BACILI GRAM NEGATIVI AEROBI - FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE

BACILI GRAM NEGATIVI AEROBI - FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE

Familia Enterobacteriaceae cuprinde un numar mare de specii care traiesc in intestinul omului si animalelor. Unele, spre exemplu Escherichia coli fac parte din flora normala a intestinului fiind patogene numai in anumite cazuri. Altele ca Salmonella typhi si Shigella sunt patogene pentru om.

Enterobacteriile se gasesc in mod frecvent si in mediul exterior unde sunt eliminate de oameni si animale odata cu dejectiile.

Clasificare:

Familia cuprinde mai multe genuri ce pot fii grupate in 5 triburi in functie caracterele biochimice.

Tribul I:

Genul ESCHERICHIA -

Genul SHIGELLA

Tribul II

Genul SALMONELLA

Genul ARIZONA

GENUL CITROBACTER

Tribul III

Genul KLEBSIELLA

Genul SERRATIA

Genul ENTEROBACTER

Tribul IV

Genul PROTEUS

Genul PROVIDENCIA

Tribul V

Genul YERSINIA

O alta clasificare se face in functie de patogenitatea enterobacteriilor

1. Enterobacteriile saprofite conditionat patogene:

Genul Escherichia cu specia tip Escherichia coli.

Genul Klebsiella cu 3 specii importante: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella Rhinoscleromates, Klebsiella Ozenae.

Genul Proteus, cu speciile Proteus mirabilis, P. Vulgaris, p. Rettgeri, P.morgani.

Genul Enterobacter.

Genul Citobacter.

Genul Serratia.

Genul Moganella.

Genul Providencia.

2. Enterobacterii patogene:

Genul Salmonella, cu speciile: Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B, C, Salmonella enteritidis, Salmonella Cholerae suis.

Genul Shigella cu 4 specii: S: disenteriae, S. Flexneri, S. Boydii, S. Sonnei.

Genul Yersinia, cu 3 specii: Y. Pestis, Y. Enterocolitica, Y. Pseudotuberculosis.

Morfologie - sunt bacili scurti, 2-3 μm lungime si 0,4 μm in diametru, cu capetele rotunjite, gram negativi, nesporulati. Majoritatea sunt mobili, avand flageli dar exista si specii imobile. Majoritatea sunt neincapsulati.

Caractere de cultura -

Transportul si respectarea enterobacteriilor patogene in produsul patologic ( de tipul materiilor fecale) este asigurata prin insamantarea produsului pe mediu semisolid Carry Blair cu tioglicolat de sodiu ce inhiba microbiocenoza si permite viabilitatea patogenilor trei - patru zile.

Enterobacteriile se dezvolta rapid (18-24h) pe mediile de cultura avand un bogat echipament enzimatic. Sunt aerobi facultativ anaerobi. Pentru inhibarea florei de asociatie se folosesc mediile selective, selectivo-diferentiale de tip ADCL (Leifson), diferentiale (AABTL) sau de imbogatire (obilgatorii in cazul salmonelozelor, facilitind multiplicarea microorganismelor din genul Salmonella si inhiband flora de asociatie; aceste medii pot fii medii cu selenit acid de sodiu, medii cu tetrationat si verde briliant de tipul mediului Muller- Kauffmann si Rappaport).

Se foloseste mediul AABTL pentru evidentierea capacitatii de fermentare a lactozei.

Bacteriile lactozo-poziotive fermenteaza lactoza, realizeaza ph acid al mediului si viraj de culoare a substantei indicatoare de ph (albastru de brom timol) de la albastru la galben. Bacteriile lactozo-pozitive sunt saprofite conditionat patogene. Bacteriile lactozo-negative nu fermenteaza lactoza, nu modifica ph-ul si culoarea mediului nu se schimba. Bacteriile patogene sunt lactozo-negative.

Caractere biochimice

Toti membrii familiei Enterobacteriaceae fermenteaza glucoza (glucozo-pozitivi), sunt oxidazo-negativi (nu posedacitocromoxidaza, reduc nitratii la nitriti, ). Un alt caracter biochimic important este capacitatea de fermentare a lactozei, ce clasifica Enterobacteriile in 2 categorii:

q    Lactozo fermentativi: Escherichia, Klebsiella, Citobacter, Serratia (saprofiti conditionat patogeni).

q    Lactozo nefermentativi: Proteus (saprofit conditionat patogen) si toti patogenii precum Salmonella, Shigella, Yersinia.

Alte proprietati biochimice sunt utilizate pentru identificare speciilor:

fermentarea altor zaharuri cu sau fara producerea de gaz

producerea de hidrogen sulfurat - H₂S

utilizarea citratului ca sursa de carbon

formarea indolului din triptofan

formarea lizinei

formarea acetil - metil - carbinolului ca produs final de fermentatie a glucozei (reactia Voger - Proskauer).

I.        Genul ESCHERICHIA

Este saprofit al tubului digestiv al omului si animalelor, de unde este eliminat cu materiile fecale, raspandit in apa, sol, aer. In intestin este principalul reprezentant al florei normale, inhiband dezvoltarea florei proteolitice si ajutand la sintetizarea unor vitamine din grupul B si vitamina K.

Caractere morfologice

Sunt bacili gram negativi, nesporulati, mobili, cu cili peritrichi in general necapsulati.

Escherichia coli - coloratie Gram

Caractere de cultura

Aerob facultativ anaerob, se dezvolta rapid pe medii de cultura simple (bulion, geloza). Se pot folosi si mediile diferentiale.

Pe mediul geloza sange dau colonii de tip S sau M pentru variante cu microcapsula. Pe mediul AABTL formeaza colonii galben deoarece fermenteza lactoza. Coloniile pot fi de tip S sau M (pentru tulpinile incapsulate).

Escherichia coli cultura pe geloza sange

Caractere biochimice

Fermenteza lactoza, zaharoza si glucoza cu producere de gaz; formeaza indol, nu se dezvolta pe medii cu citrat ca unica sursa de atomi de carbon.

Patogenitate

Escherichia coli este patogen prin multiplicare si toxinogeneza. Este implicat in etiologia infectiilor urinare (produce peste 90% din totalul infectiilor urinare), infectii de plaga, afectiuni genitale, septicemie, peritonita, apandicita, meningita, gastroenterocolita.

Tulpinile ce produc boli diareice sunt:

ECEP (enteropatogen) produce epidemii diareice in spitale, la nou nascuti (diareea epidemica maligna a nou - nascutilor).

ECEI (enteroinvaziv) produce o diaree asemanatoare dizenteriei.

ECET (entrotoxigen) produce o diaree asemanatoare holerei, numita diareea turistilor.

ECEH (enterohemoragic) produce o diaree hemoragica.

Diagnostic de laborator

Se face pentru punerea in evidenta a E.coli, prin cultivarea pe medii de cultura (de tip geloza sange, AABTL, ADCL, Mc Conkey, etc), in functie de tipul produsului patologic. Identificarea se face prin cercetarea caracterelor biochimice si uneori serologice.

II.     Genul KLEBSIELLA

Cuprinde specii saprofite conditionat patogene (K.pneumoniae, K. Rhinoscleromatis si K.Ozenae).

Klebsiella pneumoniae poate fii prezenta in tractul respirator si in intestinul gros la aproximatie 50% din populatie. In consecinta poate fi regasit in sol si in apa.

Caractere morfologice

Sunt bacili gram negativi, imobili (un poseda flageli), nesporulati, incapsulati. Bacilii sunt asezati in lanturi scurte pe frotiurile din cultura si lanturi lungi pe frotiurile din produse patologice.

Klebsiella - aspect de microscopie electronica

Klebsiella - coloratie Gram

Caractere de cultura

Cresc usor in mediile de cultura (geloza, geloza sange). Pe AABTL, datorita fermentarii lactozei produc colonii cu aspect de picatura de miere (galbene, lucioase). Coloniile sunt de tip M (mucoase) datorita prezentei capsulei si au o consistenta particulara ( se intind la atingere cu ansa).

Klebsiella - colonii de tip M pe geloza sange

Caractere biochimice

Sunt bacili lactozo pozitivi, folosesc citratul ca unica sursa de atomi de carbon, nu poseda H₂S, produc lizina si carboxilaza iar reactia ureazei este pozitiva. Nu produc indol si H₂S.

Patogenitate

Klebsiella pneumoniae produce infectii urinare, infectii digestive (colite, enterocolite, pneumonii, septicemie, meningita, peritonita.

Penumonia cu klebsiella poate progresa catre necroza si formare de abcese. Poate produce infectii intraspitalicesti, greu de vindecat.

Klebsiella ozenae este asociata cu ozena, o atropie progresiva, fetida a mucoasei nazale.

Klebsiella rhinoscleromatis produce rinoscleromul, un un granulom distructiv al nasului si faringelui.

Diagnostic de laborator

Prin cultivarea produselor de laborator pe medii de tip AABTL, ADCL (Leiffson), Mac Conkey, geloza sange se dezvolta coloniile caracteristice de tip M ce urmeaza a fi supuse identificarii biochimice. Pe mediile diferentiale (AABTL; ADCL) coloniile sunt lactozo-pozitive modificand culoarea mediului.

III.     Genul PROTEUS

Genul Proteus grupeaza enterobacterii cu un polimorfism accentuat, foarte mobile.

In mod normal se gaseste in numar mic in intestinul omului si animalelor. Populatia intestinala de Bacil Proteus poate insa deveni predominanta prin procese de selectie in urma unui tratament cu antibiotice la care aceasta bacterie este rezistenta. Este foarte raspandit pe sol, gunoaie, ape poluate unde se gasesc materii organice in descompunere. Este agent obisnuit al proceselor de putrefactie a carnii.

Caractere morfologice

Bacili polimorfi cu forme scurte, 1-3 μ si forme lungi filamentoase pana la 30 μm. Sunt foarte mobili datorita cililor peritrihi, nesporulati, necapsulati.

Caractere de cultura

Bacterii aerobe, facultativ anaerobe, se dezvolta usor pe medii simple. Pe geloza dau fenomenul de invazie, astfel incat in cateva ore o tulpina insamantata intr-o extremitate acopera toata suprafata gelozei.

Proteus - fenomenul de invazie pe geloza sange

Pentru a impiedica fenomenul si a putea obtine colonii izolate, se folosesc medii care contin substante cu actiune inhibitorie selectiva.

Daca pe aceeasi placa cu geloza se insamanteaza in 2 puncte opuse doua tulpini diferite acestea se vor dezvolta pana la un punct in apropierea liniei de intalnire a tulpinilor, unde invazia va stagna lasand o linie de demarcatie care are apicatie in cercetarile epidemiologice.

Proteus - fenomenul liniei de demarcatie

Daca insamantarea materiilor fecale se face la baza gelozei inclinate, in partea superioara a culturii se obtine cultura pura de bacili Proteus. Acesta se explica prin mobilitatea mai mare a bacilului proteus fata de alte bacterii din flora asociata (fenomenul de catarare). Acesta constituie un mijloc de izolare si identificare.

Pe mediile cu lactoza (AABTL, ADCL,) fenomenul de invazie este inhibat; coloniile de Proteus sunt lactozo-negative.

Caractere biochimice

In functie de caracterele biochimice, acest gen se imparte in 4 specii: P.vulgaris, P. mirabilis, P.morgani,si P. rettgeri.

Au o marcata actiune proteolitica, produc in majoritate H₂S, nu fermenteaza lactoza reactia indol este pozitiva, cresc pe medii de citrat ca unica sursa de carbon, produc fenilalanildezaminaza, nu produc lizin de carboxilaza.

Patogenitate

Saprofit al intestinului omului sanatos, poate deveni patogen cand paraseste habitatul sau natural. Produce frecvent infectii urinare, infectii genitale, infectii ale plagilor, septicemie, pneumonie, otite, sinuzite, peritonite, meningite.

A fost incriminat si ca agent cauzator al toxiinfectiilor alimentare si enterocolitelor acute mai ales infantile. (P.morgani, P.mirabilis si mai rar P.vulgaris).

Datorita rezistentei marcate fata de majoritatea antibioticelor adresate altor agenti infectiosi si in acelasi timp sa fie greu tratabile datorita rezistentei la antibiotice. Proteus morganii si Proteus rettgeri apar implicati in infectii intraspitalicesti cu o frecventa apropiata de genul Klebsiella.

Diagnostic de laborator

Consta in izolarea germenului in cultura pura (geloza sange, AABTL, ADCL, in functie de produsul patologic) si identificarea lui pe baza caracterelor morfologice, culturale si biochimice. Alegerea mediilor de cultura pentru insamantarea produselor patologice se face in functie de tipul acestora. Urina, sangele, puroiul si alte exudate purulente se insamanteaza pe mediul cu geloza sange si AABTL iar materiile fecale pentru coprocultura se insamanteaza pe medii selectivo-diferentiale de tip Mac -Conkey si ADCL.

Pe geloza sange apare fenomenul de invazie iar pe mediile diferentiale si selectivo-diferentiale apar colonii lactozo-negative. In functie de echipamentul enzimatic se pune diagnosticul de specie prin identificare biochimica.

Genul SALMONELLA

Genul Salmonella este alcatuit dintr-un mare numar de specii (peste 1500) patogene pentru om si animale. Se gasesc in intestinul omului, animalelor, pasarilor (ca patogen) de unde pot contamina mediul (solul, apa). Rezista 2-6 luni in apele poluate. Infectiile sunt clasificate in salmoneloze minore si salmoneloze majore in functie de etiopatogenie, evolutie si gravitatea complicatiilor.

Caractere morfologice

Sunt bacili gram negativi, mobili, cu cili peritrichi, nesporulati, necapsulati. Unele specii prezinta o pseudocapsula, antigenul Vi (S. Typhi, S. Paratyphi A, B, C si S.typhi murium).

Salmonella - evidentierea flagelilor

Salmonella -coloratie pentru flageli

Salmonella - microscopie electronica

Salmonella - coloratie Gram (bacili gram negativi)

Caractere de cultura

Bacterii aerobe, facultativ anaerobe, se cultiva pe medii de imbogatire selective si diferentiale (AABTL, ADCL, Mac Conkey).

Coloniile sunt de tip S, lactozo - negativ pe mediile diferentiale; pe mediul ADCL apar colonii lactozo-negative cu centrul negru (la 48h), datorita producerii de H₂S, ce trebuie diferentiate de coloniile de Proteus. Pe mediul Mac Conkey apar colonii lactozo-negative ( la 18h), de talie mica, mijlocie, cu margini semitransparente.

Pe mediul inalt selectiv Wilson Blair apar colonii (la 48h), mici negre, aderente de mediu, cu luciu si halou metalic, datorita reducerii sarii de bismut la bismut metalic; uneori coloniile apar mici si verzi.

Salmonella - cultura pe ADCL

Caractere biochimice

Spectrul biochimic caracteristic de gen pentru majoritatea salmonellelor este: degradarea glucozei cu producere de gaz, absenta fermentarii lactozei, elaborarea de H₂S, absenta indolului si a fenilamindezaminazei, prezenta lizindecarboxilazei. Comportamentul biochimic al S.typhi, S. paratyphi A, S.choleraesuis la 18h 4 este diferit, in sensul ca degradeaza glucoza fara producere de gaz si nu degaja H₂S.

Structura antigenica

a)               - Antigenul O, de natura glucido - lipido - polipeptida, pe baza caruia genul e impartit in 65 de grupuri serologice numerotate de la 1 la 65.

b)              - Antigenul H flagelar, pe baza caruia grupurile serologice sunt impartite in tipuri serologice. Antigenul H se prezinta in 2 faze: faza I specifica cu 90 de fractiuni notate cu litere (a, b, c,z, z₁, z₂, z₃..) si compusa din 87 factori notati cu cifrele 1-7. cand antigenul este in faza nespecifica nu poate fi determinata specia. Cele mai multe specii sunt insa afazice (posedand atat faza specigica cat si faza nespecifica) astefel incat tulpina poate fii identificata serologic.

c)               Antigenul Vi este situat pe suprafata corpului microbian, fiind un antigen de invelis, de natura polizaharidica. Antigenul Vi confera caracterul de invazivitate.

Identificarea serologica

Tulpinile care prezinta un comportament biochimic de gen salmonella pe mediile diferentiale vor fii obligatoriu identificate serologic cu trusa de saruri imune de diagnostic antisalmonella ce cuprinde: ser anti Vi, ser polivalent "O" antisalmonella (AO, BO, CO, DO, EO;etc) seruri monevalente flagelare anti "H" de faza specifica ( a,b,c,d, gm, i,r), seruri monovalente flagelare anti"H" de faza nespecifica (1,2,5).

Reactiile de aglutinare pe lama pot fii executate de pe mediul TSI sau de pe AABTL, nu de pe medii selectivo-diferentiale.

Identificarea serologica a salomonellelor la nivel de laborator de bacteriologie chimica, vizeaza identificarea de gen, de serogrup si de serotip.

Patogenitate

Bolile produse poarta numele de salmoneloze. Salmonella typhi produce febra tifoida, iar Salmonella paratyphi A, B, si C produc febrele paratifoide. Acestea sunt boli generalizate. Alte salmonelle (S. Typhi murium, S. Enteritidis, s. Cholerae suis), produc toxiinfectii alimentare de tip infectios (prin ingestia masiva de germeni) enterocolite (prin ingestia unui numar mai redus de bacterii) sau infectii extradigestive urinare, articulare, meningeale, respiratorii.

Diagnostic de laborator

Diagnosticul de laborator este un diagnostic bacteriologic si unul serologic (imunologic).

a)     Diagnostic bacteriologic

Evidentierea agentului patogen in produsele patologice, care sunt prelevate in functie de stadiul bolii. Se indica hemocultura in faza de debut, coprocultura in faza de stare si coprocultura , bilicultura, urocultura in faza de convalescenta.

Hemocultura se practica in toate cele patru septenare de febra tifoida, proportia de rezultate pozitive este de aproximativ 80% in prima saptamana de boala.

Medulocultura se recomanda in special in febra tifoida cu hemoculturi negative. Recoltarea maduvei osoase din stern se executa prin punctie osoasa.

Urocultura se executa in perioada de convalescenta si la fostii bolnavi de febra tifoida pentru depistarea starii de purtator cronic.

Bilicultura se efectueaza in cazul in care coproculturile si uroculturile sunt in mod repetat negative dar exista suspiciune clinica si epidemiologica. Bila se insamanteaza pentru depistarea starii de excretor intermitent de S.typhi (datorita cantonaraa bacilului tific in colecist si eliminare intermitenta prin materiile fecale).

Coprocultura este investigatia cea mai solicitata pentru diagnosticul de samoneloza intestinala. Exista o proportie ridicata a coproculturilor pozitive (80%) in septenarele III si IV. Daca examinarea si prelucrarea nu se asigura in maxim 6h din momentul prelevarii se utilizeaza mediul de conservare si transport Cary Blair ce asigura supravietuirea salmonelelor tip de 4-6 zile.

In laborator este obligatorie etapa de imbogatire a materiilor fecale, insamantand produsul pe doua medii de imbogatire: mediul selenit acid de sodiu si mediul Muller Kauffmann ( cu tetrationat).

Pentru economie de timp se insamanteaza materiile fecale pe suprafata mediilor selective Wilson Blair, ADCL, Mac Conkey. Culturile de 18-24h de pe mediile de imbogatire vor fii dispersate pe medii selective diferentiale asociind un mediu de imbogatire puternic inhibant cu unul selectiv moderat, iar culturile de pe mediul slab inhibant cu unul major selectiv (culturile de 18h de pe mediul Muller Kauffmann vor fii trecute pe Wilson Blair).

b)     Diagnosticul serologic (reactia Widal) - este o metoda indirecta de diagnostic care evidentiaza prezenta anticorpilor de tip anti O si anti H. Anticorpi anti Vi apar doar in ultima saptamana de boala.

GENUL SHIGELLA

Genul Shigella cuprinde patru specii: Shigella Dysenteriae (grp.A), Shigella Flexneri (grp.B), Shigella Boydii (grp.C), Shigella Sonnei (grp.D).

Clasificarea se face pe baza structurii antigenului o ( structura polizaharidica) din peretele celular. Reprezinta factorii etiologici ai dizenteriei bacilare.

Caractere morfologice

Sunt bacili gram negativi, imobili, nesporulati, necapsulati, absenta mobilitati se pune in evidenta prin insamantare pe mediul MIU.

Shigella microscopie electronica (Dennis Kunkel)

Caractere de cultura

Dezvoltarea se face pe medii de imbogatire, selective si diferentiale ce contin saruri biliare pentru inactivarea florei saprofite. Pe mediile diferentiale (ADCL, AABTL) se dezvolta colonii rotude, translucide care nu modifica culoarea mediului datorita lipsei de fermentare a lactozei (colonii lactozo - negative).

Caractere biochimice

Bacilii dizenterici fermenteza glucoza fara producere de gaz, nu fermenteaza lactoza si zaharoza, nu produc H₂S, nu produc ureeaza, nu cresc pe mediul cu citrat de sodiu ca unica sursa de atomi de atomi iar productia de indol este variabila. Evidentierea caracterelor enzimatice se face prin insamantarea tulpinilor pe medii speciale (TSI; MIU; Simmons), sau in sistem API.

Structura antigenica

Genul Shigella are 4 grupuri serologice: A, B, C, D.

Grupul A (Shigella dysenteriae) cuprinde 10 tipuri. Grupul A este cel mai patogen. Tipul shigella Shiga este cel mai patogen dintre toate tipurile, elaborand o exotoxina neurotropa.

Grupul B (Shigella flexneri) cuprinde 6 tipuri.

Grupul C (Shigella boydii) cuprinde 15 tipuri serologice.

Grupul D (Shigella sonnei) cuprinde 2 faze: faza I (S) si faza II (R).

Patogenitate

Genul Shigella cuprinde cei mai puternici patogeni in grupul Enterobacteriilor. Speciile genului Shigella produc la om dizenteria bacilara si toxiinfectii alimentare.Ingerarea a numai 100 de bacili produce boala, in timp ce pentru vibrionul holeric sau Salmonella doza infectanta este de numai 10.000 bacili.

Dizenteria este o boala specific umana si se transmite pe cale fecal orala de obicei la purtatori sanatosi. Exista si epidemii hidrice sau alimentare.

Bacteriile ajunse la nivelul intestinului se multiplica si produc inflamarea mucoasei ce poate progresa spre submucoasa cu formarea ulcerelor la acest nivel ("in buton de camasa").

Aceste ulceratii apar la nivelul peretelui intestinal in special la nivelul ileonului si sigmoidului.

Dupa vindecare unii pacienti pot ramane purtatori sanatosi de bacili dizenterici, aflandu-se la originea unor viitoare infectii.

Diagnostic de laborator

Diagnosticul de laborator este bacteriologic si consta in izolarea si identificarea germenilor in produsele patologice. Produsele patologice de examinat sunt constituite din materiile fecale. In cazul toxiinfectiilor alimentare se recolteaza materii fecale de la bolnavi, contacti, personal care manuieste alimentele precum si probe din alimentele incriminate.

Materiile fecale se recolteaza cat mai aproape de debutul bolii, inaintea administrarii tratamentului antibiotic. In dizenteria cronica se poate recolta produsul direct de la nivelul leziunii sub control rectoscopic. Insamantarea in vederea izolarii shigelelor trebuie efectuata imediat sau probele sunt transportate in mediul Carry Blair. Coprocultura se efectueaza pe medii selectivo - diferentiale, de tip Mac Conkey, ADCL sau Salmonella - Shigella. Coloniile sunt transparente, incolore (lactozo - negative); iar confirmarea se face prin identificare biochimica.

Identificarea serologica se face prin stabilirea structurii antigenice de bacil dizenteric si incadrarea acesteia intr-una din cele 4 grupe antigenice ( subgrupa A;B;C; D).

Identificarea serologica se realizeaza prin reactii de aglutinare pe lama, folosind trusa de seruri imune standard antidizenterice, polivalente si monovalete.

Antibiograma este obligatorie dupa izolarea si identificarea shigelelor, datorita prezentei multirezistentei la antibiotice.