Masurarea dimensiunilor celulare cu ajutorul microscopului cu micrometru

Masurarea dimensiunilor celulare cu ajutorul

microscopului cu micrometru obiectiv si ocular

In dezvoltarea tehnicii microscopice s-au construit: microscopul monocular si binocular, la care s-au adaptat dispozitive de ultramicroscopie, de polarizare etc si s-au realizat in ultimile decenii microscopul ultrasonic si microscopul electronic.

In mod curent, analiza microscopica se realizeaza cu microscopul monocular si binocular, iar masuratorile se executa cu micrometrele obiective si oculare.

Principiul metodei consta in compararea dimensiunilor obiectului de masurat cu diviziunile scarii gradate a micrometrului ocular. Microscopul monocular si binocular (fig. 6.14) sunt formate din trei parti principale: partea mecanica, partea optica si dispozitivul de iluminare al preparatului microscopic.

Partea mecanica se compune din:

Piciorul microscopului (a), din metal, asigura prin greutatea sa, stabilitatea necesara;

Masuta (platina microscopului) de forma patrata sau rotunda (b) prezinta in mijlocul ei un orificiu pe unde patrunde lumina. Platina serveste la sustinerea preparatului care se fixeaza pe masuta cu ajutorul cavalerilor (c). Masuta se poate deplasa in plan orizontal cu ajutorul unor suruburi (k), deplasarea fiind precis cunoscuta datorita scarii gradate (fixata pe masuta) prevazuta cu vernier.

Deplasarea preparatului pe masuta se realizeaza cu ajutorul asa numitului car mobil: aceasta deplasare se determina cu ajutorul scarii gradate cu vernier a carului mobil.

Tubul microscopului (d) care sustine obiectivul (e) si ocularul (f). Tubului microscopului i se poate imprima o miscare rapida pe verticala cu ajutorul unei cremaliere actionand asupra surubului macrometric (h) si o miscare fina actionand asupra surubului micrometric gradat (i) pe circumferinta in 50 diviziuni. Miscarile pot fi facute in ambele sensuri, dar miscarea  micrometrica este limitata pe o distanta maxima de circa 4mm, peste care nu se poate trece fara pericolul de a distruge mecanismul final rotilor dintate respective.

La capatul inferior al tubului microscopic se gaseste piesa numita revolver (j) pe care se pot monta in general patru obiective, existand posibilitatea schimbarii rapide a lor prin rotirea suportului.

Partea optica se compune din obiectiv si ocular.

Obiectivul (adaptat la capatul inferior al tubului microscopic) este format dintr-un sistem de lentile (sistem optic convergent) fixat intr-o montura (fig.6.15). Lentila din fata, numita frontala, este lentila principala si singura care produce marirea; celelalte lentile servesc numai la corijarea defectelor imaginii data de lentila frontala si de aceea se numesc lentile de corectie.

Distanta de la lentila frontala la preparatul microscopic poarta numele de distanta frontala.

Deoarece obiectivul reprezinta partea principala a unui microscop i se cer anumite calitati:

sa aiba o mare putere de marire

sa aiba luminozitate, adica sa fie construit din lentile cu un unghi de deschidere mare (unghiul format de razele marginale ale obiectului si care servesc la formarea imaginii reale). Imaginea este cu atat mai clara si mai luminoasa cu cat acest unghi este mai mare;

sa aiba o putere de rzolutie (de separare mare), adica sa poata permite observarea celor mai mici detalii structurale.

Obiectivele se clasifica dupa mai multe criterii:

dupa puterea de marire, sunt obiective slabe si obiective puternice. Puterile de marire, sunt notate numeric dupa caracteristicile diveselor fabrici cu: 8, 10, 20, 40, 60, 90, 100 ,125, obiectivele 40, 60, 90, 100, 120 si 125 fiind obiective puternice.

Dupa natura mediului dintre lentila frontala si obiectul de cercetat, sunt obiective uscate si de imersie. In cazul obiectivelor uscate mediul dintre lentila frontala si obiectul de cercetat este aerul. Aerul, care are indicele de refractie n=1 este, in comparatie u lamela de sticla, care acopera preparatul microscopic si care are n=1,52, mult mai putin refrigent. De aceea razele venite de la preparatul microscopic sufera dupa ce ies din lamela care acopera preparatul, o deviatie (in urma refractiei) foarte mare (fig.6.16.). Pentru obiectivele slabe care au o distanta focala mare, aceasta deviere nu influenteaza calitatea imaginii deoarece lentila frontala fiind mai departata de preparat prinde si razele deviate lateral.

Obiectivele puternice, avand o distanta focala mica, trebuie sa fie plasate foarte aproape de preparat. In aceasta situatie, razele luminoase refractate (deviate) puternic datorita diferentei mari dintre indicii de refractie ai lamelei care acopera preparatul si aerului nu vor mai putea fi prinse de lentila frontala.

Ea va fi situata in unghiul de deviatie al razelor, iar acestea vor fi pierdute astfel de catre lentila.

Pentru a se inlatura acest neajuns se umple spatiul dintre lentila frontala a obiectivului si preparatul microscopic cun un mediu (lichid de imersie) care are indicele de refractie apropiat de indicele de refractie al lamelei care acopera preparatul. In felul acesta, asa cum se vede in fig 6.16, toate razele venite din preparat se vor indrepta spre obiectiv (obiectiv de imersie) si astfel, lentila frontala va putea fi apropiata cat mai mult de preparat. Obiectivele de imersie sunt notate cu 90, 100, 120, 125.

Ca lichid de imersie poate fi folosita chiar apa (n = 1,3330), iar obiectivele se numesc in acest caz, de imersie cu apa. In mod obisnuit, insa, lichidele de imersie sunt uleiurile, mai folosit fiind uleiul de cedru care are n = 1,515 (valoarea este foarte apropiata de indicele de refractie al lamelelor de sticla care acopera preparatul 1,52 si al sticlei lentilelor 1,54).

Alte medii de imersie sunt: glicerina pura amestecata cu apa in proportie de 2/1, parafina lichida, uleiul de ricin amestecat in parti egale cu uleiul de in etc.

Obiectivele de imersie sunt foarte mult folosite in stadiul actual al tehnicii microscopice. Microbiologia utilizeaza exclusiv acest mod de lucru.

In studiul celulelor si al tesuturilor, dupa o examinare cu obiective slabe se trece intotdeauna la observatia cu obiective puternice si de imersie.

Elementele figurate ale sangelui si parazitii sangelui se observa prin obiective de imersie.

Lichidele de imersie se pastreaza in sticle bine inchise si cu o bagheta de sticla fixata la dop.

Ocularul (adaptat la capatul superior al tubului microscopic) este o lupa compusa, formata in mod obisnuit din doua lentile departate intre ele, alcatuind, ca si obiectivul, un sistem optic convergent. Ambele lentile sunt fixate intr-un tub cilindric scuret care se introduce in orificiul superior al tubului microscopic (fig. 6.17). Intre cele doua lentile constituente, lentila ocular si lentila colectoare, exista uneori o diafragma fixa ; la alte oculare diafragma se gaseste sub lentila colectoare. Pe oculare sunt marcate numere care indica puterea lor de marire: x5, x7, x10, x20. Puterea de marire a microscopului [grosismentul microscopului (G) se obtine inmultind puterea de marire a ocularului (Goc) cu puterea de marire a obiectivului (Gob

In mod obisnuit, in observatiile curente facute la microscop se foloseste combinatia intre un obiectiv mai slab si un ocular puternic.

Cele mai puternice combinatii ale microscopului obisnuit pot sa produca mariri pana la maximum 2500 - 3000 de ori.

3. Dispozitivul de iluminare este format din oglinda (k), condensor (l), diafragma si port-filtru.

Oglinda are doua suprafete, una plana si cealalta concava si are rolul de a colecta razele luminoase de la sursa de lumina si de a le dirija prin reflexie pe directia axului optic al microscopului. Datorita unui sistem cardanic, oglinda poate fi miscata in toate sensurile dupa izvorul de lumina (un bec mat).

Oglinda poate fi inlocuita cu un izvor de lumina constituit dintr-un bec de tensiune scazuta (4 - 8 V), obtinandu-se o lumina directa si uniforma, ideala pentru observatia microscopica.

Imediat deasupra oglinzii se afla port-filtrul la care se pot adapta filtre de sticla de grosimi si culori diferite, pentru gradarea intensitatii luminoase.

Condensorul este un sistem de 2-3 lentile convergente care are rolul de a concentra sub forma unui fascicul puternic convergent lumina reflectata de oglinda (sau venita direct de la bec) asupra obiectivului de cercetat fixat pe platina microscopului. Pentru a se obtine o imagine cat mai clara, este necesar ca obiectivul sa se gaseasca in focarul fascicului convergent. Pentru aceasta condensorul se deplaseaza in sus sau in jos cu ajutorul unui surub.

Intre condensor si port-filtru este situata diafragma care permite reglarea fasciculului luminos prin inchiderea unor lame metalice circulare dupa sistemul irisului (fig. 6.18). Pentru observarea preparatelor proaspete si a detaliilor de structura este neaparat necesara inchiderea la maximum a diafragmei.

Formarea imaginii in microscop

Pentru a intelege mai usor, modul de functionare al microscopului, se considera obiectivul si ocularul drept niste lentile convergente asezate la capetele tubului metalic, care se deplaseaza fata de obiectivul cercetat de pe masuta, pana ce se obtine imaginea marita si clara. In acest moment mersul razelor de lumina se poate urmari in fig. 6.19. Obiectivul da o imagine reala, rasturnata si mult marita (A B ) a obiectivului (AB) aflat aproape de focarul obiectivului. Aceasta imagine (A B ) serveste ca obiect pentru ocular, ce functioneaza ca o lupa si da o imagine virtuala, dreapta si marita (A B ), care se observa daca se priveste prin ocular. Imaginea finala, se va forma la distanta minima de vedere distincta, intr-un plan denumit camp optic.

Prin grosismentul unui microscop (al oricarui instrument optic) se intelege, asa cum s-a mai aratat, puterea de marire a lui.

Grosismentul (G) al unui microscop arata deci, de cate ori mareste acel microscop.

Grosismentul se exprima prin raportul intre marimea imaginii si marimea obiectului.

Din fig 6.19. rezulta ca:

G = A B / AB (6.11)

Daca se amplifica fractia cu A1B1 se obtine:

G = A B / A B · A B / AB (6.12)

Conform definitiei grosismentului, raportul A B / A B reprezinta grosismentul ocularului (Goc), iar raportul A B / AB reprezinta grosismentul obiectivului (Gob

Deci:

G = Goc · Gob (6.13)

adica, grosismentul unui microscop este, asa cum s-a mai aratat, egal cu produsul dintre grosismentul ocularului si grosismentul obiectivului.

Micrometrul obiectiv (fig. 6.20) este o lama de sticla pe care sunt trasate diviziuni la distanta de 0,01 mm (100 div/mm).

Micrometrul ocular (fig 6.21) este un disc de sticla care are diametrul putin mai mic decat diametrul interior al tubului ocularului. Pe micrometru sunt trasate linii subtiri la o distanta arbitrara, formand ceea ce se numeste scara gradata a micrometrului ocular. In afara de micrometrele cu scara liniara unele micrometre prezinta un careiaj - micrometre oculare in retea.

Acestea servesc la masurarea suprafetelor obiectelor microscopice.

Tehnica de lucru

1. Determinarea valorii unei diviziuni de pe micrometrul ocular (coeficientul micrometric).

Pentru fiecare putere de marire a microscopului, deci pentru fiecare combinatie de obiective si oculare, coeficientul micrometric are o alta valoare. De aceea, de cate ori se schimba obiectivul sau ocularul unui microscop, se determina coeficientul micrometric.

Se procedeaza astfel:

se introduce in tubul ocularului, micrometrul ocular

pe platina microscopului se aseaza micrometrul obiectiv, a carui scara se cunoaste (1 div = 0,01 mm)

se introduce stekerul de la becul de iluminat al microscopului in bornele de 6 V ale transformatorului coborator de tensiune (bornele din mijloc)

se introduce stekerul transformatorului in priza de 220 V si astfel becul de iluminat se aprinde.

In cazul in care microscopul nu poseda sistem de iluminare directa, ci oglinda, atunci se potriveste pozitia oglinzii incat sa se obtina iluminarea maxima a obiectului (in cazul de fata a micrometrului obiectiv).

cu ajutorul suruburilor care misca masuta microscopului, se aduce cercul din mijlocul micrometrului, in dreptul obiectivului.

se aseaza pentru observatie cel mai mic obiectiv (10)

se coboara tubul microscopului cat mai aproape de micrometrul obiectiv (se priveste obiectivul dintr-o parte avand multa grija pentru a nu sparge micrometrul)

Privind apoi prin microscop se ridica incet tubul cu surubul macrometric, pana cand diviziunile micrometrului obiectiv se vad la fel de clar ca si cele ale micrometrului ocular. Imaginea se pune la punct cu surubul micrometric. Daca diviziunile celor doua micrometre nu sunt paralele, se roteste ocularul microscopului pana se obtine acest lucru. Se cauta doua diviziuni de pe micrometrul obiectiv. Se numara diviziunile nob de pe micrometrul obiectiv, care corespund cu diviziunile noc de pe micrometrul ocular.

Printr-o regula de trei simpla se afla valoarea unei diviziuni de pe micrometrul ocular (coeficientul micrometric).