IZOLAREA SI IDENTIFICAREA SPECIEI BACILLUS ANTHRACIS

PROCEDURA SPECIFICA

IZOLAREA SI IDENTIFICAREA SPECIEI BACILLUS ANTHRACIS

CAP. 1. SCOP. DOMENIU DE APLICARE

SCOP

Prezenta procedura se utilizeaza in diagnosticul antraxului la animale si pentru evidentierea speciei Bacillus anthracis in produse de origine animala, ape reziduale si probe de sol contaminate

DOMENIU DE APLICARE

Procedura se aplica in cadrul Compartimentului de Sanatate Animala pentru diferite categorii de probe de materiale patologice, receptionate si procesate in cadrul sectiei de Bacteriologie a LSVSA Cluj.

CAP. 2. DOCUMENTE DE REFERINTA SI CONEXE

DOCUMENTE DE REFERINTA

***- Catalog National al metodelor omologate de diagnostic paraclicnic veterinar, Metoda de izolare si identificare a speciei Bacillus anthracis (cod metoda 1.25)

Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2004, Part 2, Section 2.2, Chapter 2.2.1.

PG-L-01: Controlul documentelor

PG-L-02: Analiza cererilor de oferta, ofertei si contractelor

PG-L-07: Controlul inregistrarilor

PG-L-10: Controlul echipamentelor de analiza

PG-L-11:Managementul probelor:

PG-L14: Localuri, conditii de mediu si protectia personalului

PG-L-15: Executia analizelor si asigurarea calitatii rezultatelor analizelor:

PG-L-16: Controlul datelor

DOCUMENTE CONEXE

IL-LBT-01-Instructiune de lucru Termostat MIM- 37⁰C, serie LP 1222725181, nr. inv. 2235

IL-LBT-02 - Instructiune de lucru Autoclav model RAYPA AES - 75, seria : 17084,nr. Inv. 2260

IL-LBT-04 - Instructiune de lucru Etuva Veb Mlw Medizinische HS 200, serie 15-191, nr. inv. 3142

IL-LBT-05 - Instructiune de lucru Microscop tip Olympus model CHS, seria 4A0274, nr. inv. 3017

IL-LBT-06- Instructiune de lucru Hota cu flux laminar Optofina, Bucuresti, nr. Inv. 2183

CAP. 3. DEFINITII SI ABREVIERI

DEFINITII

Antraxul este, in primul rand, o boala a animalelor ierbivore, cu toate ca, toate mamiferele, incluzand omul si cel putin anumite speii de pasari pot fi afectate.

Agentul etiologic este Bacillus anthracis, bacterie sporogena, Gram-pozitiva, de forma bacilara, singura bacterie obligatoriu patogena din cadrul genului Bacillus.

ABREVIERI

MC MANUALUL CALITATII;

PG - PROCEDURA GENERALA DE SISTEM;

PO - PROCEDURA OPERATIONALA;

PS - PROCEDURA SPECIFICA DE INCERCARE ;

IL - INSTRUCTIUNI DE LUCRU ;

SC - SISTEMUL CALITATII ;

AC - ASIGURAREA CALITATII;

HG - HOTARARE GUVERNAMENTALA;

AI - AUDITUL INTERN ;

LBT - LABORATOR BACTERIOLOGIE;

BA - BULETIN DE ANALIZE ;

RAC - RESPONSABIL ASIGURAREA CALITATII;

EIMI - ECHIPAMENTE INCERCARE ;

DC - DOCUMENTELE CALITATII

RTL - RESPONSABILUL TEHNIC DE LABORATOR

CAP. 4. DESCRIEREA ACTIVITATII PROCEDURATE

CONDITII PREALABILE

Modul de analiza, acceptare si inregistrare a cererilor de incercare (analiza) este conform MC si PG-L-02

Receptia, verificarea, circuitul, inscriptionarea si esantionarea probelor de analizat se face conform MC si PG-L-11.

Protectia personalului

Este obligatorie purtarea halatului alb (din bumbac) de protectie si a bonetei.

Deoarece suspensiile obtinute din probele ce urmeaza a fi analizate analizate, culturile si subculturile realizate in diferite etape ale procesului analitic, cat si culturile microbiene martor folosite sunt potential contaminante, manipularea acestora se va face cu maxima precautie.

Pentru a se evita ingerarea materialului potential patogen, pipetele folosite in procesul analitic se vor asigura cu dop de vata. Dupa utilizare, pipetele se vor depune in recipiente din sticla cu solutie dezinfectanta.

Protectia mijloacelor de incercare si/sau masurare

Toata sticlaria care se foloseste in aceasta determinare se pastreaza numai sterilizata, in dulapuri sau sertare speciale, pentru a evita prafuirea, contaminarea sau deteriorarea ambalajului in care au fost sterilizate.

Balantele cu care se efectueaza cantaririle se instaleaza pe suprafete plane, fara trepidatii, in mediu lipsit de praf si schimbari bruste de temperatura.

Termostatele pentru incubarea mediilor insamantate se urmaresc zilnic si se inregistreaza in caiete speciale.

Verificarea starii de functionare si confirmare metrologica a mijloacelor de masurare si/sau incercare

Balantele, in perioada de valabilitate a verificarii metrologice/ etalonarii, se verifica periodic conform instructiunilor prevazute in Manualul Calitatii, conform PG-L-10.

In cazul termostatelor, in perioada de valabilitate a verificarii metrologice, inregistrarea temperaturii se face de doua ori/zi in fisele de monitorizare a temperaturii FG-L-14-11.

Se verifica starea tehnica a sticlariei care se va folosi la determinare.

Nu se vor utiliza mijloace de masurare a caror perioada de valabilitate metrologica este depasita, care nu functioneaza la parametrii corespunzatori sau care nu se incadreaza in clasa de precizie impusa de standardul de lucru.

Lampa bacteriologica-UV se verifica pentru eficienta sterilizarii prin teste de sanitatie de pe suprafetele asupra carora a actionat.

RESURSE NECESARE

ECHIPAMENTE DE INCERCARE SI MIJLOACE DE MASURARE

Termostat la 37^oC tip MIM, serie LP 1222725181, nr. inv. 2235- IL-LBT-01

Autoclav RAYPA AES - 75, seria 17084, nr. inv. 2260 -IL-LBT

Etuva tip Veb Mlw Medizinische HS 200, serie 15-191, nr. inv. 3142- IL-LBT

Microscop tip Olympus model CHS, seria 4A0274, nr. inv. 3017- IL-LBT-05

Hota cu flux laminar tip Optofina, Bucuresti, nr. Inv. 2183 - IL-LBT

MATERIALE SI STICLARIE DE LABORATOR

eprubete sterile cu diametre diferite (16/160 mm);

baloane Erlenmeyer de 200 ml;

placi Petri sterile, cu diametrul de 90 mm;

pipete Pasteur sterile;

lame microscop;

anse bacteriologice cu bucla cu diametru de aprox. 3 mm, din nichel-crom si/sau ace de insamantare si baghete sterile;

lame microscopice;

stative pentru eprubete;

pense/spatule;

recipiente de sticla cu solutie decontaminanta pentru depozitarea pipetelor Pasteur dupa utilizare;

bisturiu;

bec Bunsen;

manusi chirurgicale;

masca de protectie;

stativ pentru tuburi;

MEDII DE CULTURA SI REACTIVI

Agar nutritiv- preparat conform Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Bulion nutritiv- Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Agar semisolid- Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Agar nutritiv suplimentat cu 5% sange defibrinat de oaie - preparat conform Anexei B7 din SR ISO 11 290 1/2000 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Sange defibrinat de oaie;

Microcomprimate penicilina (10UI);

Solutie fiziologica;

Apa distilata;

Solutie violet de gentiana;

Solutie Lugol;

Solutie fuxina 1/10;

Solutie alcool-acetona 3/1;

Solutie verde de malachit 2%;

Solutie Giemsa;

Solutie albastru de metilen policrom;

EXECUTIA ANALIZEI, ACTIVITATII

Pregatirea probelor se realizeaza de catre personalul executant de incercare sub supravegherea responsabilului de incercare.

Pentru determinare se folosesc mijloace de masurare si/sau incercare prevazute la

Izolarea si identificarea speciei Bacillus anthracis urmareste etapele si indeplinirea caracteristicilor descrise in cele ce urmeaza:

EXAMEN BACTERIOSCOPIC DIRECT :

Frotiurile efectuate din materialele patologice se coloreaza prin metoda Gram, metode de colorare a capsulei Giemsa sau cu albastru de metilen policrom si metoda de colorare a sporului cu verde de malachit.

Responsabil: specialist pentru efectuarea frotiuri si asistent veterinar pentru colorare

Punct critic:

efectuarea frotiurilor din materialele patologice reprezinta punct critic; in cazul unui preparat gors, pe parcursul etapelor de colorare, se poate desprinde materialul etalat pe lama; un frotiu gros ingreuneaza observarea bacteriilor; intr-un frotiu prea subtire bacilii pot fi rari, prelungind timpul de examinare.

Calitatea frotiurilor este dependenta de modul de executie, de calitatea solutiilor utilizate si de respectarea timpilor de colorare.

Examinarea frotiurilor colorate se face utilizand microscopul optic si urmareste prezenta bacililor mari, cu capete "retezate", dispusi izolati sau in lanturi scurte. In frotiurile colorate prin metoda Giemsa, capsula se coloreaza roz, iar corpii bacterieni in violet inchis. Metoda de colorare Gram evidentiaza doar bacili Gram pozitivi, nu si capsula.

Daca materialele patologice au venit in contact cu aerul, in frotiuri pot fi observati si bacili sporulati cu spor oval, pozitionat central, nedeformant sau spori liberi. Sporii apar sub forma unor vacuole in interiorul corpului bacterian. Se pot evidentia atat prin metoda Gram si Giemsa dar mai ales prin metoda speciala de colorare a sporului, cu verde de malachit.

In frotiurile din materialele patologice provenite din cadavre nedeschise si care au suferit procese de descompunere, bacilii sunt lizati partial ori in totalitate, putand fi observate numai capsule goale, intregi sau fragmentate.

Responsabil: specialist

Punct critic:

Interpretarea examenului bacterioscopic este dependenta de experienta specialistului.

IZOLAREA BACILLUS ANTHRACIS:

Insamantarile din probe de sange, secretii si excretii sangvinolente, lichide de punctie, exsudate, splina, os lung, tesuturi edematiate cu limfonoduri, fragmente intestin si limfonoduri mezenterice, limfonoduri glosofaringiene- se realizeaza in bulion nutritiv, pe agar nutritiv si agar nutritiv suplimentat cu 5 % sange defibrinat de oaie.

In cazul probelor intens contaminate (probe de sol, materiale patologice in stadiu avansat de descompunere) cu bacterii saprofite, care pot masca prezenta B. anthracis se procedeaza astfel : materialul patologic se omogenizeaza in proportie de cca. 1 :2 in apa distilata si se trateaza termic timp de 15 minute, in baie de apa la 62 +/- 0.5 C pentru distrugerea germenilor nesporulati. Din acest amestec se fac dilutii zecimale pana la 10³. Din fiecare dilutie cat si din amestecul initial se fac dispersii pe agar nutritiv sau pe agar suplimentat cu sange. Distrugerea florei de asociatie se poate realiza si prin maestecul suspensiilor mentionate cu un volum egal de etanol absolut, timp de 60 minute.

In cazul pieilor proaspete sau uscate, insamantarile se efecetueaza din tesutul conjunctiv subcutanat bogat in vase de sange, raclat cu lama unui bisturiu. Se recurge la insamantari directe sau la tratarea suspensiei prin procedeele amintite mai sus de inactivare a bacteriilor contaminate.

Mediile de cultura insamantate se incubeaza peste noapte in termostat, la temperatura de 37 +/- 2⁰C, in conditii de aerobioza.

Responsabil : specialist.

Identificarea BACILLUS ANTHRACIS:

Examenul caracterelor culturale :

In bulion nutritiv : mediu limpede sau cu o turbiditate discreta ; este prezent un depozit cu aspect asemanator flocoanelor de vata. La agitare, flocoanele se dezintegreaza numai partial.

Pe agarul nutritiv : colonii medii, neuniforme, cu suprafata rugoasa (aspect de sticla pisata sau asemanator florilor de gheata), opace, cu nuante de alb-cenusiu, de consistenta untoasa, cu margini neregulate datorita unor expansiuni ondulate care pornesc din colonie ( aspect de « cap de medeuza ») ; deseori marginile prezinta o expansiune laterala numita cornison.

Pe agar nutritiv suplimentat cu sange de oaie : colonii cu morfologie asemanatoare cu cele de pe suprafata agarului nutritiv, nehemolitice. In cazul unor tulpini, dupa prelungirea incubatiei, se poate observa in jurul coloniilor o redusa zona de hemoliza partiala.

Din coloniile izolate de pe mediile gelozate se fac insamantari in sange defibrinat de oaie pentru studiul capsulogenezei si in agar semisolid pentru evidentierea dezvoltarii optime in conditii de aerobioza si a imobilitatii B. anthracis. 

In agarul semisolid insamantat prin intepare, B. anthracis se dezvolta de-a lungul liniei de insamantare, cultura fiind mai dezvoltata spre suprafata mediului si mai redusa in profunzime, asemanatoare cu un brad rasturnat.

examenul microscopic (morfotinctorial):

Din culturile in mediu lichid si solid se efectueaza frotiuri, care se coloreaza prin metoda Gram.

In frotiurile din mediu lichid, B. anthracis se prezinta sub forma de bacili relativ mari, cu capete drepte, Gram pozitivi, drepti, grupati in lanturi lungi, paralele si frecvent filamente(grupare evidenta in frotiurile efectuate din bulion nutritiv), nesporulati.

In frotiurile din colonii predomina gramezile constituite din lanturi de bacili cu un grad variabil de sporulare in raport de vechimea culturilor.

Frotiurile din culturile in sange de oaie defibrinat se realizeaza la 4-5 ore de la insamantare si se coloreaza prin metoda Giemsa sau metoda MFadyean cu albastru de metilen policrom pentru evidentierea capsulei de culoare roz, care inconjoara bacilii colorati in albastru inchis.

Pentru evidentierea sporilor, frotiurile se coloreaza prin metoda de colorare a sporului cu verde de malachit. Sporul oval, de culoare verde pal, nedeformant si amplasat central poate fi prezent in frotiuri in functie de vechimea culturilor, gradul de arerare a lor si de temperatura de incubatie ( cea optima fiind de 30- 37 C)

Responsabil : specialist.

testarea sensibilitatii la penicilina

Se determina astfel :

pe suprafata agarului cu sange, insamantat cu o suspensie in solutie fiziologic din cultura suspecta, se amplaseaza un microcomprimat cu 10 UI penicilina ;

se termostateaza placa la 37 +/-2 C ;

dupa 18-24 ore, in jurul microcomprimatului cu penicilina se constata o intensa zona de inhibitie a cresterii in cazul in care cultura testata este B. anthracis , ceea ce nu se observa in cazul altor specii sporulate aerobe.

Nota : foarte rar se izoleaza tulpini de B. anthracis penicilino-rezistente !

masuri specifice de biosecuritate:

Sunt reguli specifice de biosecuritate prevazute in Manualul de Biosecuritate al; LSVS Cluj, antraxul incadrandu-se in gradul 3 de risc biologic.

Utilizarea obligatorie a echipamentului de protectie: manusi, halat, masca faciala si ochelari de protectie - atunci cand se manipuleaza probele, se efectueaza insamantari, examenul cultural, subcultivari, inocularea animalelor de experienta.

Lucrarile cu culturi se vor face cu precautii pentru a evita aerosolizarea si sporirea riscului diseminarii sporilor. Dupa folosire, pipetele Pasteur vor fi introduse in recipienti cu solutii decontaminante.

Probele de material patologic, culturile, cadavrele animalelor folosite pentru bioproba, intrsumentarul utiliza, se inactiveaza prin autoclavare. Din materialele autoclavate se fac insamantari pentru verificarea eficientei sterilizarii.

Cutiile in care se tin soarecii se tin sub supraveghere, asternutul din cutii si orice alt material utilizate in cadrul lucrarilor se autoclaveaza si se incinereaza.

Spatiile de lucru sunt prevazute cu avertizoare de tipul pictogramelor cu privire la riscul biologic si interzicerea accesului persoanelor neautorizate.

surse potentiale de incertitudine:

A. Probe:

Recoltare;

Ambalare;

Transport;

Manipulare;

Esantionare;

Individualizare;

Omogenitate;

Stabilitate;

B. Personal:

Abilitati personale;

Instruire/experienta;

C. Echipament:

Utilizare;

Calibrare;

Mentenanta;

Service asigurat;

D. Metoda:

Mod de descriere;

Materiale documentare de referinta;

Existenta controlului in punctele critice;

E. Materiale utilizate:

Medii de cultura;

Solutii pentru colorare;

Consumabile;

Sticlarie;

F. Conditii de mediu:

Temperatura;

Conditii de sterilitate.

CAP. 5. ACTIVITATI FINALE

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Cand pe baza rezultatelor examenelor bacterioscopic, culturale, a caracteristicilor fiziologice si de patogenitate se confirma prezenta B. anthracis, in buletinul de analiza, in sectiunea "Rezultat" se scrie: " Examen bacteriologic pentru Bacillus anthracis: pozitiv:.

CAP. 6. RESPONSABILITATI

Limite de autoritate

Pentru executarea in bune conditii a prezentei proceduri limitele de autoritate sunt:

Responsbalitati

Director Executiv

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura.

Sef de Laborator

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura si coraboreaza datele prezentate in buletinul de analiza.

Sef Birou Sanatate Animala

aproba cererea de analiza si primirea probei pentru incercare,

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura si coraboreaza datele prezentate in buletinul de analiza,

verifica prin sondaj, rezultatele incercarilor

Responsabilul de incercare

supervizeaza executia incercarii;

raspunde de corectitudinea executiei;

elaboreaza opinii si interpretari asupra rezultatelor inscrise in buletinul de analiza, prin compararea cu reglementari si normative in vigoare,

redacteaza buletinele de analiza, cu observatiile si concluziile aferente;

valideaza executia incercarii;

confirma rezultatul prin semnatura.

verifica nutritivitatea si selectivitatea mediilor de cultura;

gestioneaza tulpinile de referinta

Executantii de analiza

inregistreaza proba in registrul de analiza;

completeaza fisele analitice ale probelor si toate inregistrarile calitatii referitoare la incercarea din prezenta procedura specifica

inregistreaza in fisele de temperaturi ale aparatelor valorile citite

executa sub supravegherea specialistilor operatiile de pregatire a probelor;

executa incercarea conform regulilor din procedura specifica;

verifica functionarea mijloacelor de masurare si/sau incercare;

pregatesc si aseptizeaza spatiile si suprafetele de lucru;

conditioneaza si verifica starea sticlariei utilizata in incercare;

tehnoredacteaza buletinul de analiza

comunica responsabilului de incercare orice problema aparuta in timpul operatiilor efectuate;

CAP. 7. INREGISTRARI

Registru unic primire probe diagnostic cod R-L-11-1

Registru de diagnostic Necropsic si Bacteriologic cod R-L-11-55

buletin de analiza FG-L-13-01

fisa de diagnostic bacteriologic FL-LBT-01

fisa de monitorizare a temperaturii FG-L-14-11

fisa pentru evidenta tulpinilor de referinta FL-LBT-54

fisa de evidenta a materialelor sterilizate la etuva FL-LBT-56

fisa de solicitare medii de cultura Fl-LBT-57

fisa preparare si aprovizionare cu solutii FL-LBT-58

fisa pentru evidenta control sterilitate si valoare nutritiva a mediilor de cultura FL-LBT-59

fisa pentru evidenta autoclavarii infectelor FL-LBT-60

fisa interna de gestionare a deseurilor din laboratoare FO-L-08-09