B-SCREEN
UTILIZARE
Test ELISA calitativ in faza solida pentru detectia anticorpilor IgG directionati catre antigenele HLA clasa II.
Numai pentru diagnostic in vitro.
REZUMAT SI EXPLICATIA TESTULUI
HLA este un sistem antigenic major implicat in determinarea supravietuirii alotransplantelor sau plachetelor transfuzate la indivizii sensibili.1 Anticorpii HLA pot fi dobanditi prin aloimunizare ca rezultat al sarcinii, transfuziei de derivate din sange, sau transplantelor anterioare. In general aloimunizarea conduce la producerea de anticorpi in cazul a 33% din indivizii expusi.2
Testul B-SCREEN ELISA in faza solida contine glicoproteine HLA din clasa II purificate pe afinitatii derivate din linii de limfocite B transformate cu EBV. Limfocitele sunt cu grija alese pentru a furniza o paleta larga de antigene HLA clasa II.
PRINCIPIUL PROCEDURII
Serul pacientului este adaugat in godeurile captusite cu glicoproteine HLA clasa II, permitand anticorpilor sa se lege (daca sunt prezenti). Anticorpii nelegati sunt apoi indepartati prin spalare. Se adauga in godeuri un reactiv ce contine anticorpi anti-IgG uman marcat cu fosfataza alcalina si se incubeaza . Anticorpii Anti-IgG nelegati sunt apoi spalati si se adauga substratul PNPP (p-nitrofenil fosfat). Dupa 30 de minute de incubare reactia este stopata adaugand solutie de hidroxid de sodiu. Densitatea optica a culorii dezvoltate este masurata cu un spectrofotometru.
REACTIVI
Numarul maxim de teste per kit: 44
Reactivii trebuie pastrati in conditiile indicate pe eticheta.
MS 1. Microgodeuri: stripuri cu microgodeuri cu fund plat, in care au fost imobilizate glicoproteinele HLA clasa II purificate prin afinitate. Stripurile cu godeuri sunt introduse in ambalaje din folie care pot fi resigilate . Sunt gata de utilizare.
TCW 2. Solutie de spalare concentrata (10x): solutie tamponata de tris (hidroximetil) aminometan care contine clorura de sodiu si Tween 20, 1% azida de sodiu. Inainte de utilizare diluati solutia de spalare cu apa distilata sau deionizata. Pastrati solutia de spalare pana la 48 de ore la temperatura camerei sau pana la 7 zile la 2 - 8 oC.
SD 3. Diluent pentru proba: tampon fosfat salin continand albumina bovina si ser de soarece, 0.1% azida de sodiu. Gata de utilizare
SB 4. Tampon substrat: solutia contine dietanolamina si clorura de magneziu, 0.02% azida de sodiu. Gata de utilizare.
SS 5. Solutie de stopare: solutie 3M de hidroxid de sodiu. Gata de utilizare. Manipulati cu grija.
AG 6. Conjugat: anticorpi de capra purificati prin afinitate anti-IgG uman conjugati cu fosfataza alcalina. 0.1% azida de sodiu. Se dilueaza in diluentul pentru proba inainte de folosire.
PN 7. Substrat PNPP (p-nitrofenil fosfat): pudra cristalina. Se reconstituie cu apa distilata sau demineralizata si se dilueaza in tamponul substrat inainte de utilizare. Protejeti impotriva luminii.
PC 8. Ser martor pozitiv: ser uman, 0.1 % azida de sodiu. Se dilueaza in diluentul pentru proba inainte de utilizare.
NC 9. Ser martor negativ: ser uman. 0.1 % azida de sodiu. Se dilueaza in diluentul pentru proba inainte de utilizare.
PS 10. Sigilii pentru placi.
PRECAUTII
ATENTIE
ATENTIE! Azida de sodiu reactioneaza cu plumbul si cuprul formand azide metalice explozive. Daca aruncati reactivii in chiuveta trebuie sa turnati o cantitate mare de apa pentru a evita formarea azidelor. Azida de sodiu este toxica daca este ingerata.
RECOLTAREA PROBELOR
Probele vor fi colectate fara anticoagulant printr-o metoda aseptica si vor fi testate cat sunt inca proaspete pentru a minimiza sansa de a obtine reactii fals pozitive sau fals negative datorita pastrarii necorespunzatoare sau contaminarii specimenului.
Probele ce nu pot fi testate imediat vor fi depozitate la 2-8 0C nu mai mult de 48 de ore sau inghetate. Probele inghetate la - 20 0C sau mai jos raman stabile 2-3 ani. Cu toate acestea evitati inghetarea/dezghetarea repetata, fiind recomandat ca probele sa fie inghetate in volume mici si apoi depozitate inghetate. Evitati congelatoarele frost free.
Serurile sau plasma trebuiesc separate de hematii cand sunt stocate sau trimise catre alt laborator.
Particulele sau agregatele din probe pot cauza reactii fals positive sau valori discordante intre duplicate. Probele ce contin particule trebuiesc clarificate prin centrifugare inaintea testarii.
Numai serul uman integral este potrivit pentru acest test. Dilutiile anterioare ale probelor in orice altceva decat ser uman negativ pot afecta rezultatele.
Serurile contaminate microbian, hemolizate, lipemice, icterice sau inactivate prin caldura pot da rezultate incorecte si vor fi evitate.
PROCEDURA
Materiale furnizate
Flacoanele contin mai mult reactive decat este indicat pe eticheta. Cand realizati dilutiile masurati reactivul cu un dispozitiv potrivit.
Materiale necesare nefurnizate:
Modul de lucru:
1. Aduceti reactivii la temperatura camerei
2. Preparati solutia de spalare: 1 volum de concentrat cu 9 volume apa distilata sau deionizata. Agitati bine.
3. Determinati numarul pacientilor de testat. Utilizand fisa de raportare, desemnati pentru fiecare proba cate doua godeuri. Inregistrati fiecare proba pe fisa. (daca este testata numai o proba folositi dosul foii).
PREPARATI PROBELE SI MARTORII:
4. Diluati ca in tabelul de mai jos si agitati bine:
Volumul de diluent proba |
Volumul de proba |
|
PC |
75 µl |
75 µl |
NC 1 proba Probe multiple |
75 µl 110 µl |
75 µl 110 µl |
Proba pacient |
100µl |
100 µl |
5. Scoateti microplacuta cu godeuri sau rama din punga. Resigilati stripurile nefolosite in punga protectoare.
Observatie: In kit este furnizata numai o rama. Nu o aruncati pana cand nu sunt utilizate toate stripurile.
Stripurile, cand sunt asezate pe rama, trebuie sa aiba partea colorata in partea de sus a ramei.
6. Adaugati 300 µl solutie de spalare in toate godeurile si lasati sa stea la temperatura camerei 5-10 minute.
7. Aspirati cu forta si intoarceti placuta pe hartie absorbanta, pentru a preveni uscarea.
8. Adaugati 50 µl din martori diluati sau probe (ser al pacientului) in godeurile stabilite in fisa de raportare.
NOTA: Nu adaugati proba sau reactiv in godeurile blank.
NOTA: Daca sunt testate in acelasi timp probe multiple de pacienti este necesar numai un set de martori. NOTATI FIECARE STRIP PENTRU A EVITA ERORILE.
9. Sigilati godeurile cu folie si incubati 30-35 minute in baie de apa la 37 0C. Daca se utilizeaza un incubator uscat, se va creste timpul cu 10 minute (resp: 40-45 min).
10. Diluati conjugatul 1:100 in diluentul probei. Utilizati un recipient de polipropilena.
Stripuri: |
2x8 |
12x8 |
AG |
10 µl |
60 µl |
SD |
1 ml |
6 ml |
NOTA: Conjugatul este vascos. Clatiti varful de 2-3 ori in conjugat inainte de dispersare si clatiti dupa adaugare la diluentul probei. Agitati bine.
11. SPALAREA se face de 3-4 ori cu solutie de spalare (cate 300 µl de solutie de spalare per godeu).
NOTA: este important sa indepartam complet solutia de spalare dupa pasul final .
12. Se adauga 50 µl conjugat diluat in toate godeurile, cu exceptia celor desemnate pentru blank.
13. Sigilati godeurile si incubati 30-35 minute la 37 0C. Daca se utilizeaza un incubator uscat, se va creste timpul cu 10 min (resp: 40-45 min).
14. Dizolvati substratul PNPP adaugand 0.5 ml apa distilata sau deionizata in fiola. Puneti capacul si agitati bine. Protejati de lumina pana la utilizare.
15. Diluati PNPP 1:100 in tampon substrat.
Stripuri: |
2x8 |
12x8 |
PN |
20 µl |
120 µl |
SB |
2 ml |
12 ml |
Agitati bine. Protejati de lumina pana la utilizare.
16. ETAPA DE SPALARE: spalati de 3-4 x cu 300 µl solutie de spalare per godeu.
17. Adaugati 100 µl in solutia diluata PNPP in toate godeurile, mai putin in blank.
18. Incubati la temperatura camerei la intuneric 30 minute (22-25 0C).
NOTA: Timpul si temperatura de incubare dupa adaugarea PNPP sunt critice. Nu modificati timpul stabilit de incubare si nici temperatura. Incepeti cronometrarea din momentul adaugarii reactivului in primul godeu.
19. Stopati reactia adaugand 100 µl solutie de stopare in fiecare godeu in aceeasi ordine ca adaugarea substratului. Adaugati 200 µl solutie stopare in godeurile blank.
20. Cititi absorbanta godeurilor la 405-410 nm utilizand ca filtru de referinta 490 nm.
Daca rezultatele nu pot fi citite imediat, tineti godeurile la intuneric maxim 30 minute.
21. Scadeti valorile obtinute pentru godeurile blank din toate valorile pentru godeurile cu probe si martori. Multe cititoare ELISA sunt programate sa realizeze acest pas automat.
22. Inregistrati rezultatele pe fisa de raportare.
CONTROLUL DE CALITATE
Controlul de calitate al kit-ului B-SCREEN este inclus in sistem prin serurile martor pozitiv si negativ. Acesti martori trebuie utilizati la fiecare testare pentru a determina eventualele erori tehnice sau cele datorate reactivilor.
Criterii de validare:
Negativ Control |
Pozitiv Control |
|
Media OD |
Diferentele de citire intre OD pentru duplicatele rezultatelor test nu vor fi mai mari de 20%. Probele ale caror rezultate sunt in afara acestor limite trebuie retestate.
NOTA: Duplicatele slabe pot fi rezultatul omiterii reactivului sau probei, adaugarii neregulate a reactivilor, temperaturii neregulate de incubare, luminii in etapa finala de incubare sau contaminarii incrucisate a godeurilor. Esuarea testului in duplicat poate duce la acceptarea rezultatelor eronate.
INTERPRETAREA REZULTATELOR
Rezultatele cu OD mai mari sau egale de 2x media martorilor negativi, sunt pozitive.
LIMITE
Se pot obtine rezultate eronate in situatia contaminarii bacteriene a materialelor folosite in test, a perioadelor inadecvate de incubare, spalare inadecvata, in cazul expunerii substratului in lumina directa, omiterea unor reactivi, expunerea la temperaturi mai ridicate sau mai scazute decat cele specificate in procedura, sarirea pasilor.
Prezenta unor complexe immune sau a altor imunoglobiline in proba pacientului pot conduce la obtinerea unor rezultate fals pozitive.
Rezultatele acestui test nu trebuie folosite ca singura baza pentru decizia clinica.
Anticorpii HLA non-limfocitotoxici nu pot fi detectati prin aceasta metoda.
Unii anticorpi HLA non-citotoxici pot fi detectati prin aceasta metoda darn u reactioneaza in testul de limfocitotoxicitate (LCA).
Unii anticorpi cu titru scazut, cu afinitate scazuta pot sa nu fie detectati cu acest test.
Acest kit nu detecteaza IgM, IgA sau anticorpii HLA clasa I.
Glicoproteinele HLA clasa II purificate prin afinitate utilizate la fabricarea acestui test sunt derivate din limfocite B transformate cu EBV si reprezinta urmatoarele clase de antigene HLA clasa II: DR1, DR4, DR7, DR8, DR9, DR10, DR11, DR12, DR13, DR14, DR15, DR16, DR17, DR18, DR103, DR51, DR52 si DR53.
PERFORMANTE CARACTERISTICE SPECIFICE
Daca este pastrat si utilizat conform indicatiilor acest produs poate detecta anticorpii IgG anti-antigenele HLA clasa II.
Pentru asigurarea reactivitatii si specificitatii potrivite, fiecare lot de B-SCREEN inainte de comercializare, pe probe cunoscute ca avand aloanticorpi reactivi cu antigenele HLA din clasa II ca si pe probe cunoscute ca libere de astfel de anticorpi.
Evaluarea performantei
Metoda de comparatie |
|||
Pozitiv |
Negativ |
||
B-screen |
Pozitiv | ||
Negativ |
Acord: 97.6%
Co-pozitivitate: 97.2%
Co-negativitate: 97.8%
Metoda de comparatie: citometrie de flux cu perle
Marimea probei: 207
Politica de confidentialitate |
.com | Copyright ©
2024 - Toate drepturile rezervate. Toate documentele au caracter informativ cu scop educational. |
Personaje din literatura |
Baltagul – caracterizarea personajelor |
Caracterizare Alexandru Lapusneanul |
Caracterizarea lui Gavilescu |
Caracterizarea personajelor negative din basmul |
Tehnica si mecanica |
Cuplaje - definitii. notatii. exemple. repere istorice. |
Actionare macara |
Reprezentarea si cotarea filetelor |
Geografie |
Turismul pe terra |
Vulcanii Și mediul |
Padurile pe terra si industrializarea lemnului |
Termeni si conditii |
Contact |
Creeaza si tu |