Studiul aspectelor termodinamice ale unor procese de fermentatie

Raport de Cercetare

Grant: Studiul aspectelor termodinamice ale unor procese de fermentatie

Universitatea: ACADEMIA ROMANA INSTITUTUL DE CHIMIE FIZICA I.G. MURGULESCU

Procesul de crestere a microorganismelor pe medii de cultura, cu scopul de a biosintetiza diversi produsi, poarta denumirea de fermentatie.

Procesul de crestere a microorganismelor reprezinta rezultatul interactiunii dintre celula individuala si mediul de cultura. Aplicarea legilor termodinamicii, cineticii si ale transferului de masa, impuls si energie demonstreaza ca mediul de cultura, prin compozitie, temperatura, presiune si concentratii de substrat limitativ, afecteaza direct cresterea microorganismelor si performanta elaborarii produselor utile.

Implicarea economica a microorganismelor, intr-o lume a sintezelor chimice, poate fi apreciata prin aceea ca numerosi compusi utili activitatii umane se obtin mai eficient prin fermentatie decat prin sinteza chimica (de exemplu, acidul 1-glutamic, 1-lizina). Multi dintre compusii naturali au o structura atat de complexa si contin atat de multi centri asimetrici, incat este putin probabil ca ei sa poata fi sintetizati pe cale chimica. De asemenea, o parte dintre compusii care se produceau prin procedee chimice, se obtin astazi prin biosinteza (acetona si butanolul), iar pentru altii, desi sinteza chimica este eficienta, au fost elaborate tehnologii de biosinteza (riboflavina). O serie de compusi sunt rezultatul imbinarii etapelor chimice de sinteza cu cele biochimice, ca in cazul vitaminei C si al hormonilor steroizi.

Microorganismele sunt inzestrate genetic cu un mecanism care regleaza producerea metabolitilor, la un nivel care sa le satisfaca propriile necesitati. Evident, dorinta specialistilor este sa obtina, prin modificari genetice, o tulpina care sa produca in exces un anumit compus necesar omului, compus care sa poata fi separat, purificat si comercializat.

Abordarea analizei, chiar si sumara, a etapelor de dezvoltare a biotehnologiilor nu se poate face fara a remarca faptul ca procesele biotehnologice, in sensul cel mai larg al cuvantului, nu reprezinta o achizitie a zilelor noastre, deoarece lumea microorganismelor a existat dintotdeauna, iar aceasta lume a permis, inca din antichitate, fabricarea branzeturilor prin fermentatia laptelui, fabricarea berii si a vinului prin procese fermentative.

Procesul de baza din tehnologiile de biosinteza este un proces biologic (de fermentatie), transpus la scara industriala, ceea ce a facut ca el sa apartina unui nou domeniu, cel al ingineriei biochimice, domeniu care studiaza procesele de fermentatie aerobe si anaerobe si elaboreaza tehnologiile pentru obtinerea antibioticelor, vitaminelor, hormonilor, alcoolilor, proteinelor, a produselor destinate agriculturii, culturilor de celule etc.

Conceperea, elaborarea si aplicarea biotehnologiilor, domeniu interdisciplinar prin excelenta, se poate realiza numai printr-o colaborare stransa intre microbiologi, geneticieni, biochimisti, ingineri biochimisti, ingineri automatisti si specialisti in conducerea computerizata a proceselor industriale. Rolul fiecaruia este bine determinat, iar implicarea se face intr-o anumita etapa.

Astfel, se poate afirma ca biotehnologiile apartin unui domeniu de granita intre biologie si stiintele ingineresti, si anume ingineria biochimica, care a preluat din biologie legile de izolare prin selectie si mutatie a tulpinilor active, iar din ingineria chimica legile transferului de masa, caldura, impuls, la care si-a adaugat legi si procese proprii, definindu-se, astazi, ca o noua ramura a stiintei care tinde sa domine lumea.

Pentru fermentatia alcoolica se utilizeaza diferite specii de drojdii specifice substratului folosit. Astfel, pentru fermentatia hexozelor se utilizeaza Saccharomyces cerevisiae, iar pentru pentoze sau lactoza Kluyveromyces fragilis si Candida sp. In conditii optime, dupa aproximativ 120 de ore s-a obtinut o concentratie a alcoolului etilic in mediu de 11,5 %. Cu tulpini selectionate de drojdie, dupa luni de fermentatie pot fi atinse concentratii duble.

Agentii tipici ai fermentatiei alcoolice sunt drojdiile genului Saccharomyces care pot sa produca prin fermentarea glucidelor mai mult de 8° alcool etilic.

Drojdiile sunt microorganisme eucariote unicelulare saprofite sau parazite, din clasa ascomicetelor, utilizate in industria fermentativa, in industria de biosinteza, in scopul obtinerii proteinelor furajere. Cele mai multe specii sunt folosite pentru obtinerea alcoolului etilic, berii, vinului, painii, enzimelor si a numeroaselor altor preparate alimentare.

Fermentatia alcoolica este un proces intalnit la numeroase microorganisme, dar care produc prin fermentare cantitati mai reduse de alcool etilic comparativ cu drojdiile. Astfel mai pot produce alcool etilic bacteriile: Bacillus macerans, CI. acetonaetilicus, Zymomonas dar ele nu sunt considerate agenti tipici .

Pentru a putea fi folosite in practica drojdiile genului Saccharomyces sunt studiate si selectionate in functie de unele proprietati care le recomanda pentru utilizarea industriala, cum ar fi: puterea alcooligena; alcoolorezistenta; capacitatea de floculare si pulverulentta; osmotolerantta; frigofilia; caracterul killer.

Fermentatia alcoolica in conditii industriale foloseste substraturi naturale bogate in zahar fermentescibil, iar viteza de fermentare si transformare a glucidelor in produsi primari si secundari este dependenta de numerosi factori care pot fi impartiti in doua mari categorii: factori biologici, dependenti de microagentii fermentarii, si factori fizico-chimici, dependenti de compozitia mediului supus fermentarii si conditiile mediului ambiant.

1. Selectia si caracterizarea tulpinilor de microorganisme utilizate in fermentatia alcoolica

1.1. Caracterizarea drojdiilor din genul Saccharomyces

In vederea utilizarii in practica a drojdiilor genului Saccharomyces acestea au fost caracterizate si selectionate in functie de unele proprietati care le recomanda utilizarii lor pe scara industriala.

Puterea alcooligena. Aceasta proprietate se refera la concentratia mare de alcool care se poate acumula cand in mediu exista un exces de zahar. Drojdiile sunt sensibile la cresterea concentratiei in alcool. Spre deosebire de drojdiile cu putere alcooligena slaba din genul Kloeckera, Torulopsis, care sunt inhibate la o concentratie alcoolica de 4-6^o, drojdiile din genul Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, Saccharomyces cerevisiae - cerevisiae) au o putere alcooligena mare si continua fermentatia pana se acumuleaza 16-18^o alcool.

Alcoolorezistenta. Reprezinta capacitatea drojdiei de a continua fermentatia la o crestere a concentratiei de alcool si de a porni fermentatia in prezenta a 8% alcool.

Sulfitorezistenta. Este definita ca fiind capacitatea drojdiilor de vin, respectiv a drojdiilor din genul Saccharomyces, de a produce fermentatia alcoolica o proprietate importanta a acestora care in prezenta unor concentratii de 200-5000 mg SO₂∙dm^-3 pot influenta negativ activitatea altor drojdii din must neadaptate (peliculare sau oxidative) ca urmare a scaderii potentialului de oxidoreducere.

Putem presupune ca rezistenta la SO₂ se datoreaza si capacitatii drojdiilor din genul Saccharomyces de aexcreta aldehida acetica ce poate lega SO₂ care astfel isi poate reduce efectul levuristatic.

Capacitatea de floculare si pulverulenta. Aceste proprietati se datoreaza structurii peretelui celular si a modificarii de pH si rH din timpul fermentatiei. Drojdiile floculante formeaza asociatii ce se depun mai usor, in timp ce drojdiile pulverulente se mentin mai mult timp in suspensie si produc o fermentatie mai avansata. Astfel, pentru drojdiile de sampanie s-a urmarit ca acestea sa se depuna usor in gatul sticlei, iar prin operatia de degorjare sa se separeu sedimentul, obtinandu-se o sampanie limpede.

Osmotoleranta. Aceasta proprietate se refera la capacitatea drojdiile de a produce fermentatia in mediu cu o concentratie crescuta de zahar. Este recomandata drojdiilor utilizate la obtinerea spirtului de melasa cu un randament superior in alcool etilic.

Frigofilia. Reprezinta adaptarea drojdiilor de a produce fermentatia la temperaturi mai scazute de 10-15^oC. In acest fel sunt evitate fermentatiile secundare, iar in vin sunt acumulate mai multe substante de aroma.

Caracterul killer. Acesta este intalnit la unele drojdii capabile de a sintetiza intracelular o toxina cu efect inhibitor asupra altor drojdii sensibile. De exemplu, in selectionarea drojdiilor de vin, culturile care au caracter k dau randamente superioare deoarece in cursul fermentatiei are loc o autoselectie naturala.

1.2. Caracterizarea produsilor principali si secundari obtinuti in fermentatia alcoolica

Fermentatia alcoolica este un proces anaerob prin care glucidele fermentescibile sunt metabolizate prin reactii de oxido-reducere sub actiunea echipamentului enzimatic al drojdiei in produsii principali (alcool etilic si CO₂) iar ca produsi secundari: alcooli superiori, acizi, aldehide s.a.

Alcoolul etilic este un metabolit primar care poate fi obtinut prin fermentatia zaharului sau a unor polizaharide care sunt transformate enzimatic la zahar.

Conversia prin fermentare in mediu acid a glucidelor, catalizata de enzime le din drojdii se desfasoara in cinci etape principale:

Transformarea diferitelor tipuri de glucide in esteri ai glucozei si formarea esterului fructo-furanozo-1,6-difosfat. Este etapa in care se consuma energie prin reactia de transformare a ATP-ului in ADP.

Formarea triozelor -aldehida fosfoglicerica si fosfodioxiacetona.

Transformarea triozelor pana la formarea de acid piruvic. Energia eliberata prin procesul de oxido-reducere este inmagazinata prin fosforilare de substrat.

Decarboxilarea acidului piruvic si formarea de aldehida acetica.

Aldehida acetica se reduce devenind acceptor de hidrogen si se formeaza alcoolul etilic.

Reactia globala a fermentatiei alcoolice in mediu acid este:

In fermentatia alcoolica rezulta o diversitate de produsi secundari. De exemplu, in vinuri au fost identificate prin cromatografie 300-500 de substante diferite. Majoritatea lor rezulta prin procesul de fermentatie, iar celelalte sunt dependente de compozitia mediului.

In urma analizei culturii de Saccharomyces cerevisiae Hansen au fost identificati prin cromatografie oserie de produsi secundari. Dintre acestia pot fi enumerati urmatorii:

- glicerol: 3g/100g glucoza fermentata;

- aldehida acetica: 2,2 mg∙dm^-3;

- acid acetic: 86∙mg∙dm^-3;

Tulpina de Saccharomyces cerevisiae Hansen provine din colectia de tulpini a Facultatii de Biotehnologie din cadrul USAMV.

Compozitia mediului de cultura a fost:

Extract de drojdie............10g

Peptona...............10g

Glucoza.................10g

Agar.................20g

Apa distilata...............1L

2. Determinarea proprietatilor termodinamice ale proceselor de fermentatie

2.1. Determinarea energiei libere

Variatia energiei libere standard in sistemele biochimice poate fi determinata fie prin utilizarea datelor de echilibru ale reactiilor care au loc sub influenta diverselor sisteme enzimatice, fie din energiile standard de formare ale reactantilor si produselor acelor reactii. Ultima cale este mult mai accesibila, deoarece literatura ofera, in general, date pentru energiile libere standard de formare ale principalilor compusi organici in solutii apoase cu concentratiia 1M la pH = 7 si 25^o C precum si pentru energiile libere standardele unor reactii biochimice iin medii apoase.

In aceste conditii, variatia energiei libere standard la pH = 7 si 25^o C poate fi calculata, cu o precizie destul de mare, din energiile libere standard de formare ale produselor si reactantilor, utilizand relatia:

ΔG^{0 '} = ∑Δ G^{0 '}_{f produsi} - ∑Δ G^{0 '}_{f reactanti}

In acelasi timp, ΔG^{0 '} poate fi calculata si din constantele de echilibru K' ale reactiilor biochimice desfasurate la pH = 7 si 25^o C, utilizand relatia:

ΔG^{0 '} = -2.303 RTlnK'

Calculul eficientei utilizarii energiei rezultate in reactiile oxidative din procesele biochimice.

Energia libera schimbata in reactiile biochimice poate fi utilizata ca indicator al eficientei lucrului chimic sau al randamentului de utilizare a energiei sistemului in reactiile biochimice.

In cazul fermentatiei alcoolice reactia teoretica este:

∆G^o, = -236,17 kJ/mol

In realitate, reactiile biochimice care au loc in celule pot fi descrise prin reactia globala:

∆G^o, = -175,14 kJ/mol

Astfel, tinand cont ca energia libera de formare a ATP-ului este de -30,5 kJ/mol eficienta stocarii in ATP a energiei rezultate la oxidare este:

Pentru un proces de fermentatie aeroba, la arderea totala a glucozei, reactia teoretica este:

∆G^o, = -2867,5 kJ/mol

Relatia reala care se produce in celula microbiana este:

∆G^o, = -1822 kJ/mol

Diferentele dintre valorile eficacitatii utilizarii energiei degajate la oxidarea glucozei pot fi o explicatie a faptului ca performantele proceselor de fermentatie aeroba sunt dependente de eficacitatea aerarii.

In concluzie, o analiza termodinamica pertinenta a reactiilor metabolice impune cunoasterea concentratiilor intracelulare reale ale metabolitilor (produsilor de fermentatie), precum si vitezele lor de formare si utilizare.

2.2. Calculul bilantului energetic al fermentatiei alcoolice

In anaerobioza prin fermentarea unui mol de glucoza celula de drojdie consuma in etapa de formare a esterilor fosforici 2 moli ATP, apoi inmagazineaza energia eliberata in 4 moli de ATP, astfel incat castigul net este de 2 moli ATP/mol glucoza fermentata. Astfel, din punct de vedere energetic fermentatia alcoolica nu este avantajoasa pentru celula de drojdie.

Energia potentiala a glucozei se regaseste in proportie de 92% in alcool etilic, 2-3% energie inmagazinata in ATP, iar restul de energie se regaseste in metabolitii secundari sau se pierde prin caldura.

Bibliografie

J.J. Smith, M.D. Lilly, R.I. Fox - Biotechnol. Bioengn. 1990, 35, 1011.

P.F. Stanbury, A. Whitaker - Principles of Fermentation Technology, Pergamon Press, Oxford, 1986.

P. Todd, S.K. Sikdar, M. Bier (Ed.) - Frontiers in Bioprocessing II, Conference Proceeding Ser., Am. Chem. Soc., Washington, D.C., 1992.

E.J. Vandamme - J. Chem. Tech. Biotechnol. 1992, 53, 313.

J.G. Zeikus, M.K. Jain, P. Elankovan - Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999, 51,545.

D. Wilke - Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999, 52, 135.

H.J. Rehm, G. Reed, A. Puhler, P. Stadler (Ed.) - Biotechnology, vol.3, VCH Weinheim, 1993.

R.S. Rogers - Chem. Eng. News 1999, 77(29), 87.

R. Scriban - Biotechnologie, Technique & Documentation, Lavoisier, Paris,

C. Khosla, R. caren, C.M. Kao, R. McDaniel, S.-W. Wang - Biotechnol. Bioengn. 1996, 52, 122.

J. Lalonde - Chem. Eng. 1997, 9, 108.

Director de proiect

Dr.ing.Pascu Tatiana