Particularitati ale raspunsului imun in bacterioze

PARTICULARITATI ALE RASPUNSULUI IMUN IN BACTERIOZE

Agresarea macroorganismului de catre agentii infectiosi determina o reactie de raspuns din partea sistemului imun. Modalitatile de interactiune intre macro- si microorganisme depind de o multitudine de elemente printre care, nu in ultimul rand, trebuie amintite particularitatile structurale (de specie) ale microbului. Dependent de evolutia conflictului initiat si de prevalenta efectorilor imuni implicati, bolile bacteriene pot fi clasificate in cateva categorii.

1. Bacterioze extracelulare

1.1. Infectii in care raspunsul imun este dominat

de opsonine si sistemul polimorfonuclear

Numeroase bacterii, in scopul supravietuirii si-au dezvoltat mecanisme de protectie prin care evita fagocitoza. Datorita acestui fapt, cu toate ca prezenta lor in organism atrage numeroase polimorfonucleare, deci sunt bacterii piogene, sunt cunoscute si sub denumirea de patogeni extracelulari (Drutz D.J. -1983). Pentru a face posibila fagocitarea germenilor din aceasta categorie (Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Bacterioides fragilis, Pseudomonas aeruginosa tulpinile care induc fibroza chistica) este nevoie de interventia opsoninelor.

Streptococcus pneumoniae este o bacterie Gram pozitiva care se intalneste in mod obisnuit la 40-70% dintre adulti. Atunci cand in sistemul de aparare apare o fisura (iritatie, infectie virala, edem pulmonar) S.pneumoniae poate determina pneumonie pneumococica iar uneori meningita.

Germenul poseda 83 antigene capsulare diferite cu functie antifagocitara. Cantitatea materialului capsular este direct proportionala cu patogenitatea. Astfel pneumococii de tip 1, 2, 3, 5, 7, 8 sunt considerati extrem de virulenti. Dintre acestia tipul 3, cu capsula avand dimensiunile cele mai mari este dificil de fagocitat si produce abcese pulmonare, extrem de rare cu alte tipuri. Polizaharidul pneumococic se poate disocia de peretele bacterian si ajunge in circulatie si tesuturi, prognosticul fiind conditionat de concentratia acestuia (Drutz D.J. -1983). Substanta C, probabil analog al substantei C specifice grupului S.pyogenes, are capacitatea de a precipita betaglobulina (proteina C-reactiva-CRP) din serul pacientilor cu diferite boli inflamatorii. CRP se leaga de bacterii si stimuleaza fagocitoza in cazul S.pneumoniae, S.aureus si E.coli.

Genul streptococcus este un grup heterogen care cuprinde microorganisme patogene la specii diferite. Dependent de componenta peretelui lor acestia pot fi clasificati in grupe imunologic specifice (A-O). compusul parietal esential este N-acetilglucozamina (Drutz D.J. -1983).

Streptococii de grup A frecvent intalniti la om, poseda diferite tipuri de proteina M, imunitatea fata de acestia fiind specifica tipului. Proteina M si acidul hialuronic reprezinta elementele majore ale apararii antifagocitare.

Stafilococul auriu este probabil germenul care sintetizeaza cei mai numerosi factori de virulenta (agresiune). Dintre cele mai bine cunoscute fac parte: alfa toxina, coagulaza, lipaza, leucocidina, enterotoxina, exfoliatina si proteina A (Drutz D.J. -1983). Peretele celular al acestor bacterii este format din acid teicoic, peptidoglican si proteina A. Peptidoglicanul reprezinta elementul cheie implicat in opsonizarea stafilococilor, nu numi legand IgG dar si activand complementul pe cale clasica sau alternatica (Drutz D.J. -1983). Proteina stafilococica are capacitatea de a se cupla cu portiunea Fe a IgG ducand la formarea de complexe pseudoimune, dar si de receptorii Fe ai granulocitelor neutrofile interferand opsonizarea si fagocitoza.

Haemophilul influenzae este o bacterie Gram negativa de dimensiuni mici care poate provoca (tipul b) infectii invazive (meningita, celulita, epigletita, artrita). Polizaharidele capsulare ale acestui germen sunt considerate a manifesta o actiune antifagocitara. Problema importantei opsonizarii si fagocitozei  in bacterioliza mediata de anticorpi si complement a fost mult discutata. Numeroase date subliniaza semnificatia anticorpilor opsonizanti, dirijati indeosebi fata de poliribofosfat, ca reprezentand sistemul protector principal (Drutz D.J. -1983).

Gonococul (Neisseris gonorrhoeae), este un diplococ Gram negativ, care poseda pili si o proteina a membranei externe (factor asociat leucocitelor) cu rol antifagocitar. Recent, la unele specii s-a pus in evidenta si o capsula. Cu toate acestea ei se gasesc fagocitati in celule polimorfonucleare ale tractusului uretral probabil datorita aglomerarii germenilor si leucocitelor in aceleasi zone, ocolind astfel prezenta opsoninelor (fagocitoza de suprafata, vezi Cap.I). bacteriile fagocitate, fie si in aceste conditii, sunt distruse intr-un timp scurt, dar proportia nu este cunoscuta.

In cazul bacteriilor Gram negative enterice si din mediu (familiile Enterobacteriaceae si Pseudomonadaceae), mecanismul de protectie prin antisomatici pare a implica atat efectul opsonizant cat si pe cel antiendotoxinic. Serurile antisomatice pot exercita un efect protector, usurand fagocitoza germenilor circulanti in absenta PMN de catre fagocitele mononucleare din ficat sau alte tesuturi reticuloendoteliale (Drutz D.J. -1983, Bilbiie V. -1985).

Desi importanta in patogeneza antraxului, evitarea fagocitozei este mai putin grava decat producerea de toxina. Anticorpii anticapsulari trebuie sa actioneze conjugat cu anticorpii antitoxina pentru ca rezultatele sa fie cele dorite.

1. Infectii in care raspunsul imun este

mediat majoritar de anticorpi

Peretele bacterian este factorul care initiaza activarea mecanismelor protectoare din partea organismului. La nivelul acestuia pot fi prezente numeroase structuri (vezi 1.1.) care inhiba aderenta la fagocite sau au proprietati antifagocitare. In aceste conditii intervin anticorpii care legandu-se de suprafata microbului duc la opsonizarea acestuia si ingerarea de catre polimorfonucleare si macrofage (Reitt I.M. -1978). Se realizeaza astfel rapid epurarea sangelui de bacteriile circulante (Fig.4). anticorpii opsonizanti actioneaza sinergic cu complementul, procesul implicand receptorii de mare afinitate pentru IgG si C3b de pe suprafata fagocitelor. Capacitatea IgG de a fixa complementul este un alt element favorabil depurarii bacteriene.

Aditional mecanismelor descrise mai sus, bacteriile pot fi captate si de anticorpi citofili, deja fixati pe celule cu receptori Fe. Complexele ce contin C 3 pot adera la eritrocitul uman sau de iepure formand astfel complexe care urmeaza  a fi fagocitate. In cazul bacteriilor Gram-negative, anticorpii initiaza activarea complementului iar complexul de atac determina leziuni ale peretelui bacterian prin care este favorizata patrunderea lizozimului in interiorul celulei fiind mediata astfel distrugerea celulei (Reitt I.M. -1978).

Inflamatiile acute produse de bacterii declanseaza initial sinteza de imunoglobulina M, iar ulterior limfocitele sunt comutate pe secretia de IgG.

IgG se caracterizeaza prin capacitatea opsonizanta sporita, usurarea fagocitozei in prim faza a infectiei si posibilitatea de a aglutina bacteriile. Este foarte eficienta in infectiile cu bacterii Gram-negative (Moraru I. -1984).

Anticorpii de tip IgG difuzeaza mult in afara patului vascular si actioneaza la distanta, neutralizand toxinele bacteriene si jucand un rol deosebit in prevenirea reinfectiei (Drutz D.J. -1983, Moraru I. -1984).

Uneori procesul infectios nu se poate dezvolta in absenta aderentei la mucoase sau a colonizarii acestora. Agentii patogeni, elaboreaza dependent de gen, mijloace pentru realizarea acestui scop (fimbrii, adezine etc.).

Protectia la nivelul suprafetelor mucoaselor se realizeaza prin interventia anticorpilor din clasa IgA, care nu prezinta o afinitate deosebita pentru celule si nu se cupleaza cu receptori celulari specifici (Reitt I.M. -1978).

Depasirea barierei IgA reprezinta semnalul pentru intrarea in "scena"  IgE care desi exista in MALT in concentratie redusa, este bine fixata pe mastocite, realizand in contact cu antigenul, eliberarea mediatorilor vasoactivi din acesta (Fig.5). in consecinta are loc transudarea IgG si a complementului si aparitia celulelor polimorfonucleare. Distrugerea celulei tinta poate decurge prin fagocitoza sau prin ADCC.

Exemple particulare ale interventiei anticorpilor circulanti in protectia antibacteriana se inregistreaza in cazul transferului pasiv al IgG, dar nu si IgM sau IgA, care impiedica fixarea pe dinti a lui Streptococcus mutans si stopeaza astfel evolutia cariei dentare (Reitt I.M. -1978).

Anticorpii indusi de polizaharidele meningococice de grup A si C, previn instalarea meningitei cauzate de germenii omologi, datorita capacitatii lor opsonizante.

Importanta anticorpilor protectori fata de infectiile cu germeni piogeni este ilustrata de frecventa marita a acestora la copiii hipogammaglobulinemici, chiar daca testele de imunitate mediata celular sunt la nivelul corespunzator. Teoria imunoglobulinica are o eficienta deosebita in asemenea cazuri (Allison A.C. -1974).

3. Infectii complicate prin depunerea de

complexe imune circulante

Trasaturile imunologice esentiale ale acestor infectii se traduc prin persistenta sau caracterul lor cronic, aparitia complicatiilor renale, articulare sau ale pielii. In serul pacientilor cu astfel de infectii apar concentratii crescute de gammaglobuline, anaglobuline si scade nivelul complementului. Formarea complexelor imune si depunerea lor in tesuturi antreneaza aparitia vasculitei (Drutz D.J. -1983).

Probabil ca in majoritatea bolilor infectioase se formeaza complexe antigen - anticorp dar prezenta acestora nu devine clinic manifesta, deoarece sistemul reticuloendotelial reuseste sa realizeze eliminarea lor din circulatie. In cazul anumitor antigene, complexele imune sunt de asa natura incat se depun la nivelul peretelui vascular, activeaza ulterior complementul si prin eliberarea de C 3a, C 5 a si a complexului de atac determina aparitia unei leziuni de tip inflamator. Simptomatologia este diversificata de situsul de depunere al complexelor imune.

Endocardita infectioasa (produsa de Streptococcus viridans, Staphylococcus aureus, enterococi, fungi - Candida albicans, Coxiella burnetii sau alti agenti) este influentata in evolutia ei de factori predispozanti cum sunt eliberarea continua de germeni in torentul circulator, protejarea acestora la nivelul valvulelor cardiace de structura lor avasculara, concentratii sporite de factor reumatoid, care afecteaza capacitatea opsonizanta a IgG.

Complicatiile imunologice care apar se exteriorizeaza clinic prin glomerulonefrita, cu prezenta antigenului, anticorpilor si complementului in vasele renale. Inflamatia vaselor sanguine se manifesta prin zone hemoragice in fundul de ochi, subungual, aparitia emboliilor indeosebi in SNC. Splenomegalia si prezenta histiocitelor circulante reflecta stimularea cronica SRE. In sange unt prezente crioglobulinele, cresc globulinele si factorul reumatoid (Drutz D.J. -1983).

Glomerulonefrita acuta poststreptococica poate reprezenta urmarea infectiilor faringiene sau cutanate produse de Streptococcus pyogenes tipurile 1, 4, 12, 18 faringiene sau 2, 31, 49, 52, 55 cutanate. Histopatologic este o glomerulonefrita prin complexe imune tradusa clinic prin proteinurie, hemeturie, hipertensiune iar paraclinic prin hipocomplementemie in primele saptamani de boala (Drutz D.J. -1983).

Bacteriemia prelungita in cazul infectiei persistente cu Salmonella typhi determina depunerea in peretele capilarelor a antigenului "Vi", anticorpilor si complementului. Referintele legate de aceste complicatii in cazul febrei tifoide sunt putine pentru ca biopsia renala este arareori justificata (Drutz D.J. -1983).

La pacientii cu fibroza chistica pulmonara complicata prin infectii cu Pseudomons aeruginosa (altfel slab patogen) se constata o reactivitate persistenta care duce in final la reactia de hipersensibilizare de tip III medita de complexe antigen - anticorp. Pe parcursul evolutiei clinice se constata prin examene de laborator prezenta asociata a complexelor imune in tesutul pulmonar, sporita si circulatie (complexe imune circulante - CIC) (Dasgupta M.K. -1987, McFerlane H. -1975, Schiøtz P.O. -1978 ). Distributia complexelor imune in cei doi pulmoni si in circulatie este dependenta de rata de formare si clasa anticorpilor, raportul dintre antigen si anticorp si influenta mecanismelor de clearance imunologic (Borst -1986, Dasgupta M.K. -1987).

Infectiile produse de Streptococcus pneumoniae reprezinta o cauza frecventa a mortalitatii umane la categoriile de risc: varsta peste 60 ani, pneumonii multilobare, leucopenie (numar de leucocite sub 5000/mm³), boli cronice intercurente, meningite sau alte infectii supurative care secondeaza pneumonia (Mellencamp -1742). In serul pacientilor cu infectii pneumococice severe s-au pus in evidenta CIC, dar componentele acestor complexe nu au fost studiate intr-o masura care sa elucideze semnificatia lor patogenetica. Probabil modul de interventie al acestor complexe consta in activarea complementului si neutrofilelor. Ineficienta protectiei prin anticorpi in pneumonia pneumococica ar fi datorat fie complexarii anticorpilor circulanti si blocarii lor in CIC fie paraliziei imunologice prin exces de antigen (Mellencamp -1742).

Erithema nodosum reprezinta o complicatie frecventa in boli ca: lepra, coccidioidomicoza, histoplasmoza, tuberculoza, infectiile streptococice.

Infectiile virale a caror evolutie chimica poate fi agravata de prezenta CIC au fost tratate in Cap.III.

Bacterioze intracelulare

Evitand opsoninele si celulele polimorfonucleare (Krasilnikov A.P. -1979), unele bacterii reusesc sa penetreze in interiorul organismelor, fiind cantonate la nivelul macrofagelor. Interactiunea limfocit - macrofag cu rol in reglarea raspunsului imun poate avea in aceste situatii si efecte defavorabile datorita medierii distructiei celulare proprii ("bystander cell injury"). De asemenea, replica organismului este caracterizata prin aparitia unor celule cu structura particulara - celule granulomatoase si gigante.

Desi in bacteriozele intracelulare - bacteriile implicate fiind facultativ sau obligatoriu parazite - sinteza de anticorpi este uneori apreciabila, datorita cross - reactivitatii lor extinse; nu intotdeauna dozarea acestora are importanta deosebita. Asa se intampla in cazul infectiilor produse de diferite tipuri de micobacterii. In schimb in histoplasmoza, coccidieidomicoza, bruceloza, tularemie, testele serologice prezinta o valoare ridicata de diagnostic (Drutz D.J. -1983).

Mycobacterium tuberculois este o bacterie facultativ intracelulara, aeroba, colorabila prin metode speciale (Ziehl - Neelsen). Nu este toxigen iar capacitatea sa de a supravietui in organism a fost pusa pe seama persistentei si proliferarii in macrofage ca si a inhibitiei fuziunii lizozomale cu fagozomul. Factorii care conditioneaza aceasta "eschivare " de liza sunt : acidul 6-6 dimicolic cuplat cu trehaloza, lipidele prezente in concentratii mari (60%) care asigura rezistenta fata de acizi si baze, ceara D si tuberculinoproteilnele.

Raspunsul imun al gazdei este conditionat genetic. La om s-a constatat ca persoanele care poseda antigen MLA-Bw 15 sunt in mod deosebit susceptibile. Reactivitatea limfocitelor T sensibilizate induce, prin activarea macrofagelor un raspuns antibacterian care stopeaza multiplicarea agresorului dar concomitent, prin factorii produsi (limfotoxina, MIF) si enzimele eliberate din macrofagele distruse, determina leziuni severe ale tesuturilor alaturate sanatoase (hipersensibilizare). In fazele timpuri ale bolii la animalele de experienta, efectele enumerate par a fi inhibate probabil datorita prezentei arabinogalactanului din serul pacientilor bolnavi. Distrugerea nespecifica ("killing") a microorganismelor patogene intracelulare s-a dovedit a fi mai putin importanta decat imunitatea mediata specific prin limfocite (Drutz D.J. -1983).

Diagnosticul bolii se realizeaza prin testul cutanat tuberculinic, rezultatul pozitiv indicand prezenta unei subpopulatii de limfocite T sensibilizate. Testul Mantoux se utilizeaza in ultimul timp pentru aprecierea eficacitatii starii de sensibilizare. Baza morfologica a acestei reactii este reprezentata de infiltratia limfocitara, polimorfonucleara si macrofagica de intensitatea careia depinde exprimarea reactiei. Calculul indicelui monocit - complement si comparatia acestuia cu rezultatul testului Mantoux demonstreaza o semnificatie redusa la bolnavii cu tuberculoza localizata si crescuta in formele diseminate, cei doi parametrii fiind in corelatie inversa (Titov L.P. -1979).

Lipsa de reactivitate fata de tuberculina inoculata poate fi asociata cu depresia imunitatii celulare (limfoblastogeneza) si frecvent cu cresterea numarului TS (Drutz D.J. -1983). Testul de transformare blastica se coreleaza perfect cu testul cutanat, neaducand nici o imbunatatire fata de aceasta din urma mult mai simplu.

Vaccinarea cu BCG utilizata in preventia bolii nu induce la cobai un paralelism intre sensibilitatea tuberculinica si intensitatea imunitatii fata de tuberculoza, dupa 1, 2 sau 3 inoculari. Revaccinarea dupa 5 luni a animalelor care si-au pastrat reactivitatea tuberculinica indusa de inocularile anterioare, duce la desensibilizare si reducerea nivelului imunitatii (Allison A.C. -1974). Aplicarea vaccinului poate interfera diagnosticul.

Standardizarea metodelor moderne de investigatie imunologica a permis elucidarea multiplelor aspecte legate de particularitatile raspunsului imun in tuberculoza la om ca si la animale.

Cercetari efectuate pe bovine adulte reactionate pozitiv la testul intradermic demonstreaza cresterea concentratiei lizozimului seric, diminuarea procentului de limfocite TH (p<0,005) si totale in comparatie cu lotul negativ. In concordanta cu datele din literatura (Bilbiie V. -1985) numarul limfocitelor TS este crescut. Migrarea leucocitelor este inhibata in prezenta unor cantitati reduse de tuberculina (Blanden R.V. -1974, Ionica C -1974) asa cum se observa si din tabel.

Tratarea culturilor cu PHA P releva indicii de stimulare scazuti in cazul lotului infectat, in timp ce prezenta tuberculinei aviare, respectiv bovine determina o usoara stimulare in comparatie cu martorul (Pop M -1990).

Astfel, fara a detalia mecanismele de actiune ale M.tuberculosis in acest experiment a fost posibila stabilirea unui profil imunologic la bovine reactionate pozitiv la testul tuberculinic.

Lepra este cauzata de o alta micobacterie, M.leprae cu o capacitate deosebita de a invada nervii si afinitate particulara pentru tesuturile "reci" ale corpului. Clinic, gama de modificari indusa de aceasta bacterie este extrem de larga. Ca si M.tuberculosis, nici acest germen nu produce toxine, persista insa liber in citoplasma macrofagelor. Lepra propriu-zisa este caracterizata prin absenta raspunsului imun imediat celular si a distructiilor tisulare pana in fazele tarzii in timp ce lepra tuberculoida induce leziuni severe ale tesuturilor si nervilor. Spre deosebire de tuberculoza, testul cutanat nu poate fi folosit pentru depistarea persoanelor cu infectii inaparente. Boala se poate complica cu exces de antigen circulant, urmat de hipergammaglobulinemie, crioglobulinemie, exces de factor reumatoid, depletie corticala de limfocite T, esecul respingerii grefei si al activarii limfocitelor. Alteori poate apare o reactie de tip Arthus la nivelul pielii si depunerea CIC in articulatii sau rinichi (erithema nodosum leprosum), vasculita necrozanta (fenomenul Lucio), amiloidoza (Drutz D.J. -1983).

Dintre infectiile in cadrul carora dozarea anticorpilor prezinta o semnificatie diagnostica trebuie mentionate histoplasmoza, coccidioidemicoza, bruceloza, tularemia.

Histoplasma capsulatum este un micet diform, cu forme miceliene in afara organismului si levuriforme intracelular. Deficitul imun T determina diseminarea infectiei, asa cum se intampla in cazul soarecilor atimici.

Coccidioides immitis este asemanator histoplasmei. Macrofagele sunt incapabile de a distruge imediat fungul, dar in decurs de 2-3 saptamani este elaborata imunitatea mediata celular care faciliteaza acest proces. Exista doua etape posibile prin care protectia in aceasta boala este abolita, blocajul macrofagelor prelucratoare sau incapacitatea de producere sau functionala a limfokinelor.

Bruceloza, una dintre cele mai importante zooneze, este o infectie cronica, in cadrul careia protectia imuna se exercita de catre celule si anticorpi. Importanta raspunsului mediat celular este sugerata de eficacitatea vaccinarii cu vaccin viu atenuat si elaborarea testului cutanat pentru depistarea reactivitatii. Anticorpogeneza este energica si chiar daca anticorpi nu au rol protector, determinarea concentratiei acestora (aglutinine sau anticorpi fixatori de complement) poate fi extrem de utila pentru diagnostic (Drutz D.J. -1983, Freeman M.J. -1966).

Nu se cunoaste inca mecanismul prin care brucelele rezita activitatii litice la nivelul macrofagului.

3. Infectii fata de care protectia este mixta

Grup de o heterogenitate etiologica extrema, infectiile fata de care protectia imunologica este mixta sunt caracterizate prin prezenta extracelulara sau facultativ intracelulara a agentilor cauzali si prevalenta interventiei mecanismului celular sau umoral, dependent de tipul de imbolnavire. Unele dintre aceste infectii au trasaturi paradoxale; astfel in sifilis desi Treponema pallidum pare a "functiona" ca un agent patogen extracelular totusi mecanismele imunitatii mediate celular sunt esentiale eradicarea sa, iar Cryptococcus neoformans, cu toate ca poseda o capsula antifagocitara, nu se supune rigorii mecanismelor protectoare mediate de polimorfonucleare (Drutz D.J. -1983).

Sifilisul, produs de T.pallidum, o spirocheta cu modalitate deosebita, este o infectie neobisnuita, in cadrul careia nu se recunoaste inca cu precizie cota de participare a efectorilor imuni celulari, respectiv umorali in protectie, iar imunitatea fata de reinfectie este incompleta (Drutz D.J. -1983). Exista date care pledeaza atat pentru interventia anticorpilor cat si a celulelor reactive in eliminarea infectiei.

Salmoneloza este produsa de germeni Gram - negativi, aerobi, din familia Enterobacteriaceae, exprimata clinic prin gastroenterita, infectii extraintestinale focale (osteomielita, anevrism aortic infectat etc.).

In formele gastrointestinale placile Peyer reprezinta o "formidabila" prima bariera de protectie. Imunitatea locala poate fi de asemenea rezultatul stimularii cronice cu bacili enterici.

Salmonelele par a fi sensibile la activitatea bactericida a complementului, activarea fiind independenta de Ac. Implicarea mecanismelor celulare este sugerata in acest caz de prezenta parazitismului intracelular, transferul imunitatii prin limfocite, absenta participarii polimorfonuclearelor la procesul infectios, instalarea imunitatii solide consecutiv administrarii bacililor impreuna cu adjuvant Freund complet si teste cutanate pozitive la acesti indivizi.

Listeria monocytogenes este o bacterie de dimensiuni reduse, Gram - pozitiva, pleiomorfa, care produce imbolnaviri cu consecinte grave, majoritar letale, la animale si accidentale la om, caracterizate prin simptomatologie nervoasa.

Pacientii cu deficite ale imunitatii mediate celular prezinta o susceptibilitate crescuta fata de aceasta boala, listerioza fiind utilizata drept model al imunitatii mediate celular la animale. Germenii patrunsi in organism sunt sechestrati si distrusi de catre macrofage. Polimorfonuclearele joaca un rol important mai tarziu in cursul infectiei. A fost emisa ipoteza protectiei conferite de complementul opsonizant prin transportul intr-un mediu "sigur" prin monocite (Drutz D.J. -1983, Blanden R.V. -1974).