Utilizarea biocompozitelor pe baza de lipozomi in studii privind transportul si eliberarea controlata a unor compusi bioactivi de interes

Utilizarea biocompozitelor pe baza de lipozomi in studii privind transportul si eliberarea controlata a unor compusi bioactivi de interes

Cercetarea farmaceutica, in ultimii ani, a cunoscut o reusita semnificativa in domeniul vectorilor de transport, prin crearea unor noi concepte privind formularile farmaceutice care sa asigure o biodistributie controlata, eficienta si sigura a compusului activ catre tesuturile tinta. Vectorizarea agentului terapeutic conduce la protejarea tesuturilor nevizate de terapie de agresivitatea moleculelor active datorata toxicitatii acestora. Pe de alta parte, prin vectorizare se urmareste marirea potentialului terapeutic al compusilor active transportati intre locul de administrare si celulele tinta, ca urmare a evitarii captarii acestora de sistemul fagocitar mononuclear.

Datorita caracteristicilor precum capacitatea de a ingloba si proteja atat principii active hidrofile cat si hidrofobe, prelungirea duratei de eliberare, biocompatibilitate ridicata, toxicitate scazuta, diversitatea structurilor si compozitiei, lipozomii au cunoscut o atentie deosebita in cadrul studiilor biochimice si farmaceutice din sectorul vectorilor de transport, [M. S. Mufamadi si colab., 2011].

Lipozomi - modele artificiale de biomembrane

Lipozomii - vezicule fosfolipidice microscopice - sunt definiti ca fiind vezicule microscopice in care un volum apos este complet inconjurat de catre o membrana compusa din molecule lipidice, organizate in unul sau mai multe straturi dispuse concentric. Datorita caracterului amfipatic, lipozomii sunt utilizati pentru distributia atat a compusilor activi hidrofili (incapsulare in compartimentul intern apos), cat si cei cu proprietati hidrofobe (incapsulare in bistratul lipidic), [H. Anwekar si colab., 2011

Denumirea lor deriva din limba greaca - lipos = grasime si soma = corpuscul [M. R. Mozafari, 2010 . Lipozomii pot fi formati intr-o varietate de forme si marimi, insa numele lor este legat de caramizile de constructie - fosfolipidele, si nu de marimea lor, [H. Anwekar si colab., 2011

Pentru prima oara lipozomii au fost descrisi in literatura de specialitate in anul 1961 de catre hematologul britanic Dr. Alec D. Bangham, ce isi desfasura activitatea de cercetare la Institutul Babraham din Cambridge. Erau folositi ca modele de membrane biologice [H. Anwekar si colab., 2011 J. S. Dua si colab., 2012]. Ulterior, numerosi cercetatori au studiat aceste sisteme din diferite puncte de vedere, clarificand anumite proprietati ale membranelor biologice [M. R. Mozafari, 2010 Recent, au fost realizate noi descoperiri in domeniul vectorilor de transport, de la produse aprobate clinic, la noi aplicatii terapeutice [V. P. Torchilin, 2005

De la introducerea lor in studii, au fost realizate progrese considerabile privind tehnicile de obtinere a acestora. Astfel, prin modelarea unor proprietati fizico-chimice precum permeabilitatea membranei, stabilitatea lor in timp, tendinta de agregare si fuziunea lor, s-au obtinut si optimizat diverse tipuri de vezicule lipozomale cu aplicatii terapeutice.

Caracteristicile lor depind atat de protocolul de obtinere cat si de componenta bistratului lipidic. Fluiditatea membranara este dictata pe de o parte de alegerea componentelor bistratului lipidic. De exemplu, fosfolipidele saturate avand acizi grasi cu lanturi lungi formeaza o structura rigida si destul de impermeabila, in timp ce speciile de fosfatidilcolina nesaturate provenite din surse natulale formeaza o structura mult mai permeabila si mai putin stabila. [D. J. A. Crommelin si colab., 2003

Lista compusilor activi ce pot fi incapsulati in lipozomi este imensa, avand aplicatii in domenii variate precum industria farmaceutica, cosmetica si alimentara. Lipozomii sunt capabili sa sporeasca performantele compusilor activi prin incapsularea lor, ducand la cresterea biodisponibilitatii lor in vecinatatea receptorilor biologici, reducerea toxicitatii, precum si protejarea compusilor activi fata de actiunea distructiva a unor factori externi si interni [M. R. Mozafari, 2010 Lipozomii incarcati cu compusii terapeutici pot fi administrati prin mai multe cai si anume: intravenos, inhalare orala, aplicatii locale, ocular, [M. Riaz, 1996

1.1. Clasificarea lipozomilor

Conform datelor din literatura de specialitate, se pot distinge mai multe moduri de clasificare a acestora, [H. Anwekar si colab., 2011 J. S. Dua si colab., 2012

v    dupa marimea si modul de organizare;

v    dupa tipul lipidelor din stratul dublulipidic;

v    dupa compozitie si aplicatiile acestora

v    dupa metoda de preparare.

Clasificarea lipozomilor dupa marime si modul de organizare

In afara de constituentii chimici, care determina proprietati ca: fluiditatea membranei, densitatea de sarcina si permeabilitatea, lipozomii pot fi caracterizati prin marimea lor. Ei pot varia ca marime, de la cea mai mica vezicula obtinuta teoretic (diametrul ~ 20 nm), determinata de aglomerarea maxima posibila pe care o tolereaza capetele polare, la lipozomii care sunt vizibili sub microscop optic, cu un diametru de 1000 nm (1micron) sau mai mult. De asemenea, lipozomii pot fi unilamelari (avand doar un singur bistrat ce inconjoara mediul intern apos), sau multilamelari (mai multe bistraturi lipidice orientate concentric in jurul mediului intern apos).

Avand in vedere acestea, lipozomii se impart conform urmatoarei diagrame.

Diagrama X. Clasificarea lipozomilor pe baza parametrilor structurali, dupa J. S. Dua si colab., 2012 G. Storm, D. J. A. Crommelin, 1998

v     Vezicule multilamelare (MLV) - constau dintr-o populatie de vezicule ce acopera un domeniu mare de dimensiuni (100 - 1000 nm), fiecare vezicula in general, fiind formata din 5 sau mai multe lamele (straturi) concentrice;

v     Vezicule unilamelare mici (SUV) - sunt acele vezicule care au marimea cea mai mica posibila (mai mica de 40 nm). Aceasta limita variaza usor in functie de taria ionica a mediului apos si in functie de compozitia de lipide a membranei. Deoarece, conform definitiei, acesti lipozomi au marimea aproape de limita inferioara a dimensiunilor posibile pentru veziculele fosoflipidice, ei formeaza o populatie relativ omogena;

v     Vezicule unilamelare mari (LUV) - sunt acele vezicule care au diametru mai mare de 1000 nm si sunt formate doar dintr-un singur bistrat membranar;

Figura X. Clasificarea lipozomilor in functie de marimea lor [www.medscape.com]

In urma metodelor de preparare a lipozomilor, se obtin populatii heterogene de vezicule cu o distributie larga de marimi. Este foarte importanta caracterizarea preparatelor lipozomale in functie de marime lor, deoarece volumul incapsulat variaza cu marimea. Chiar si lipozomi de aceeasi marime si lamelaritate pot avea diferite distributii interne ale fazei apoase.

In functie de proprietatile lipidelor, s-au stabilit mai multe structuri privind modul de organizare al lipozomilor. Fiecare structura se formeaza pe baza conformatiei celei mai favorabile din punct de vedere energetic. Pentru stabilirea modului de organizare, se are in vedere un parametru care se defineste ca fiind raportul dintre volumul ocupat de lanturile de hidrocarburi (v) si produsul dintre aria efectiva a gruparilor polare (a) si lungimea cozilor hidrofobe ale lipidelor (l_c), D. A. Balazs, W. T. Godbey, 2011

(X)

Figura X. Ilustrarea modului de organizare a lipozomilor in functie de parametru P, dupa [D. A. Balazs, W. T. Godbey, 2011

Clasificarea lipozomilor dupa compozitie si aplicatiile acestora

Sistemele lipozomale au un mare avantaj spre deosebire de alte sisteme coloidale de transport si cedare controlata a principiilor active, si anume, prezinta o flexibilitate remarcabila in ceea ce priveste modificarea caracteristicilor structurale si functionale in vederea adaptarii acestora la nevoile specifice terapeutice G. Storm, D. J. A. Crommelin, 1998

Intr-o incercare de a clasifica variantele de lipozomi, se pot distinge in linii mari 4 tipuri de vezicule lipozomale pe baza compozitiei si aplicatiilor in vivo.

Diagrama X. Clasificarea lipozomilor dupa compozitie si aplicatiile acestora, dupa J. S. Dua si colab., 2012

Lipozomii conventionali

Reprezinta prima generatie de lipozomi care au fost utilizati in farmaceutica. Sunt obtinuti in general doar din fosfolipide (neutre sau incarcate negativ) si/sau colesterol. Desi, manipularea unor proprietati precum marimea, compozitia lipidelor, numarul bistraturilor lipidice, fluiditatea acestora reprezinta un instrument valoros utilizat in procesul de obtinere, acesti lipozomi prezinta dezavantajul unui timp de circulatie relativ mic prin sange, fiind eliminati rapid de catre macrofage, [M. S. Mufamadi si colab., 2011]. Atunci cand sunt administrati in vivo prin diferite cai parentale, prezinta o tendinta puternica de acumulare rapida in celulele sistemului fagocitar mononuclear (MPS), denumit si sistemul reticuloendotelial (RES), N. Maurer si colab., 2001 Desi prezinta o serie de dezavantaje, totusi, ei sunt utilizati cu succes in livrarea agentilor antimicrobieni catre macrofagele infectate, in livrarea antigenelor pentru tratarea infectiilor virale, bacteriene si parazitare, G. Storm, D. J. A. Crommelin, 1998

Lipozomi cu circulatie indelungata

Reprezinta o piatra de hotar in cercetarea din domeniului vectorilor de transport, fiind dezvoltati pentru a depasi unele provocari intampinate in cazul lipozomilor coventionali, precum incapacitatea de a se sustrage interceptarii lor de catre celulele mactofage, permitandu-le astfel sa ramana in circulatie pentru o perioada mai lunga de timp, [M. S. Mufamadi si colab., 2011]. Obtinerea lor s-a realizat prin atasarea covalenta pe suprafata externa a lipozomilor conventionali a unor lanturi liniare de polimer hidrofil (polietilenglicol - PEG). Acesti lipozomi astfel formati sunt cunoscuti si sub denumirea de "stealth liposomes" sau lipozomi stabilizati steric si prezinta o solubilitate excelenta in medii apoase. Stabilizarea sterica rezulta din concentratia gruparilor PEG puternic hidratate care creaza o bariera sterica, prevenind astfel interactiile cu componentele celulare din mediul biologic (interactia cu opsoninele si absorbtia de catre celulele fagocitare din ficat si splina), G. Storm, D. J. A. Crommelin, 1998

Figura X. Reprezentarea schematica alipozomilor cu circulatie indelungata [dupa www.azonano.com]

Imunolipozomi

Sunt obtinuti prin atasarea unor anticorpi sau fragmente de anticorp specifici pe suprafata lipozomilor conventionali, cu scopul de a imbunatati legarea de locurile tinta. In mare parte sunt utilizati pentru transportul si eliberarea controlata a agentilor antitumorali. Pentru a prelungi timpul de viata al imunolipozomilor si pentru a le oferi o sansa mai mare de a ajunge la locurile tinta, fara a fi atacate de catre macrofage, s-a incercat atasarea pe suprafata lor a moleculelor de polietilenglicol, studii care au fost incununate de succes, G. Storm, D. J. A. Crommelin, 1998

 

Figura X. Reprezentarea schematica a unui imunolipozom [www.visualscience.ru/en]

Lipozomi cationici

Numiti si catezomi, reprezinta cei mai noi reprezentanti ai familiei lipozomilor. Sunt studiati pentru imbunatatirea transportului materialului genetic, A. Chaudhuri, 2003 Lipidele cationice interactioneaza electrostatic cu bazele ADN-ul incarcat negativ, formandu-se astfel structuri capabile sa traverseve bistratul lipidic al celulelor tinta si sa ajunga la nucleul acestora unde ADN-ul este cedat treptat. G. Storm, D. J. A. Crommelin, 1998

Figura X. Reprezentarea schematica a unui lipozom cationic [A. Bolhassani si colab., 2011

Magnetolipozomi

Sunt lipozomi ce contin particule magnetice incorporate in bistratul lipidic. Scopul obtinerii acestora a fost transportarea si cedarea monitorizata a diversilor compusi activi terapeutici, fortandu-i sa oscileze sub actiunea unui camp magnetic constant, [J. James, M. Kullberg, 2006 O echipa de cercetatori de la universitatea Cagliari, Italia, a dezvoltat astfel de sisteme lipozomale, pe baza de oxid de fier si ferita de cobalt. O provocare in acest caz, ramane gasirea unor solutii pentru eliminarea magnetilor dupa ce acestia si-au indeplinit scopul, [C. Cannas si colab., 2010

Figura X. Reprezentarea schematica a unui magnetolipozom [S. Nappini si colab., 2010

1.2. Proprietati fizico - chimice

1.3. Prepararea lipozomilor ca modelelor de membrane artificiale

In literatura de specialitate sunt descrise numeroase tehnici de obtinere a veziculelor lipozomale care de-a lungul timpului au fost perfectionate. O serie de proprietati ale lipozomilor precum tipul, marimea, capacitatea de incarcare si de retinere a substantei active, depind de metoda utilizata la prepararea acestora, J. S. Dua si colab., 2012

In functie de tipul veziculelor lipozomale, se disting urmatoarele metode de preparare:

Obtinerea veziculelor multilamelare (MLV)

Metoda hidratarii filmului lipidic

In cadrul acestei metode, fosfolipidele sunt amestecate si dizolvate intr-un solvent organic (de obicei cloroform, etanol, eter, metanol, sau un amestec in diferite proportii al acestor solventi). Solventul este indepartat prin evaporare utilizand un rotaevaporator sau uscare sub azot, formandu-se un film lipidic pe fundul si pe peretii balonului. Filmul lipidic uscat, omogenizat, este apoi hidratat sub agitare cu faza apoasa. Temperatura de hidratare a suspensiei trebuie sa fie mai mare decat temperatura de tranzitie in faza de cristal lichid pentru obtinerea unor lipozomi cat mai stabili. In timpul acestei etape de hidratare a lipidelor, se formeaza vezicule multilamelare mari (MLV). In functie de solubilitatea lor, agentii terapeutici sunt adaugati fie in solventul organic in care s-au dizolvat lipidele, fie in faza apoasa. Aceasta metoda este simpla si rapida, insa prezinta unele dezavantajele, principalul fiind o eficienta de incapsulare scazuta, [M. Riaz, 1996

Obtinerea veziculelor unilamelare mari (LUV)

Metoda injectarii solventului

Lipidele dizolvate in etanol sau intr-o solutie eterica, sunt injectate rapid (cu ajutorul unei seringi) intr-o solutie apoasa aflata sub agitare ce contine compusul activ ce se urmareste a fi incapsulat Inlaturarea ulterioara a solventului sub vid conduce la formarea veziculelor unilamelare mari. Principalul dezavantaj al acestei metode este faptul ca agentul terapeutic ce urmeaza a fi incapsulat intra in contact cu solventul organic [M. Riaz, 1996

Metoda eliminarii detergentului

Detergentii sunt utilizati pentru a solubiliza lipidele. Indepartarea detergentului din sistem se poate realiza apoi prin diverse metode precum dializa, centrifugare, cromatografie pe coloana, adsorbtia pe bile urmata de filtrare. O data ce acesta este indepartat treptat din faza apoasa, miceliile devin progresiv bogate in fosfolipide, fapt ce conduce la formarea de LUV-uri. Aceasta metoda prezinta unele avantaje precum reproductibilitatea excelenta si obtinerea unei populatii omogene de lipozomi, insa principalul dezavantaj il reprezinta posibila retentie a unor urme de detergent in veziculele lipozomale, [M. Riaz, 1996

Metoda evaporarii solventului in faza inversa

Asigura obtinerea lipozomilor unilamelari mari (LUV) care prezinta o capacitate de incapsulare crescuta si permit incluziunea macromoleculelor (proteine, enzime, ADN). Intr-o prima faza, fosfolipidele sunt dizolvate in solventi organici (dietileter, izopropileter sau ameste al acestora cu cloroform), procesul fiind urmat de adaugarea fazei apoase care contine compusul activ de interes. Solventii organici sunt inlaturati printr-o evaporare continua sub presiune redusa obtinandu-se o emulsie vascoasa. Ulterior, lipozomilor unilamelari mari (LUV) sunt obtinuti prin trecerea MLV-urilor prin membrane de policarbonat sub azot, extrudarea realizandu-se sub presiune moderata (100 - 250 psi), [M. Riaz, 1996

Obtinerea veziculelor unilamelare mici (SUV)

Marimea veziculelor multilamelare MLV poate fi redusa utilizand una din metodele enumerate in continuare:

Metoda sonicarii

Exista doua metode prin care lipozomii MLV pot fi sonicati: fie prin introducerea varfului sondei in proba, fie prin scufundarea probei intr-o baie de sonicare. Suspensia de lipozomi devine mult mai clara, obtinandu-se o solutie usor transparenta. Usoara opacitate se datoreaza luminii imprastiate indusa de veziculele mari ramase in suspensie. Aceste particule mari pot fi indepartate prin centrifugare pentru a obtine o suspensie clara de lipozomi SUV. Astfel se separa sedimentul de supernatant, cel care este folosit in diverse experimente. Insa, datorita gradului mare de curbare a acestor vezicule, SUV-urile sunt instabile si vor fuziona in mod spontan formand vezicule mari atunci cand sunt pastrate la o temperatura mai mica decat temperatura tranzitiei de faza, M. Riaz, 1996

Metoda extrudarii

Reprezinta o alta metoda prin care se poate micsora dimensiunea vezicule multilamelare mari. In acest caz, suspensia de lipide este trecuta prin membrane din policarbonat ai carui pori sunt de o anumita dimensiune, permitand diminuarea progresiva a marimii lipozomilor, precum si a numarului de bistraturi. Inainte de extruderea prin filtrul final, suspensia de lipozomi este trecuta printr-un prefiltru care are dimensiunea porilor mai mare, acest procedeu prevenind infundarea membranei utilizate in final cu porii de dimensiune mica si de asemenea imbunatatind omogenitatea suspensiei.

Metoda microfluidizarii

Reducerea marimii veziculelor lipozomale poate fi realizata si cu ajutorul unui microfluidizor. Lipozomii MLV sunt circulati sub presiune ridicata (10 000 psi) cu ajutorul unei pompe prin camera de interactie a microfluidizorului unde se produce micsorarea dimensiunii lor. Sunt pompati cu viteza mare prin microcanale ce au anumite dimensiuni, procesul repetandu-se pana ce marime alipozomilor este redusa la cea dorita. Datorita presiunii utilizate destul de mari, are loc o degradare partiala a lipidelor, acesta fiind si principalul dezavantaj, [M. Riaz, 1996

1.4. Incapsularea substantelor active in lipozomi, sau asocierea lor cu lipozomii preformati

Selectarea unui protocol de incapsulare depinde in general de anumiti parametri precum: eficienta de incapsulare si de retentie, raportul lipid/agent terapeutic [E. Goncxalves, si colab., 2004 usurinta prepararii, sterilitatea, eficienta costurilor, stabilitatea lipozomilor si acompusilor de interes, si nu numai, [L. D. Mayer si colab., 1986

Agentii terapeutici pot fi transportati mult mai eficient catre celulele tinta prin includerea lor in licpozomi, acest proces realizandu-se atat prin incapsularea lor in structura lipozomilor cat si prin asocierea cu lipozomii preformati.

In cazul substantelor active hidrofile, procesul de incapsulare este dictat de randamentul de incapsulare si de volumul compartimentului apos. Eficacitatea incapsularii compusilor activi de interes, poate depinde de o serie de factori precum: concentratia compusilor hidrosolubili si liposolubili, natura fosfolipidelor, marimea si modul de organizare a veziculelor lipozomale, sarcina electrica a lipidelor si taria ionica a mediului apos, temperatura, si nu numai.

Eficienta de incapsulare poate fi calculata raportand cantitatea de medicament incapsulat la cantitatea de medicament total, conform urmatoarei ecuatii U. D. Shivhare L. N. Ramana, 2010

Cele mai utile strategii de incorporare a substantelor active in lipozomi sunt metodele pasive sau cele active (de la distanta).

In mediul in care se afla complexul format, se pot regasi la final, in functie de metoda de preparare a lipozomilor, cantitati relativ mari de compus neincapsulat, care poate fi indepartat prin diverse tehnici - dializa, ultracentrifugare, cromatografie pe coloana.

Incapsularea prin metodele active se refera la incarcarea substantei active in lipozomii preformati, fara afectarea integritatii bistratului lipidic. Acest procedeu presupune in general crearea unui gradient transmembranar de pH, obtinandu-se astfel o diferenta de pH intre mediul intern apos si mediul extern in care lipozomii se gasesc in suspensie. Spre deosebire de tehnica incarcarii pasive, in majoritatea cercetarilor efectuate in acest domeniu, s-a observat o crestere semnificativa a acumularii agentilor terapeutici in lipozomi, ca raspuns la crearea gradientului de pH. Un alt avantaj al utilizarii acestei tehnici este acela ca, compusii ce prezinta o instabilitate ridicata pot fi incapsulati chiar inainte de aplicarea preparatelor lipozomale.

1.5. Avantajele si dezavantajele utilizarii lipozomilor ca sisteme de eliberare controlata a compusilor activi

Proprietatile fizico - chimice si avantajele principale ale lipozomilor justifica pe deplin obiectivele urmarite prin utilizarea lipozomilor ca sisteme de eliberare controlata a compusilor activi:

transportarea compusului activ eficient si sigur catre celulele tinta din organism, crescandu-i astfel eficacitatea terapeutica si totodata tesuturile sensibile sunt mai bine protejate prin reducerea toxicitatii compusilor inglobati ca urmare a eliberarii acestora in aria patologica de actiune H. Anwekar si colab., 2011 J. S. Dua si colab., 2012

datorita caracterului amfipatic, lipozomii reprezinta un sistem de incapsulare potrivit pentru o gama mare de compusi, prin urmare, pot fi inglobati pentru vectorizare numeroase substante active lipofile (in stratul dublu lipidic), hidrofile (in compartimentul apos) sau amfifile (in ambele)  [D. D. Lasic, 1995

au abilitatea de a proteja compusii incapsulati de actiunea distructiva a unor factori externi (aer, lumina) sau interni (enzime sau inhibitori prezenti in mediile biologice) si sa actioneze ca depozite pentru eliberare prelungita, conducand astfel la reducerea frecventei administratiilor;

pot fi preparati atat sub forma de suspensie, aerosol, sau intr-o forma semisolida precum gel, crema sau lotiune, sub forma de pulbere pentru livrarea prin mai multe cai, inclusiv oculare, nazale, orale, intramusculare, subcutanate si intravenoase;

ca vectori medicamentosi permit administrarea unor compusi activi a caror administrare ridica probleme. Astfel, cresc stabilitatea agentilor terapeutici prin incapsularea acestora si reduc toxicitatea conducand la diminuarea expunerii tesuturilor sensibile la acesti compusi toxici;

prezinta flexibilitate pentru a interactiona cu liganzi specifici in transportul activ, in unele cazuri molecule transportate neputand penetra membrana celulara din cauza unor proprietati fizico-chimice restrictive;

veziculele lipozomale sunt biocompatibile, complet biodegradabile si netoxice.

Formularile pe baza de lipozomi prezinta si cateva dezavantaje precum: conditiile de preparare complicate si costisitoare, probleme legate de sterilizarea si stabilitatea lor, precum si timp de viata scazut, H. Anwekar si colab., 2011

2. Utilizarea biocompozitelor pe baza de lipozomi in terapia genica

Ingineria genetica este un domeniu care a progresat rapid, cheia succesului fiind proiectarea unor vectori capabili sa serveasca drept vehicule pentru transportul eficient si sigur al materialului genetic.

Intrucat moleculele de acizi nucleici nu pot strabate cu usurinta membranele celulare datorita greutatii moleculare mari si a caracterului hidrofob, prin incapsularea lor in lipozomi s-a observat o eficienta crescuta in livrarea materialului genetic.

Incapsularea acizilor nucleici a fost pentru prima data descrisa in literatura, in anul 1987, de catre Felgner si colaboratorii sai, inaintea dezvoltarii lipozomilor cationici, [C. H. Su si colab., 2008 Primul raport descria incapsularea prin metode pasive a oligonucleotidelor cu masa molara mica in lipozomii neutrii. Ulterior, imbunatatirea tehnicilor de preparare a lipozomilor a condus la cresterea randamentului de incapsulare si la eficientizarea biodistributiei la nivelul celulelor tinta, [I. MacLachlan, 2007

Intelegerea mecanismelor care stau la baza formarii complexelor ADN-lipozomi, denumite si lipoplexi, si care guverneaza caracteristicile energetice, structurale si termodinamice, este esentiala pentru dezvoltarea acestor vectori si pentru optimizarea eficientei de incapsulare.

Avand in vedere importanta biologica a interactiei lipide - ADN, aceasta a fost intensiv studiata utilizand abordari diferite si urmarind obiective diferite prin tehnici precum: spectroscopia de absorbtie si emisie in domeniul UV-VIS [C. Madeira, si colab., 2011 P. A. Monnard si colab., 1997 spectroscopia de absorbtie in domeniul infrarosu [S. Choosakoonkriang si colab, 2003 E. Suleymanoglu, 2009], dicroism circular [L. Ciani si colab., 2007], microscopie de forta atomica [V. Oberle si colab., 2003 B. Wang sic lab., 2012 microscopia de transmisie electronica [Y. Sun si colab., 2009] si metodele electrochimice [J.A.P. Piedade si colab., 2004

In urma acestor studii, s-a stabilit faptul ca formarea complexului lipozomi cationici - ADN este o consecinta a proceselor de autoasamblare declansate de interactiile electrostatice dintre lipide si bazele ADN-ului, P. Harvie si colab., 1998 D. A. Balazs, W. T. Godbey, 2011] Formarea complexului este determinata de fortele de atractie electrostatica dintre capetele polare ale lipidelor si gruparile fosfat incarcate negativ ale ADN-ului, [S. May, A. B. Shaul, 2004 C. R Safinya si colab., 2006 In timpul formarii lipoplexilor au fost evidentiate modificari structurale atat in cazul lipozomilor cat si ADN-ului, [J.A.P. Piedade si colab., 2004

Figura X. Aranjarea ADN-ului intre bistraturile lipidice ca un singur strat de elici paralele, dupa [C. R Safinya si colab., 2006

Studiile bazate pe radiatiile X au furnizat informatii referitoare la trei geometrii de baza ale complexelor ADN - lipide. Primul, complexul "sandwich", figura X - A, este format din bistraturi lipidice intre care sunt intercalate monostraturi formate din catede paralele de ADN. Distanta dintre catenele adiacente de ADN depinde de compozitia bistraturilor lipidice si este in domeniu 25 Å - 70 Å, iar distanta dintre staturile de lipide este de aproximativ 26 Å si este aproape constanta in toate complexele lamelare. O alta aranjare a complexului este cea reprezentata in figura X - B, fiind denumita "fagure de miere". In acest caz, catenele ADN-ului sunt intercalate in tuburile matricei lipidice hexagonale. Diametrul acestor "tuburi" este doar cu cativa Å mai mare decat diametrul lanturilor de ADN, atractiile puternic electrostatice dintre gruparile fosfat ale ADN-ului si capetele polare ale lipidelor care inconjoara ADN-ul, tinzand sa minimizeze distanta dintre lipide si ADN. O a treia geometrie a complexului, sustinuta si de studiile de microscopie electronica, este cea sub forma de "spaghete", reprezentata schematic in figura X - C. Aceasta este o structura metastabila, avand energia libera mai mare decat cea a structurii "fagure de miere", speculandu-se astfel faptul ca este o structura de tranzit, fiind un posibil precursor al acestei geometrii, S. May, A. B. Shaul, 2004

Figura 4. Ilustrarea celor trei geometrii principale ale lipoplexilor. (A) structura "sandwich"; (B) structura "fagure de miere"; (C) structura "spachete", [dupa S. May, A. B. Shaul, 2004

Acizii nucleici nu sunt usor de incarcat in lipozomii preformati utilizand metoda crearii unui gradient de pH sau alte metode active de incarcare. Acest lucru se datoreaza in principal marimii si naturii hidrofile a acizilor nucleici, care conspira pentru a le impiedica sa traverseze bistratul lipidic al lipozomilor. Din acest motiv, incarcarea acizilor nucleici in lipozomi se realizeaza utilizand tehnica de incapsulare pasiva, conform urmatoarei scheme.

Schema X. Metoda pasiva de incarcate a moleculelor de ADN in lipozomi

3. Utilizarea biocompozitelor pe baza de lipozomi in livrarea agentilor terapeutici din clasa peptidelor si proteinelor

Numeroase proteine si peptide sunt la ora actuala utilizate in terapia unor boli pentru care inca se mai cauta o farmacoterapie eficienta, datorita obtinerii proteinelor pe scara larga prin biotehnologie. Proteinele au un spectru impresionant de indicatii terapeutice, incluzand agentii terapeutici adresati bolilor sistemului cardiovascular, agentii antivirali, antialergici, analgezici si antiinflamatori, agentii antineoplazici. Administrate pe caile conventionale, proteinele si peptidele se caracterizeaza printr-o biodisponibilitate redusa datorita multor factori: permeabilitatea redusa prin membrane, instabilitatea fizico-chimica a moleculei si timpul redus de rezistenta la locul absorbtiei. Administrarea proteinelor pe cai convenabile si noninvazive ar fi posibila insa cu ajutorul sistemelor de transport la tinta.

4. Utilizarea agentilor terapeutici din clasa antioxidantilor in prevenirea si reducerea degradarii membranelor celulare datorita proceselor de oxidare

Cercetatorii au devenit tot mai interesati de studierea efectelor antioxidante ale compusilor polifenolici. Principalul motiv pentru acest interes este abundenta lor mare in dieta noastra si rolul lor in prevenirea diferitelor boli asociate stresului oxidativ precum cancerul, bolile cardiovasculare si neurodegenerative, [G. S. Cetkovic so colab., 2007

Cea mai buna intelegere a conceptului de antioxidanti trebuie sa tina seama de complexitatea proprietatilor unui astfel de compus.

Termenul de antioxidant se defineste ca fiind orice substanta care, prezenta in cantitati mici comparativ cu substratul oxidabil, intarzie semnificativ sau inhiba oxidarea substratului respectiv. Antioxidantii sunt molecule stabile cu electroni in plus sau cu capacitatea de a primi electroni suplimentari.

In lucrarile din domeniu sunt descrise mai multe mecanisme de actiune a antioxidantilor, care se implica in diferite etape ale procesului oxidativ. In principal, neutralizarea radicalilor liberi se realizeaza prin transferul unui electron singular (TES); donarea unui atom de hydrogen (TAH); sau complexarea ionilor metalelor tranzitionale care catalizeaza procesele oxidative, [G. S. Cetkovic so colab., 2007

Este general acceptat faptul ca proprietatile antioxidante ale compusilor flavonici trebuie explicate atat prin structura chimica cat si prin modul cum se pozitioneaza in bistraturile lipidice. Reactivitate lor mare este datorata in principal nucleului fenolic.

Interactia flavonoid - membrana constituie un subiect de interes, studiile aratand faptul ca interactiile polifenolilor cu suprafata bistratului lipidic prin legaturi de hidrogen pot reduce accesul unor molecule daunatoare precum oxidantii, in acest fel protejand structura si functiile membranelor.

Polifenolii sunt cei mai importanti antioxidanti, actionand ca agenti reducatori, donori de atomi de hidrogen si intrerupatori de lant pentru reactiile initiate prin oxigenul singlet. Ca urmare a tuturor acestor efecte, activitatea antioxidanta a polifenolilor este considerata ca fiind mult mai mare decat cea a vitaminelor esentiale. Se poate concluziona ca activitatea antioxidanta a flavonoidelor este determinata predominant de particularitatile lor structurale, fiind datorata mai ales nucleelor aromatice din structurile fenolice. Cand acesti compusi polifenolici reactioneaza cu un radical liber, propagarea reactiei radicalice este impiedicata prin stabilizarea radicalul liber, in urma primirii electronului lipsa.

Figura X. ..

Flavonoidele sunt compusi polifenolici a caror structura este reprezentata de un heterociclu piranic sau furanic (C) condensat cu inelul benzenic A, la care se cupleaza cel de al doilea inel benzenic B in pozitiile 2, 3 sau 4.

Fig. 2. Reprezentarea schematica a structurii chimice a flavonoidelor cu heterociclu piranic de care se leaga in pozitia 2 inelul benzenic B

Compusii flavonici, prin caracterul reducator al gruparilor -OH fenolice, dar si prin proprietatea de a chelata metalele bi si trivalente (Mg²⁺, Cu²⁺, Al³⁺), manifesta proprietati antioxidante. Elementele structuraleale compusilor flavonici care dicteaza actiunea protectoare fata de speciile reactive ale oxigenului se refera la: prezenta gruparii -OH libere in pozitia 3 a nucleului benzopiranic, dubla legatura intre carbonii 2 - 3; grupari -OH fenolice pe inelele benzenice, Figura X (cea de la quercitina).

Masuratorile de capacitate si rezistenta electrica efectuate pe bistraturi lipidice plane au indicat localizarea in bistratul lipidic in pozitii diferite, a moleculelor de flavones. Cresterea ponderii caracterului hidrofil in raport cu cel hidrofob, determinata de cresterea numarului de grupari hidroxilice are o influenta decisiva asupra localizarii flavonelor in membrana celulara. Spre exemplu, quercitina are 5 grupari -OH si se localizeaza la interfata dintre zona polara si zona hidrofoba. Datorita acestei pozitii si posibilitatii de a face punti de hidrogen cu grupele polare, quercitina are un efect de stabilizare a bistratului lipidic. Actiunea antioxidanta a acidului cafeic este datorata, in principal, caracterului sau reducator.

 

Figura X. A) Structura chimica a quercitinei; B) Structura chimica a acidului cafeic, [www.rdchemicals.com]

Pentru a intelege mai bine mecanismele de actiune ale compusilor flavonici, studiile asupra relatiei structura - activitate au cunoscut o atentie sporita. Oricum stabilirea acestei relatii este departe de a fi completa datorita faptului ca exista mai mult de 4000 de compusi flavonici.

5. Modalitati in care lipozomii pot interactiona cu membrana celulelor canceroase

Referinte

B. Halliewell, Oxidative stress and cancer: have we moved forward? Biochem. J. (2007)

A. A. Dayem, H. Y. Choi, J. H. Kim, S. G. Cho, Role of Oxidative Stress in Stem, Cancer, and Cancer Stem Cells, Cancers

O. A. Oduntan, K. P. Mashige, A review of the role of oxidative stress in the pathogenesis of eye diseases, S Afr Optom 2011 70(4) 191-199

M. Riaz, Liposomes Preparation Methods, Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences

Vol.19(1), January 1996, pp.65-77

M. R. Mozafari, Nanoliposomes: Preparation and Analysis, Chaper 2, Liposomes - Methods in Molecular Biology, Vol. 605, Humana Press 2010

[6] S. Nappini,  F. B. Bombelli,  M. Bonini,  B. Norden, P. Baglioni, Magnetoliposomes for controlled drug release in the presence of low-frequency magnetic field, Soft Matter, 2010, 6, 154-162

J. James, M. Kullberg, A Method for Drug Delivery using Magnetoliposomes Ethnicity & Disease, Volume 16, 2006, pp: 5 - 9

H. Anwekar, S. Patel, A. K. Singhai, Liposome - as drug carriers International Journal of Pharmacy & Life Sciences, 2(7): July, 2011, pp:

J. S. Dua, A. C. Rana, A. K. Bhandari, Liposome: Methods of Preparation and Applications International Journal of Pharmaceutical Studies and Research, Vol. III, nr. II, 2012, pp: 14-20

P. Harvie, F. M. Wong, M. B. Bally, Characterization of Lipid DNA Interactions. I. Destabilization of Bound Lipids and DNA Dissociation Biophysical Journal Volume 75 August 1998 1040-1051

D. D. Lasic, Applications of Liposomes, Capitolul 10, Handbook of Biological Physics, Vol 1, Elsevier Science B. V., 1995

E. Schnitzer, I. Pinchuk, D. Lichtenberg, Peroxidation of liposomal lipids, Eur Biophys J (2007) 36:499-515

J. A. Doorn, D. R. Petersen, Covalent modification of amino acid nucleophiles by the lipid peroxidation products 4-hydroxy-2-nonenal and 4-oxo-2-nonenal, Chem Res Toxicol 15: 1445-1450, 2002.

[14] S. P. Aubourg, Recent advances in assessment of marine lipid oxidation by fluorescence, Review. J Am Oil Chem Soc 76: 409-419, 1999

[15] E. R. Stadtman, B S.Berlett, Reactive oxygen-mediated protein oxidation in aging and disease. Chem Res Toxicol 10: 485-494, 1997.

[16] G. Manda, M. T. Nechifor, T. M. Neagu, Reactive Oxygen Species, Cancer and Anti-Cancer Therapies, Current Chemical Biology, 2009, 3, 342-366

[17] S. May, A. B. Shaul, Modeling of Cationic Lipid-DNA Complex, Current Medicinal Chemistry,

I. MacLachlan, Liposomal Formulations for Nucleic Acid Delivery, Chapter 9, Antisense Drug Technology: Principles, Strategies, and Applications, Second Edition, CRC Press Taylor & Francis Group 2007

[19] J.A.P. Piedade, M. Mano, M.C. Pedroso de Lima, T.S. Oretskaya, A.M. Oliveira-Brett Electrochemical sensing of the behaviour of oligonucleotide lipoplexes at charged interfaces, Biosensors and Bioelectronics 20 (2004) 975-984

[20] S. Choosakoonkriang, C. M. Wiethoff, G. S. Koe, T. J. Anchordoquy, C. R. Middaugh, An infrared spectroscopy study of the effect of hydration on cationic lipid/DNA complexes. J. Pharm. Sci. 92, 115-130, 2003.

V. P. Torchilin, Recent Advances with Liposomes as Pharmaceutical Carriers, Nature Reviews Drug Discovery, Volume 4, 145 - 160

D. J. A. Crommelin, G. W. Bos, S. Gert, Liposomes - Successful Carrier Systems for Targeted Delivery of Drugs Pharmatech 2003, 209 - 2013

[23] G. Storm, D. J. A. Crommelin, Liposomes: quo vadis?, Pharmaceutical Science & Technology Today, Vol. 1, No. 1 April 1998, pp: 19 - 31

M. S. Mufamadi, V. Pillay, Y. E. Choonara, L. C. Du Toit, G. Modi, D. Naidoo, V. M. K. Ndesendo, A Review on Composite Liposomal Technologies for Specialized Drug Delivery, Journal of Drug Delivery, Volume 2011, Article ID 939851, 19 pages

A. Bolhassani, S. Safaiyan, S. Rafati, Improvement of different vaccine delivery systems for cancer therapy Molecular Cancer

C. Cannas, A. Ardu, D. Peddis, C. Sangregorio, G. Piccaluga, A. Musinu, Surfactant-assisted route to fabricate CoFe₂O₄ individual nanoparticles and spherical assemblies, Journal of Colloid and Interface Science, Volume 343, Issue 2, 15 March 2010, Pages 415-422

[27] C. R Safinya, K. Ewert, A. Ahmad, H. M. Evans, U. Raviv, D. J. Needleman, A. J. Lin, N. L. Slack, C. George, C. E. Samuel, Cationic liposome DNA complexes: from liquid crystal science to gene delivery applications, Philosophical Transactions of the Royal Society,

C. Madeira, L. Loura, M. R. Aires-Barros, M. Prieto, Fluorescence methods for lipoplex characterization, Biochimica et Biophysica Acta 1808 (2011) 2694

E. Suleymanoglu, The Use of IR Spectroscopy after Rehydration to Follow Ternary Lipoplex Formation and Design as a Metal-Based DNA Nanopharmaceuticals, Sec. Biol. Med. Sci, 1, pp: 61 - 80, 2009

Y. Sun, I. Migueliz, G. Navarro, C. Tros de Ilarduya, Structural and Morphological Studies of Cationic Liposomes-DNA Complexes, Letters in Drug Design & Discovery, 2009, 6, 33-37

[31] L. Ciani, A. Casini, C. Gabbiani, S. Ristori, L. Messori, G. Martini, DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE Lipoplexes for Gene Delivery studied by Circular Dichroism and Other Biophysical Techniques, Biophysical Chemistry, 2007;127(3):213-20

[32] V. Oberle, U. Bakowsky, D. Hoekstra, Lipoplex Assembly Visualized by AtomicForceMicroscopy, Methods in Enzymology, Volume 373, 2003, Pages 281-297

B. Wang, J. Zhou, S. Cui, B. Yang, Y. Zhao, B. Zhao, Y. Duan, S. Zhang, Cationic liposomes as carriers for gene delivery: Physico-chemical characterization and mechanism of cell transfection, African Journal of Biotechnology Vol. 11(11), pp. 2763-2773, 2012

[34] P. A. Monnard, T. Oberholzer, P. L. Luisi, Entrapment of nucleic acids in liposomes, Biochimica et biophysica Acta 1329, pp: 39 - 50, 1997

A. Chaudhuri, Cationic Liposomes - Promising Gene Carriers in Non-viral Gene Therapy Pharmatech 2003

[36] N. Maurer, D. B. Fenske, P. R. Cullis, Developments in liposomal drug delivery systems Expert Opin. Biol. Ther. (2001)

D. A. Balazs, W. T. Godbey, Liposomes for Use in Gene Delivery, Journal of Drug Delivery, Volume 2011, 12 pages

C. H. Su, H. Yeh, C. Jia-Yin Hou, C. H. Tsai, Nonviral Technologies for Gene Therapy in Cardiovascular Research International Journal of Gerontology, June 2008, Vol 2, No 2, pp: 35-47

L. D. Mayer, M. B. Bally, M. J. Hope, P. R. Cullis, Techniques for Encapsulating Bioactive Agents into Liposomes, Chemistry and Physics of Lipids, 40

L. N. Ramana, S. Sethuraman, U. Ranga, U. M Krishnan, Development of a liposomal nanodelivery system for nevirapine, Journal of Biomedical Science 17, 57 (2010)

[41] U. D. Shivhare, D. U. Ambulkar, V. B. Mathur, K. P. Bhusari, M. D. Godbole, Formulation and Evaluation of Pentoxifylline Liposome Formulation, Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures 4, 4 (2009), p. 631 - 637

[42] G. S. Cetkovic, J. M. Canadanovic-Brunet, S. M. Djilas, V. T. Tumbas, S. L. Markov, D. D. Cvetkovic Antioxidant Potential, Lipid Peroxidation Inhibition and Antimicrobial Activities of Satureja montana L. subsp. kitaibelii, Extracts International Journal of Molecular Sciences, 2007, 8, 1013-1027

[43] B. Halliwell, S. Chirico, Lipid peroxidation: its mechanism, measurement and significance, Am L Clin Nutr, 57, 1993, pp: 715S - 725S

R. M. Adibhatla, J. F. Hatcher, Lipid Oxidation and Peroxidation in CNS Health and Disease: From Molecular Mechanisms to Therapeutic Opportunities, Antioxidants & Redox Signaling,Volume 12, Number 1, 2010

[45] E. Goncxalves, R. J. Debs, T. D. Heath, The Effect of Liposome Size on the Final Lipid/DNA Ratio of Cationic Lipoplexes Biophysical Journal Volume 86 March 2004 1554-1563