Molecular Catalysis A: Chemical 2009, 304, 1-7.

[16] a) M. Aresta, A. Dibenedetto, F. Nocito and C. Ferragina, Journal of Catalysis 2009, 268, 106-114; b) Q. Li, W. Zhang, N. Zhao, W. Wei and Y. Sun, Catal. Today 2006, 115, 1; c) J. W. Yoo and Z. Mouloungui, Stud. Surf. Sci. Catal. 2003, 146, 757; d) M. J. Climent, A. Corma, P. De Frutos, S. Iborra, M. Noy, A. Velty and P. Concepción, Journal of Catalysis 2010, 269, 140-149.

[17] M. G. Alvarez, A. M. Segarra, S. Contreras, J. E. Sueiras, F. Medina and F. Figueras, Chemical Engineering Journal accepted manuscript at 21-12-2009.

Obiective

Prepararea si caracterizarea biocatalizatorilor pe baza de lipaze

Implicarea Enzimologiei in procesele biotehnologice la scara industriala a constituit un progres important al industriei conducand la utilizarea enzimelor la nivel modial. Astazi, exista o gama variata de enzime folosite cu succes in procese biotehnologice industriale. Acestea fac parte cu preponderenta din clasa enzimelor hidrolitice (ex. proteaze, amulaze, amilaze, esteraze si lipaze). Dintre acestea, lipazele constitue in prezent enzima-cheie care permite o dezvoltare rapida a Biotehnologiei in aplicatii industriale multiple cum ar fi producerea detergentilor, prelucrarea produselor alimentare, farmaceutice, cosmetice, textile, piele si in industria hartiei. Lipazele sunt folosite si in procese de biotransformare si tratare a deseurilor, in bioremediere. De asemenea, ele au aplicatii medicale fiind componente ale sistemelor de biosenzori sau de sinteza a medicamentelor ^[1].

De ce sunt preferate lipazele ca si catalizatori pentru procesele biotehnologice?

Lipazele sunt enzime-catalizator pentru reactiile de hidroliza a triacilglicerolilor in medii apoase. In micro-medii apoase, lipazele au caracteristica unica de a cataliza reactii reversibile de tipul esterificare, alcoliza si acidoliza. Posedand capacitate catalitica duala (activitate lipolitica si esterolitica), pot interactiona cu o gama diversificata de substraturi. De asemenea, lipazele-catalizator prezinta specificitate ridicata cum ar fi chemo-, regio- si enantioselectivitate ^[2]. O alta caracteristica unica a acestor enzime este conservarea si uneori amplificarea activitatii catalitice in medii organice (solventi organici). Forma catalitic activa a lipazele nu necesita prezenta unui cofactor ceea ce exclude aparitia reactiilor secundare. Aceste enzime pot fi produse in cantitati mari cu costuri aferente reduse in medii biologice cum ar fi microorganisme microbiene, ciuperci sau bacterii. Cunoasterea mecanismului de secretie al lipazelor a permis in prezent elaborarea unor strategii la nivelul ingineriei genetice care sa genereze lipaze modificate genetic cu caracteristice catalitice imbunatatite in functie de cerintele biotehnologice. Toate aceste avantaje au transformat lipazele in biocatalizatorii cei mai utilizati la nivel industrial. Acest fapt este confirmat de numeroasele articole-review care descriu aspecte diferite evidentiind caracterului versatil al biocatalizatorilor de tip lipaza, cum ar fi procese biochimice, metode de analiza, aspecte din biologia moleculara, metode de purificare si aplicatii biotehnologice ^[3].

Acest proiect propune prepararea de biocatalizatori pe baza de enzima - lipaza (biocatalizatori-lipaza) cu aplicabilitate in procesul de transesterificare biocatalitica a glicerolului cu dimetil carbonat la carbonat de glicerol. Catalizatorii utilizati in prezent in sinteza carbonatului de glicerol sunt baze de tipul NaOH sau KOH ^[4]. Inlocuirea catalizatorilor anorganici bazici cu catalizator-enzimatic atrage dupa sine cateva avantaje majore pentru sinteza invocata, si anume: conditiile de reactia nu sunt surse de poluare pentru mediul inconjurator (temperatura si presiune la valori apropiate de cele ambientale), reactantii si catalizatorul utilizati nu sunt toxici iar cantitatile de reziduuri generate in urma reactiei enzimatice sunt mult mai mici decat cele obtinute in cazul sintezelor utilizate pana in prezent.

Vor fi utilizate diferite tipuri de lipaze corespunzatoare tulpinilor Candida antarctica, Mucormiehei, Candica rugosa, Pseudomonas fluorescence, Candida cylindracea, Aspergillus niger, Pseudomonas cepacia, etc. Cunoscand faptul ca reactia propusa pentru sinteza carbonatului de glicerol in cataliza enzimatica conduce adesea la produsi de reactie dificil de izolat si de identificat ^[5], se va urmari cu preponderenta imbunatatirea selectivitatii lipazelor propuse spre studiu la produsul-target - carbonat de glicerol. De asemenea, in paralel, vor fi studiate in conditii similare lipaze cu structuri modificate genetic ^[6]. Scopul acestor activitati experimentale este cel de screening catalitic primar pentru stabilirea lipazelor cu activitate catalitica si selectivitate corespunzatoare cerintelor sintezei propuse, lipaze care vor fi utilizate ulterior in prepararea biocatalizatorilor finali.

Enzimele supuse investigatiei vor fi caracterizate in sisteme omogene si heterogene. In sisteme omogene, enzima catalizator va fi solubilizata in mediul de reactie, in timp ce sistemele heterogene vor implica imobilizarea enzimei pe suporturi solide. Sistemele heterogene prezinta un interes deosebit in cazul particular al lipazelor deoarece stabilitatea si chiar selectivitatea (in speta enantioselectivitatea) catalizatorului-lipaza pot fi modificate ca o consecinta directa a naturii suportului si a procedurii de imobilizare ^[7]. Din literatura de specialitatea, se cunoaste faptul ca lipazele sunt activate catalitic in medii hidrofobe ^[8]. Prin analogie, suprafetele hidrofobe ale suporturilor ar trebui sa aiba o actiune similara de activare asupra lipazelor. De aceea se propune depunerea lipazelor investigate pe suporturi a caror suprafata de contact enzima-suport sa prezinte proprietati hidrofilice si/sau hidrofobice (ex. Sol-gel, ciclodextrine, etc.). Evaluarea activitatii catalitice se va realiza pentru fiecare caz in parte evidentiind in acest fel influenta naturii suportului asupra activitatii catalitice a enzimei. Se va pune accent deosebit pe testarea lipazelor modificate genetic. Astfel, se va putea observa daca modificarile structurale ale moleculei enzimatice afecteaza centri catalitici activi ai enzimei.

Un alt aspect urmarit al metodologiei de preparare va fi influenta metodei de imobilizare asupra activitatii catalitice a lipazelor. Ca modele de investigatie se vor folosi metodele de imobilizare covalenta si necovalenta. Se va evalua activitatea catalitica a enzimei imobilizate pentru ambele tipuri de metode. In literatura de specialitate exista numeroase publicatii dedicate comportamentului catalitic al lipazelor in urma imobilizarii covalente (legarea directa a enzimei de suport sau prin intermediul moleculelor-spacer prin legaturi de tip -CO-NH- sau -S-R-) ^{[7b, 9]}. De aceea, acest proiect isi propune realizarea unui studiu cu preponderenta asupra proprietatilor catalitice ale lipazelor imobilizate necovalent (adsorptie simpla sau in prezenta de nafion, incapsulare, pe baza interactiilor electrostatice sau cross-linking). Practic, proprietatile catalitice ale lipazelor vor fi evaluate prin tehnici precum Surface Plasmon Rezonance (SPR) si detectie Electrochimica, ceea ce constitue un element de originalitate al proiectului.

Surface Plasmon Rezonance (SPR) a fost introdusa la inceputul anilor '90 pentru caracterizarea interactiei biomoleculare in cadrul biosenzorilor de afinitate (ex. enzima-substrat si anticorp-antigen) ^[10]. SPR se bazeaza pe un fenomen optic care apare la suprafata unui metal (aur sau argint) cand lumina incidenta bombardeaza suprafata sub un anumit unghi de incidenta. In functie de grosimea stratului molecular la suprafata metalului, fenomenul SPR consta in modificarea intensitatii luminii reflectate ^[11]. Astfel, aceasta tehnica permite determinarea cu acuratele a moleculelor depuse pe suprafete solide rigide si eventuala interactie cu molecule ligand. SPR este folosita cu preponderenta in caracterizarea interactiilor de afinitate (enzima-substrat, anticorp-antigen) deoarece permite masuratori in timp real (on line) a cinetii bio-interactiilor. Ca aplicatii dezvoltate pe baza tehnicii SPR pot fi amintite: determinari cinetice pentru interactii ligand-receptor, hibridizarea DNA, caracterizarea anticorpilor policlonali, studiul conformational al proteinelor si imunoanaliza fara label ^[12].

In acest proiect, tehnica SPR alaturi de tehnica de detectie Electrochimica va permite investigarea in timp real (online) a influentei suportului si a procedurii de imobilizare asupra activitatii catalitice a lipazelor imobilizate. SPR va permite determinarea cantitatii de enzima imobilizata pe suport cat si evaluarea activitatii catalitice a enzimei imobilizate, in timp ce, tehnica de detectie electrochimica va fi utilizata pentru confirmarea datelor privind activitatea catalitica a enzimei imobilizate in comparatie cu enzima libera in solutie. In final se va alege candidatul-enzima ideal pentru prepararea catalizatorului dedicat sintezei carbonatului de glicerol care sa indeplineasca criteriile impuse cu referire la activitate catalitica si selectivitate.

Echipa de cercetare propusa pentru acest proiect are deja o experienta solida in domeniul imobilizarii proteinelor implicand metode de imobilizare si caracterizare a proteinelor de tip enzima si anticorp (a se vedea sectiunea 9.4.1.1.1.), ceea ce constitue o garantie a succesului acestui proiect.

Investigarea "efectului de solvent" asupra performantelor biocatalizatorilor

Activitatea catalitica a lipazelor este preponderent influentata de caracteristicile mediului de reactie. Acest fapt se datoreaza interdependentei dintre mecanismului catalitic si structura moleculei de lipaza. Molecula lipazei prezinta o zona ce actioneaza ca un "capac" pentru centrul catalitic activ al enzimei, restrictionand accesul substratului in functie de conditiile experimentale. Un mediu de reactie hidrofobic sau chiar molecule-substrat cu caracter hidrofobic induce o modificare conformationala generand forma activa a enzimei (orienteaza "capacul" in pozitia "deschis" si permite accesul substratului la centrul catalitic). Prezenta interactiilor hidrofilice duce la inchiderea accesului catre centrul catalitic activ al enzimei ^[8]. Complexitatea mecanismului catalitic al lipazele ingreuneaza modelarea si controlul procesului biocatalitic corespunzator atat in laboratorul de cercetare cat si la scara industriala ^[7b].

Cunoscand aceste probleme, proiectul propus lanseaza ideea modularii activitatii enzimatice a lipazele pe baza "efectului de solvent" folosind medii de reactie (solventi) neconventionale (lichide ionice si apa saraca in deuteriu). Se va investiga, prin metoda comparatiei, comportamentul catalitic al lipazelor in medii conventionale (ex. solutii apoase si solventi organici de tip tetrahidrofuran, n-heptan, etc.) si neconventionale (lichide ionice si apa saraca in deuteriu).

De ce lichide ionice in cataliza pe baza de lipaze?

Lichidele ionice sunt saruri cu punct de topire scazut (<100 ⁰C), lichide la temperatura ambianta sau apropiata de aceasta, nevolatile (un avantaj major fata de solventii organici), cu capacitate ridicata de a dizolva compusi chimici cu structuri variate si usurinta de creare de sisteme bi-fazice cu solventi organici. Aceste proprietati fac din lichidele ionice o alternativa atractiva la solventii organici in special in reactiile de biocataliza enzimatica^[13]. Cercetarile realizate in aceasta directie au aratat ca in multe reactii enzimele prezinta activitate catalitica si selectivitate (regio-/enantio-selectivitate) mai ridicata in lichid ionic decat in solvent organic ^[14]. De asemenea, stabilitatea termica si operationala a enzimei poate fi imbunatatita in mediu de lichid ionic ^{[13d, 15]}.

Pe baza acestor observatii certificate de literatura de specialitate, se propune utilizarea lichidelor ionice ca atare sau in combinatie (ex. lichid ionic-solutie apoasa, lichid ionic-solvent organic) ca mediu de reactie pentru sinteza carbonatului de glicerol. Lichidele ionice propuse pentru testare sunt : 1-butil-3-metil-imidazoliu hexaflorofosfat, 1-butil-3-metil-imidazoliu tetrafloroborat, 1-butil-3-metil-imidazoliu hexaflorofosfat, 1-metil-3-octil-imidazoliu hexaflorofosfat, trioctil-metil-amoniu bis(trifloro-metil-sulfonil)imida, tetraalchil amoniu sulfat, sulfat de amoniu si metil-trioctil-amoniu trifloroacetat. Se va testa comportamentul catalitic al lipazelor in lichidele ionice enumerate si se va stabili influenta hidrofilicitatii/hidrofobicitatii mediului de reactie asupra comportamentului catalitic al enzimei. Experimentele propuse vor evidentia eventualele interactii care se pot stabili intre lichidul ionic si enzima testata prin aparitia de modificari la nivelul structurii tertiare a enzimei^[15c] modificari care au ca rezultat variatia activitatii catalitice (activare/inhibitie a enzimatica). Un alt aspect urmarit va fi gradul de solubilizare a reactivilor si a produsilor de reactie in lichidul ionic investigat functie de polaritatea acestuia. Se va urmari dependenta profilului de reactie fata de structura moleculara si proprietatile lichidului ionic.

Echipa de cercetare propusa (in special Iunia Podolean) are o buna experienta in domeniul utilizarii lichidelor ionice pentru reactii catalitice (sectiunea 9.4.1.2.1) existand si in prezent subiecte de cercetare in desfasurare care implica lucrul cu acest tip de compusi.

De ce apa saraca in deuteriu pentru cataliza pe baza de lipaza?

Apa saraca in deuteriu sau apa "usoara" este apa cu un continut redus de izotopi fata de forma naturala (114 ppm). Pana in prezent nu se cunoaste cu certitudine rolul deuteriului in organismul uman, dar cercetarile in aceasta directie au evidentiat faptul ca o scadere a concentratiei deuteriului la nivelul tesutului si chiar al celulei poate incetini multiplicarea celulelor canceroase. Astfel, orice modificare asupra proprietatilor apei generata de variatia continutului izotopic are un ecou puternic in activitatea la nivelul celulei organice. Este de mentionat ca apa saracita in deuteriu nu este toxica.

Investigatiile stiintifice asupra proprietatilor apei saracite in deuteriu au inceput abia in anul 1993 si continua in prezent ^[16]. Cercetatorii romani au o importanta contributie in realizarile stiintifice din acest domeniu, contributie care este recunoscuta chiar la nivel mondial. Apa saraca in deuteriu se produce la nivel national in cadrul ICSI Rm. Valcea. Produsul comercializat se numeste AQUA FORTE si are un important impact social prin efectul profilactic si terapeutic asupra organismului uman si animal ^[17].

In acest proiect se propune o investigare amanuntina a comportamentului enzimatic in mediu de apa saracita in deuteriu. Astfel, se va putea evalua influenta concentratiei de izotopi asupra enzimelor de tip lipaza. Se propune prepararea mediului apos de reactie (solutie tampon) folosind apa saraca in deuteriu. Se va studia comparativ activitatea catalitica a lipazei in mediu conventional (solutie tampon in apa distilata) si neconventional (solutie tampon in apa saraca in deuteriu).

Construirea sistemului biocatalitic pe baza de lipaze

Se va construi o instalatie biocatalitica experimentala, pentru sinteza carbonatului de glicerol din glicerol si dimetil carbonat ^[5], in care se va integra biocatalizatorul-lipaza preparat si testat in conditiile prezentate anterior (a se vedea obiectivul 1 si 2).

Conditiile de reactie (temperatura < 60 ⁰C, presiunea atmosferica, reactivi netoxici) cat si selectivitatea imbunatatita in carbonat de glicerol reprezinta avantaje majore ale utilizarii biocatalizatorilor de tip lipaza fata de metodele conventionale in uz. Pana in prezent in literatura de specialitate sunt cunoscute doar doua publicatii dedicate sintezei enzimatice a carbonatului de glicerol ^{[5, 18]}. In ambele cazuri mediul de reactie propus este de tip solvent organic (tetrahidrofuran si n-hexan). Cercetarile realizate s-au limitat la elucidarea mecanismului de reactia si caracterizarea amestecul enantiomeric rezultat in urma reactiei (racemic). O astfel de limitare este de inteles atata timp cat la nivelul anilor 1994, momentul publicarii primului studiu, nu exista un interes economico-social asupra produsului de sinteza (carbonatul de glicerol). In contextul realitatii de astazi, cercetatorii au re-evaluat importanta acestui subiect si in consecinta, la nivelul anilor 2007, cercetarile in acest domeniu au luat un nou avant mai ales in problematica sintezei si implementarii carbonatului de glicerol in diferite sectoare de interes economic.

In prezent exista numeroase teme de cercetare asupra diferitelor aspecte ale sintezei carbonatului de glicerol pe cale biocatalitica. Cateva exemple in acest sens sunt: conversia redusa a glicerolului, stabilitatea si regio-/enantio-selectivitatea catalizatorului-lipaza, otravirea catalizatorului cu produs secundar de reactiei (metanol). Toate acestea demonstreaza actualitatea si totodata originalitatea subiectului propus in cadrul acestui proiect.

Iata de ce, in acord cu tendintele actuale de cercetare in domeniu, proiectul propune construirea unui sistem biocatalitic experimental original pentru sinteza biocatalitica a carbonatului de glicerol. Sistemul va fi compus din urmatoarele parti: bioreactor pe baza de lipaza, valva cu pozitii multiple, pompa peristaltica si colector de metanol.

Designul bioreactorului constitue unul din elementele de originalitate ale sistemului, deoarece enzima poate fi pozitionata atat pe peretele lateral (fata interioara) a reactorului cat si distribuita omogen in cavitatea reactorului (dispersata in faza lichida). Ce ofera flexibilitate in modelarea bioreactorului? Raspunsul este nano-/microparticulele magnetice pe care sunt imobilizate moleculele de enzima (generand structura particula-lipaza). Actiunea unui camp magnetic exterior pozitioneaza biocatalizatorul (in speta particula-lipaza) in regiunea dorita din interiorul reactorului.

Particulele magnetice, in general sunt nano-/microsfere de oxid de fier (Fe₃O₄ or g-Fe₂O₃) acoperite cu un material polimeric care permite atasarea covalenta/fizica in general a proteinelor (ex. enzime, anticorpi, etc.). Manipularea acestor particule cu ajutorul unui camp magnetic constitue avantajul major al utilizarii lor. Astfel, se poate imbunatati cinetica procesului catalitic prin reducerea spatiului de difuzie dintre reactivi si centri catalitici, se imbunatateste transferul de masa, sistemul functioneaza la presiune mica, exista o suprafata extinsa de contact solid-lichid. Sisteme care implica particule magnetice sunt usor utilizabile avand o buna perspectiva pentru automatizare si miniaturizare. Recent, dimensiunea particulelor magnetice a fost adusa la scara nano, ceea face posibila manipularea lor in suspensie eliminand posibilitatea acumularii sub forma de agregate (unul din putinele dezavantaje ale utilizarii microparticulelor magnetice).

Particulele magnetice care vor constitui suport solid pentru enzima in aplicatia de fata vor avea dimensiuni variabile la scara micro si nano. Suprafata exterioara a particulei va fi acoperita cu un strat polimeric cu proprietati corespunzatoare (asa cum se va stabili experimental in activitatile anterioare dedicate caracterizarii lipazelor). Moleculele de lipaza vor fi imobilizate pe suprafata particulelor magnetice cu metode de imobilizare stabilite anterior generand structuri de tip particula-lipaza. Pentru manipularea structurilor particule-lipaza se va folosi un sistem electromagnetic care va genera un camp magnetic alternativ orientat in directii diferite, ceea ce va permite dispersarea particulelor-enzima in volumul de reactie simuland "dizolvarea" enzimei in faza de reactie. Ca o consecinta, cinetica interactiei catalitice va fi imbunatatita (se scurteaza distanta difuziei reactantilor la centri catalitici), timpul de reactie va fi diminuat si, in consecinta, procesul va fi caracterizat de o eficienta mai buna.

Studiul de literatura realizat demonstreaza ca designul propus pentru bioreactorul-lipaza este unic. De asemenea, este de adaugat faptul ca echipa de cercetare care va realiza activitatea stiintifica propusa (in special prin intermediul directorului de proiect) are deja experienta in realizarea unor sisteme de tipul celui propus (un sistem similar a fost construit cu succes pentru extractia si concentrarea analitului de interes direct din probe reale pe baza interactiei de afinitate anticorp-antigen) (a se vedea sectiunea 9.4.1.1.1).

Sistemul propus va functiona in regim de flux continuu recirculat. Cu ajutorul pompei peristaltice (componenta a sistemului) amestecul de reactie va fi recirculat in interiorul sistemului, implicit prin bioreactor, ceea ce va impiedica o acumulare a metanolului generat ca produs secundar. Mai mult, dinamica sistemului permite colectarea metanolului in afara biorectorului (in "cutie" cu site moleculare pentru retinerea metanolului) impiedicand o eventuala diminuare a activitatii catalitice la nivelul lipazei prin inhibare/otravire cu metanol. Un alt avantaj al sistemului propus este acela ca produsii de reactie sunt "maturati" continuu din interiorul bioreactorului ceea ce deplaseaza echilibrul reactiei catre obtinerea de noi produsi, imbunatatind conversia glicerolului.

Activitatea experimentala propusa va presupune o etapa de optimizare a sistemului biocatalitic in cadrul careia se va evalua influenta parametrilor experimentali asupra eficientei bio-sintezei carbonatului de glicerol. (ex. concentratia reactantilor, temperatura, presiunea, viteza fluxului, etc.). Caracterizarile cantitative si calitative asupra produsilor de sinteza se vor realiza pe baza tehnicilor gaz cromatografie cuplata cu spectrometrie de masa (GC-MS) si ionizare in flacara (GC-FID). Mecanismul procesului biocatalitic in mediul neconventional va fi investigat folosind sistemul biocatalitic construit si optimizat. De asemenea se propune elaborarea unui model matematic care sa simuleze mecanismul catalitic studiat.

Realizarea obiectivelor stiintifice propuse va constitui in final baza de succes a acestui proiect. Beneficiile acestui proiect se vor concretiza in dezvoltarea unei noi alternative de sinteza pentru un produs cu larga utilizare in industrie, carbonatul de glicerol, valorificand eficient fractia de biomasa de tip bio-glicerol rezultata din productia biodieselului.

Proiectul propus insumeaza multe aspecte inovative, aspecte care au fost prezentate anterior in descrierea obiectivelor stiintifice. Pentru a evidentia caracterul de noutate si unicitate al acestei propuneri de proiect, se vor enumera in continuare elementele de originalitate si importanta lor la nivelul cercetarii stiintifice si industriale:

Prepararea biocatalizatorilor pe baza de enzime modificate genetic, ca o modalitate de imbunatatire a performantelor biocatalizatorilor enzimatici si oferire a unei noi perspective ingineriei genetice in domeniul biotehnologic.

Evaluarea efectului naturii suportului si metodei de imobilizare asupra activitatii catalitice a lipazelor. Se va pune accent pe caracterizarea comportamentului catalitic al lipazei in cazul imobilizarii necovalente. Experimentele se vor realiza in sistem dual SPR-Electrochimic. Pe baza acestor experimente se va elabora un model matematic si practic al mecanismului de reactie biocatalitic studiat.

Comportamentul catalitic al lipazelor va fi urmarit in medii neconventionale de tipul lichide ionice si apa saraca in deuteriu. Este de subliniat faptul ca interactia enzima-lichid ionic este un subiect "fierbinte" al cercetarii actuale. Noutatea in acest caz o constitue utilizarea apei saracite in deuteriu ca mediu de reactie in cataliza enzimatica cu lipaze. In acest fel, proiectul propus ajuta la directionarea Chimiei Bio-Glicerolului catre domeniul Chimiei Verzi.

Designul biorectorului presupune folosirea micro-/nanoparticulelor magnetice si a unui camp magnetic alternativ. Alte elemente de originalitate care apar la capitolul sistem biocatalitic sunt: prezenta unui flux continuu recirculat in interiorul sistemului si existenta unei "cutii" pentru acumularea metanolului in afara bioreactorului.

Se estimeaza ca succesul acestui proiect va avea un important impact stiintific si social. Acest proiect poate fi privit ca un scenariu de succes pentru realizarea unei activitati de cercetare-orientata cu un factor de impact important asupra comunitatii de cercetatori la nivel european. Ca o prima garantie va fi dezvoltarea activitatii de cercetare stiintifica a institutiei gazda (catedra de Chimie Tehnologica si Cataliza, Facultatea de Chimie, Universitatea din Bucuresti). Concret, sprectrul aplicatiilor biocatalitice de laborator va fi imbunatatit cu o noua alternativa. Valorificarea activitatii stiintifice a proiectului va fi reprezentata de articolele stiintifice publicate in reviste cu factor de impact ridicat (ex. Journal of Catalysis, Green Chemistry, ChemCommun, etc.), rapoarte explicite ale datelor experimentale obtinute in urma studiului de laborator din cadrul proiectului. De asemenea, se vor realiza comunicari in cadrul manifestarilor stiintifice de specialitate de tip conferinte, simpozioane si congrese nationale si internationale.

Reusita acestui proiect va consta in elaborarea unei metode de sinteza a carbonatului de glicerol respectand cerintele politicii Chimiei Verzi, ceea ce se va constitui intrun avantaj major pentru aplicarea metodei in domeniul industriei. Sistemul biocatalitic rezultat va putea fi integrat in schema biotehnologica pentru producerea industriala a carbonatului de glicerol si mai departe, pentru polimerizarea glicerolului la compusi denumiti generic poligliceroli. Astfel, cunoasterea caracteristicilor sistemului, cum ar fi functionalitate, versatilitat, performanta, sunt argumente pentru folosirea acestuia la scara industriala.

Proiectul propus va putea stabili o noua relatie de cercetare intre universitate si industrie, ca o punte de legatura intre teorie si practica, ceea ce constitue in prezent un aspect important al politicii comunitatii Europene. Un alt avantaj al derularii acestui proiect il va constitui formarea de noi cercetatori de viitor din randul membrilor echipei propuse. Cercetatorii tineri vor avea posibilitatea dobandirii de noi cunostinte teoretice si experienta practica in domeniul Biotehnologiei. In acelasi timp, directorul de proiect va acumula experienta manageriala dezvoltand si conducand un grup de cercetare tanar. Acest fapt ii va permite o dezvoltare viitoare independenta atat la nivel stiintific cat si managerial.

Pe langa toate cele prezentate, succesul acestui proiect va contribui la revigorarea si cresterea importantei rolului pe care il are "femeia" in cercetare, deoarece echipa de cercetare propusa este compusa numai din femei-cercetator.

Acest proiect are un caracter interdisciplinar, propunerea stiintifica descrisa bazandu-se pe cunostinte teoretice din mai multe ramuri ale Chimiei, Biologiei si Fizicii. Pentru exemplificare se poate aminti (din descrierea obiectivelor proiectului facuta anterior) ca prepararea si caracterizarea biocatalizatorilor va necesita notiuni si principii din Enzimologie, Chimia Organica si Chimia Anorganica, constructia si optimizarea sistemului biocatalitic va impune o activitate de cercetare la granita dintre Tehnologie, Biologie, Chimie (Organica si Anorganica) cat si Fizica. Activitatea de cercetare interdisciplinara constitue un atuu al experientei de laborator pentru directorul de proiect (a se vedea sectiunile 9.4.1.1.1 si 9.4.1.1.2). In plus, membrii echipei de cercetare propusa sunt familiarizati atat cu notiunile teoretice cat si cu aspectele practice ale domeniilor de cercetare invocate in propunerea de proiect (a se vedea sectiunea 9.4.1.2).

Referinte bibliografice:

[1] a) F. Hasan, A. A. Shah and A. Hameed, Enzyme and Microbial Technology 2006, 39, 235-251; b) R. Gupta, N. Gupta and P. Rathi, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004, 64, 763-781.

[2] K.-E. Jaeger and T. Eggert, Curr. Opin. Biotechnol. 2002, 13, 390-397.

[3] a) F. Beisson, A. Tiss, C. Riviere and R. Verger, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2000, 133-153; b) R. Gupta, P. Rathi, N. Gupta and S. Bradoo, Biotechnol. Appl. Biochem. 2003, 37, 63-71; c) R. K. Saxena, A. Sheoran, B. Giri and S. Davidson, J. Microbiol. Methods 2003, 52, 1-18; d) Z. Y. Shu, H. Jiang, R. F. Lin, Y. M. Jiang, L. Lin and J. Z. Huang, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2010, 62, 1-8; e) A. Bajaj, P. Lohan, P. N. Jha and R. Mehrotra, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2010, 62, 9-14.

[4] A. C. Pinto, M. J. C. Rezende, N. M. Ribeiro, E. A. Torres, W. A. Lopes, P. A. Pereira and J. B. de Andrade, J. Braz. Chem. Soc. 2005, 16, 1313-1330.

[5] S. C. Kim, Y. H. Kim, H. Lee, D. Y. Yoon and B. K. Song, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2007, 49, 75-78.

[6] a) M. T. Reetz and K.-E. Jaeger, Topics Curr. Chem. 1999, 200, 31-57; b) K.-E. Jaeger and M. T. Reetz, Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 68-73.

[7] a) G. Fernandez-Lorente, M. Terreni, C. Mateo, A. Bastida, R. Fernandez-Lafuente, P. Dalmases, J. Huguet and J. M. Guisan, Enzyme and Microbial Technology 2001, 28, 389-396; b) B. Boscolo, F. Trotta and E. Ghibaudi, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2010, 62, 155-161.

[8] C. Mateo, J. M. Palomo, G. Fernandez-Lorente, J. M. Guisan and R. Fernandez-Lafuente, Enzyme and Microbial Technology 2007, 40, 1451-1463.

[9] a) Y. Wang and L. Mei, J. Biosci. Bioeng. 2007, 103, 345-349; b) E. Y. Ozmen, M. Sezgin and M. Yilmaz, J. Mol. Catal. B: Enzym. 2009, 57, 109-114; c) E. Y. Ozmen and M. Yilmaz, Colloids Surf. B: Biointerfaces 2009, 69, 58-62.

[10] a) N. Laurent, R. Haddoub and S. L. Flitsch, Trends in Biotechnology 2008, 26, 328-337; b) M. Malmqvist, Biochem. Soc. Trans. 1999, 27, 335-340.

[11] P. Englebienne, A. van Hoonacker and M. Verhas, Spectroscopy 2003, 17, 255-273.

[12] a) W. D. Wilson, Science 2002, 295, 2103-2105; b) N. Nath and A. Chilkoti, Anal. chem. 2002, 74, 504-509; c) X. Yuan, M. Iijima, M. Oishi and Y. Nagasaki, Langmuir 2008, 24, 6903-6909; d) V. I. Avramis, E. V. Avramis, W. Hunter and M. C. Long, Anticancer Research 2009, 29, 299-302; e) H. J. Chang, S. W. Choi and H. S. Chun, Biotechnology Letters 2008, 30, 1801-1806.

[13] a) S. Arai, K. Nakashima, T. Tanino, C. Ogino, A. Kondo and H. Fukuda, Enzyme and Microbial Technology 2010, 46, 51-55; b) F. van Rantwijk and R. A. Sheldon, Chem. Rev. 2007, 107, 2757-2785; c) F. van Rantwijk, R. M. Lau and R. A. Sheldon, Trends Biotechnol. 2003, 21, 131-138; d) S. H. Ha, M. N. Lan, S. H. Lee, S. M. Hwang and Y. M. Koo, Enzyme Microb. Technol. 2007, 41, 480-483.

[14] J. L. Kaar, A. M. Jesionowski, J. A. Berberich, R. Moulton and A. J. Russell, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 4125-4131.

[15] a) E. Feher, B. Major, K. Belafi-Bako and L. Gubicza, Biochem. Soc. Trans. 2007, 35, 1624-1627; b) U. Kragl, M. Eckstein and N. Kaftzik, Current Opinion in Biotechnology 2002, 13, 565-571; c) U. Kragl, N. Kaftzik, S. H. Schofer, M. Eckstein, P. Wasserscheid and C. Hilgers, Chem. Today 2001, 19, 22-24; d) Z. Guo and X. Xu, Green Chemistry 2006, 8, 54-62; e) R. Irimescu and K. Kato, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2004, 30, 189-194; f) T. Itoh, Y. Nishimura, N. Ouchi and S. J. Hayase, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2003, 26, 41-45.

[16] a) G. Somlyai, G. Jancso, G. Jakli, K. Vass, B. Barna, V. Lakics and T. Gaal, FEBS 12054(317) 1993, 1, 1-4; b) W. Buzgariu, Roum. J. Bio. Sci. 1997, 1, 5-6; c) W. Buzgariu and M. Caloianu, Roum. J. Bio. Sci. 1997, 1, 5-6; d) F. Pricope Stefanescu, G. Titescu, I. Caraus and D. Ureche, Environm. Chem. Lett. 2003, 1, 149-151; e) W. Bild, V. Nastasa and I. Haulica, Romanian journal of physiology : physiological sciences / [Academia de Stiinte Medicale] 2004, 41, 53-67; f) A. Petrus-Vancea and D. Cachitǎ-Cosma, Studia Universitatis Vasile Goldis Arad, Seria Stiintele Vietii 2009, 19, 309-312; g) L. Kótai, J. Lippart, I. Gács, B. Kazinczy and L. Vidra, Industrial and Engineering Chemistry Research 1999, 38, 2425-2427; h) K. Krempels, I. Somlyai and G. Somlyai, Integrative Cancer Therapies 2008, 7, 172-181; i) V. Virág, T. Varjas, Z. Gyöngyi, G. Somlyai, I. Ember and E. Nádasi, Acta Alimentaria 2007, 36, 249-256.

[17] https://www.icsi.ro/index_eng.html.

[18] M. Pallavici, E. Valoti, L. Villa and O. Piccolo, Journal of Organic Chemistry 1994, 59, 1751-1754.