CERCETARI PROPRII - DOZAREA LIZOZIMULUI

CERCETARI PROPRII - DOZAREA LIZOZIMULUI

SCOPUL LUCRARII

Protectia imuna reprezinta una dintre conditiile esentiale ale supravietuirii in mediul ambiant. În acest context efectorii nespecifici joaca un rol extrem de important.

Afectiunile cu care se confrunta in momentul actual specia bovina prejudiciaza procesul de productie (lapte, carne) ca si procesul de productie.

Avand in vedere rolul sistemului imun in asigurarea bunastarii organismului, am considerat necesar investigarea unui parametru care reflecta capacitatea de aparare la poarta de intrare: lizozimul.

Posibilitatile limitate de investigare a influentei diferitilor imuno-modulatori in vitro la aceasta specie ne-au dirijat cercetarile spre elaborarea, identificarea unor metode usor aplicabile reproductibile si sensibile de dozare a lizozimului si argumentarii sau diminuarii activitatii acestuia in vitro.

Pentru determinarea nivelelor lizozimului s-au utilizat supernatante ale culturilor din sange integral tratate cu extracte vegetale, urmarindu-se influenta directa a acestora asupra celulelor sintetizatoare.

Procesul de lucru se inscrie in tendinta actuala de utilizare pe scara larga a imunomodulatoarelor obtinute pe plan local.

CAPITOLUL I

METODA DIFUZIMETRICA PENTRU DOZAREA

LIZOZIMULUI DIN PROBE BIOLOGICE

Metoda este bazata pe difuzia simpla a probei de cercetat intr-un mediu solid (agar sau agaroza), care inglobeaza bacteria Micrococus lysodicticus, apreciindu-se concentratia in lizozim a probei prin masurarea diametrului de liza, dupa interpolare pe grafic.

1.1. Materiale si metoda

Mediul de difuzie este reprezentat de un agar special (Noble) in concentratie de 2% utilizand pentru preparare o solutie tampon fosfat salin cu pH-ul de 6,2 (SOKOLOV A. -1985).

Initial se prepara 2 solutii, solutia A, cu un continut de 9,078g fosfat monopotasic (KH PO) la un litru de apa distilata, si solutia B, cu 23,88g fosfat disodic, (Na HPO * 12H O) intr-un litru de apa distilata, 815 ml din solutia A se amesteca cu 185 ml din solutia B. folosind acest tampon se prepara agarul Nouble (2%). Dupa suspendarea pulberei de agar in lichidul tampon, amestecul se fierbe pana la topirea completa a particulelor de agar apoi se raceste la temperatura de 56ºC.

Concomitent se pregateste suspensia bacteriana, Micrococcus lysodeicticus cultivata pe agar nutritiv inclinat. Dupa 24 de ore de termostatare de la insamantare, cultura se spala de pe agar folosind o solutie de tampon fosfat salin cu pH-ul de 7,2. Suspensia obtinuta se centrifugheaza (10 minute la 2500 rpm), iar depozitul obtinut se spala prin centrifugare, in aceleasi conditii inlocuind solutia tampon fosfat salin de fiecare data. În final produsul celular se suspenda in acelasi tampon si se duce la densitatea optica de 2,0 (apreciata la spectofotometrul Karl Zeiss Jena Spetrol 10) in comparatie cu o suspensie martor preparata din aceeasi bacterie. Conditiile spectrofotometrarii au fost: d=450 nm, d=1cm.

6 ml din suspensia bacteriana cu densitatea optica ajustata, se omogenizeaza cu 6,0 ml agar de 56ºC iar apoi se toarna in placi Petri, aflate pe un plan orizontal. Solidificarea agarului se realizeaza la temperatura camerei 20 minute, apoi la frigider la +4ºC 10 minute. Dupa solidificarea amestecului, folosind un model si o matrita metalica cu diametrul de 3 mm, se practica godeuri in care se vor repartiza materialele biologice in cantitate de cate 50 ul. Serurile au fost diluate in proportie de ½ cu compusii testati, apoi repartizate. Pentru a se urmari activitatea serului netratat acesta a fost suplimentat in aceeasi proportie cu ser fiziologic. Apoi placile se incubeaza 20 ore la 37ºC, dupa care se citeste diametrul zonei clare (zona de liza) aparuta in jurul godeului.

1.2. Rezultate

Dupa incubare se apreciaza diametrul zonei clare (zona de liza) aparute, apreciere care se face cu ajutorul unei rigle.

S-a stabilit o corelatie intre concentratia de lizozim a serului de cercetat si diametrul zonei de liza. Cu cat diametrul zonei de liza este mai mare cu atat proba de ser a continut o cantitate mai mare de lizozim.

Valorile obtinute prin aceasta tehnica folosindu-se solutii cu concentratie cunoscuta de lizozim (pornind de l albus de ou sau lizozim pur pulbere) servesc pentru trasarea curbei etalon. Aceasta este utila pentru transformarea valorilor lizei din mm in ug/ml (concentratie reala).

1.3. Discutii

Diametrul zonei de liza masurat este o functie dependenta de concentratia lizozimului din proba.

Prin aplicarea metodei difuzimetrice se pot determina concentratii de lizozim de 1,56 ug/ml sau mai mari. Limitarea metodei este datorata intr-o oare-care masura insusi modului de lucru, godeul pentru depunerea probei avand diametrul de 3 mm.

Metoda permite sesizarea unor diferente de concentratie in lizozim intre diferite probe. Se poate observa astfel ca probele de fecale diareice cu concentratie mai mare de lizozim decat probele de fecale de la pacientii sanatosi. Devine posibila de asemenea monitorizarea dinamicii lizozimului seric, in diferite infectii bacteriene, virale sau parazitare. Poate fi definit prin aceasta metoda nivelul fiziologic la diferite specii ca parametru de referinta pentru protectia imunospecifica.

CAPITOLUL II

TESTUL DE TRANSFORMARE BLASTICA

METODA DE EVALUARE A SINTEZEI

DE LIZOZIM IN VITRO

2.1. MATERIALE SI METODA

Concentratia lizozimului v-a fi dozata folosind supernatantele culturilor celulare, 2,4 ml de sange recoltat pe hepanina au fost omogenizati cu 9,6 ml mediu RPMI1640 cu adaos de 10% ser fetal de vitel (SFV), antibiotice (1000 ui penicilina si 1000 ui streptomicina/ml), tamponat cu o solutie de bicarbonat de sodiu 7,5% la pH 7,2 - 7,4. Din fiecare proba s-a facut o insamantare pe bulion simplu pentru controlul sterilitatii.

Dupa realizarea amestecului, acesta s-a repartizat in sticlute sterile cate 1,5 ml in fiecare. Toate variantele experimentale se executa in triplicat.

Acolo unde este prevazut se adauga substantele mitogene, acestea pot fi PHA M, Con A, LPS, extracte de organe (timus, splina), din bacterii vegetale, etc. Dozele sunt independente de activitatea mitogenica sau inhibitoare a compusului.

Sticlutele sunt inchise ermetic cu dopuri de cauciuc potrivite astfel incat prin respiratie celulara concentratia co din interiorul recipientului sa ajunga la 5%.

Incubarea culturii se face timp de 60 de ore.

2.2. Rezultate

Cresterea celulara este exprimata in mod obisnuit prin accelerarea metabolismului fiind activate sintezele celulare. În consecinta va avea loc o intensificare a sintezei enzimatice aparand cresteri le concentratiilor acestora in mediul de cultura.

Supernatantele culturilor celulare centrifugate vor fi utilizate pentru dozarea lizozimului prin metoda difuzimetrica (tehnica descrisa in capitolul I) rezultatele fiind exprimate in ug/ml.

2.3. Discutii

Utilizarea metodei cu sange integral pentru testul de transformare blastica, limfocitoza permite concomitent evaluarea unui parametru cu implicatii in raspunsul imun nespecific: lizozimul.

Avand in vedere mentinerea in vitro  a raporturilor celulare normale de la nivelul sangelui circulant, rezultatele pot fi extrapolate unor situatii fiziologice sau fiziopatologice. Compararea valorilor lizozimului din supernatante cu cele din ser ofera posibilitatea evaluarii intensitatii sintezei celulare a lizozimului si elaborarii unui eventual pronostic pentru starea de sanatate a animalului in perioada urmatoare.

Introducerea in mediul de cultura a unor substante cu efect asupra sistemului imun permite aprecierea efectului lor asupra sintezei de lizozim in vitro.

CAPITOLUL III

DOZAREA LIZOZIMULUI DIN SUPERNATANTE DE

CULTURI CELULARE LA BOVINE SEROLOGIC POZITIVE

PENTRU LEUCOZA ENZOOTICA BOVINA (LEB)

3.1. MATERIALE SI METODA

Testarile s-au efectuat pe un lot de 8 bovine adulte, dintr-o unitate din vestul tarii, pozitive serologic prin testele ELISA si IMUNO-DIFUZIUNE pentru infectia cu virus de leucozei enzootice bovine (LEB).

S-au recoltat probe de sange, recoltat prin punctia venei jugulare. Sangele pentru culturi celulare s-a recoltat pe anticoagulant (heparina), iar cel pentru ser pe gel coagulant in conditii sterile. Dupa coagulare probele pentru ser au fost trecute la +4ºC pentru 30 minute iar apoi centrifugate la 2500 rpm timp de 10 minute. Serurile au fost separate, trecute in fiole sterile si pastrate la congelator (-20ºC) pana in momentul determinarilor.

Sangele pentru culturi celulare a fost prelucrat dupa metoda descrisa in capitolul II.

Fiecare varianta a fost efectuata in dulpicat. S-au folosit ca substante mitogene PHAM si trei extracte de Calendulla in diferiti solventi E1 - in alcool etilic, E2 - in etilen glicol si E3 in acetona, eter de petrol, metanol.

Dozele au fost de cate 10 ul/1,5 ml (6,66 ul) ml amestec sange + medii. În paralel au fost testati asupra celulelor, solventi in aceleasi doze.

Dupa o incubare de 60 ore culturile au fost centrifugate si s-a dozat lizozimul din supernatante pentru fiecare varianta experimentala prin metoda difuzimetrica descrisa in cap. I.

Datele au fost prelucrate statistic, calculandu-se x, s, s iar semnificatia diferentelor a fost apreciata prin testul "t" Student.

3.2. Rezultate

Valorile obtinute sunt prezentate in tabelul urmator:

Tab.1 Diametre ale tonelor de liza masurate in mm, pentru supernatantele culturilor de mioze integral provenite de la bovine serologic pozitive.

M-PHA = 9,966 p < 0,001 M-E1 = 2,245 p < 0,025

M-M1 = 2,081 p < 0,010 M1-M3 = 4,330 p < 0,001

E2-E3 = 8,258 p < 0,001 PHA-E2 = 1,651 (nesp.)

E1-E2 = 3,748 p < 0,001

Tab.2. Concentratii ale lizozimului (ug/ml) din supernatantele culturilor de sange integral de la bovine serologic pozitive

M-M1 = 7,718 p < 0,01 M-M2 = 0

M-M3 = 2,602 p < 0,010 E1-E23 = 6,257 p < 0,001

E1-E3 = 1,172 (nesp.) E2-E3 = 1,085 (nesp.)

PHA-E3 = ,250 (nesp.) PHA-M1 = 1,012 (nesp.)

PHA-E3 = 1,138 (nesp.)

Din tabelul 1 si 2 se observa ca valoarea maxima (13,5 mm respectiv 38 ug/ml) a lizozimului se inregistreaza in cazul variantei tratata cu E3 iar valoarea minima (0) la majoritatea variantelor martor si tratate cu PHAM, M, M2 si sporadic printre alte variante.

Diferentele au fost semnificative statistic in cazul comparatiei M-PHAM p < 0,001; M-E1 p < 0,0025; M-M1 p < 0,010; M1-M3 p < 0,001; E2-E3 p < 0,001; E1-E2 p < 0,001.

Iar in urma transformarilor in ug a datelor din tabelul 1 - diferentele au fost semnificative statistic in cazul comparatiei M-M1 p < 0,001; M-M3 p < 0,010; E1-E2 p < 0,001.

Tab.3. Valori ale diametrelor zonelor de liza (mm) si le concentratiilor lizozimului (ug/ml) din probele de ser de vacile serologic pozitive

3.3. Discutii

Lizozimul este o enzima (N-cetil-muranil-hidrolaza) implicata in protectia antimicrobiana nespecifica, in fagocitoza oxigen-independenta. Sintetizarea sa in organism de catre monocite si granulocitele neutrofile este intensificata in conditii de stimulare antigenica sau stimulare nespecifica (vitamine, saruri minerale, etc.).

Activitatea metabolismului celular in vitro, in conditiile de cultivare a sangelui integral in medii RPMI ar putea influenta pozitiv sinteza lizozimului.

În experimentul efectuat, valorile medii obtinute pentru concentratiile lizozimului nu pledeaza intotdeauna pentru o sinteza activa in vitro. Efectuand corectiile necesare (multiplicare cu 5 pentru gradul 1 de diluare a sangelui in mediul de cultura) si comparatia cu valorile serice se constata ca acestea din urma depasesc valorile obtinute pentru supernatante. Exceptie de la aceasta situatie prezinta valorile lizozimului aproape duble fata de cele serice (45,63 comparativ cu 24,012) inregistrate pentru extractul E3. În cazul solventului, se obtine valoarea de 20,81, apropiata de cea serica. Datele obtinute demonstreaza influenta favorabila a extractului de Calendulla in acetona-eter de petrol-metanol asupra sintezei lizozimului in vitro.

CAPITOLUL IV

DOZAREA LIZOZIMULUI ÎN SUPERNATANTE

DE CULTURI CELULARE LA BOVINE SEROLOGIC

SLAB POZITIVE PENTRU LEUCOZA

ENZOOTICA BOVINA (LEB)

4.1. Materiale si metoda

Testarile au fost efectuate pe un lot de 3 bovine adulte dintr-o unitate din vestul tarii slab pozitive serologic prin testele ELISA si IMUNODIFUZIE pentru infectia cu virus al leucozei enzootice bovine (LEB).

S-a lucrat pe probe de sange recoltate prin punctia venei jugulare. Sangele pentru culturi celulare s-a recoltat pe anticoagulant (heparina), iar cel pentru ser pe gel coagulant in conditii sterile. Dupa coagulare probele pentru ser au fost trecute la +4ºC pentru 30 minute iar apoi centrifugate la 2500 rpm timp de 10 minute.

Serurile au fost separate, trecute in fiole sterile si pastrate la congelator (-20ºC) pana in momentul determinarilor.

Sangele pentru culturi celulare a fost prelucrat dupa metoda descrisa in capitolul II.

Fiecare varianta a fost efectuata in duplicat. S-au folosit c substante mitogene PHAM si trei extracte de Calendulla in diferiti solventi E1 in alcool etilic, E2 - in etilen glicol si E3 - in acetona, eter de petrol, metanol.

Dozele au fost de cate 10 ul/1,5 ml (6,66 ul) mestec sange + 3 medii. În paralel u fost testati pentru asupra celulelor, solventi in aceleasi doze.

Dupa o incubare de 60 ore culturile au fost centrifugate si s-a dozat lizozimul din supernatante pentru fiecare varianta experimentala prim metoda defuzimetrica descrisa in cap. I.

Datele au fost prelucrate statistic, calculandu-se x, s, s² iar semnificatia diferentelor a fost apreciata prin testul "t" Student.

4.2. Rezultate

Tab.4. Diametre ale zonelor de liza masurate in mm pentru supernatantele culturilor de sange integral provenite de la bovine serologic slab pozitive

PHA-E1 = 1650 (nesp.) PHA-M1 = 1487 (nesp.)

M-M1 = 3,098 p < 0,025 E1-E2 = 1 (nesp.)

Tab.5. Concentratii ale lizozimului (ug/ml) din supernatantele culturilor de sange integral de la bovine serologic slab pozitive

M-M1 = 1,741 (nesp.) M-M2 = 0

M-M3 = 0 E1-E2 = 2,572 p < 0,050

E1-E3 = 2,572 p < 0,050 PHA-E1 = 1,400 (nesp.0)

PHA-M1 = 1,258 (nesp.)

Din tabelele 4 si 5 se observa ca valoarea maxima este 11,5 mm respectiv 13,5 ug/ml a lizozimului ce se inregistreaza in cazul variantei tratate cu M1 iar valoarea minima (0) la majoritatea variantelor martor si la extractele E2 si E3.

Diferentele au fost semnificative statistic in cazul comparatiei - la valorile in mm - M-M1 p < 0,025 la valorile in ug/ml E1-E2 p < 0,050 si E1-E3 p < 0,050.

Tab.6. Valori ale diametrelor zonelor de liza (mm) si ale concentratiei lizozimului (ug/ml) din probele de ser de la vacile serologic slab pozitive

4.3. Discutii

Virusul leucozei bovine afecteaza organele sistemului imun determinand alterari structurale si functionale ale efectorilor imuni si modificand caile raspunsului imun.

Testarile efectuate in paralel pe probe provenite de la vaci serologic slab pozitive (supernatante de culturi celulare sau ser) releva valori apropiate pentru ser (9,0 ug/ml) in timp ce valorile obtinute pentru E1, respectiv M1 sunt foarte mari (25,0 ug/ml si 34,165 ug/ml). Influenta extractului este stimulatoare comparativ cu supernatantul din cultura martor, dar pare inhibitoare comparativ cu solventul.

Activitatea de sinteza a lizozimului in vitro este mai pronuntata in cazul lotului pozitiv decat a celui slab pozitiv.

Prezenta sintezei in vitro in anumite variante experimentale este dovedita de valori nule inregistrate pentru martor la gradul de diluare cu mediul aplicate (1/5). Paradoxala este lipsa de activitate a extractelor E2 si E3.

CAPITOLUL V

DOZAREA LIZOZIMULUI DIN SUPERNATANTE DE

CULTURI CELULARE LA BOVINE SEROLOGIC NEGATIVE

PENTRU LEUCOZA ENZOOTICA BOVINA (LEB)

5.1. MATERIALE SI METODA

Testarile au fost efectuate pe un lot de 3 bovine adulte dintr-o unitate din vestul tarii slab pozitive serologic prin testele ELISA si IMUNODIFUZIE pentru infectia cu virus al leucozei enzootice bovine (LEB).

S-a lucrat pe probe de sange recoltate prin punctia venei jugulare. Sangele pentru culturi celulare s-a recoltat pe anticoagulant (heparina), iar cel pentru ser pe gel coagulant in conditii sterile. Dupa coagulare probele pentru ser au fost trecute la +4ºC pentru 30 minute iar apoi centrifugate la 2500 rpm timp de 10 minute.

Serurile au fost separate, trecute in fiole sterile si pastrate la congelator (-20ºC) pana in momentul determinarilor.

Sangele pentru culturi celulare a fost prelucrat dupa metoda descrisa in capitolul II.

Fiecare varianta a fost efectuata in duplicat. S-au folosit ca substante mitogene PHAM si trei extracte de Calenndulla in diferiti solventi E1 - in alcool etilic, E2 - in etilen glicol si E3 - in acetona, eter de petrol, metanol.

Dozele au fost de cate 10 ug/1,5 ml (6,66 ul) ml amestec sange + 3 medii. În paralel au fost testati pentru asupra celulelor, solventi in aceleasi doze. Dupa o incubare de 60 ore culturile au fost centrifugate si s-a dozat lizozimul din supernatante pentru fiecare varianta descrisa in cap. I.

5.2. REZULTATE

Tab.7. Diametre ale zonelor de liza masurate in (mm) pentru supernatantele culturilor de sange integral provenite de la bovine serologic negative.

M1-M2 = 1,994 (nesp.) M-M3 = 1,079 (nesp.)

E1-E2 = 8,580 (nesp.) E1-E3 = 6,697 p < 0,001

M-M3 = 3,372 p < 0,025

Tab.8. Concentratii ale lizozimului (ug/ml) din supernatantele culturilor de sange integral de la bovine serologic negative.

M-M1 = 1,666 (nesp.) M-M2 = 9,996 p < 0,025

M-M3 = 4,272 p < 0,010 E1-E2 = 2,5121 p < 0,050

E1-E3 = 2,234 p < 0,050 M1-M2 = 1,706 (nesp.)

M-E2 = 2,785 p < 0,025

Din tabelele 7 si 8 se observa ca valoarea maxima este de (9,5 mm respectiv 4,7 ug/ml) a lizozimului se inregistreaza in cazul variantei tratata cu E1 iar valoarea minima 0 l martorul M2 si PHA si sporadic la celelalte variante.

Diferentele au fost semnificative statistic in (mm) in cazul combinatiilor E1 - E3 p < 0,001 si M - M3 cu p < 0,025.

Iar in urma transformarilor in ug a datelor din tabelul 7, datele obtinute au fost: M1 - M2, p < 0,001; M-M3, p < 0,010; E1-E2, p < 0,050; E1-E3, p < 0,050; M-E2, p < 0,025.

Tab.9. Valori ale diametrelor zonelor de liza (mm) si ale concentratiilor lizozimului ug/ml din probele de ser de la vacile serologic negative.

5.3. Discutii

Descrierea profilului imunologic la animalele clinic sanatoase presupune investigarea efectorilor imuni specifici si nespecifici. Unul dintre indicatorii protectiei nespecifice este lizozimul (N-acetil-muranil-hidrolaza).

Capacitatea celulelor de a sintetiza aceasta enzima poate fi testata in vitro, rezultatele permitand evaluarea nivelului protectiei nespecifice in cazul unei posibile agresiuni.

La lotul de animale serologic negative, nivelele lizozimului seric sunt cele mai ridicate. Sinteza in vitro este prezenta spre deosebire de celelalte doua loturi si la varianta martor, la nivele comparabile cu cele din serul animalelor slab pozitive. Pradoxala este absenta sintezei de lizozim pentru varianta stimulata cu PHA, la acest lot.

Toate trei extractele induc o crestere a nivelelor lizozimului. Extractul E1 se comporta ca inhibitor (comparativ cu solventul) in timp ce extractele E2 si E3, au efect stimulator (comparativ cu solventul). Efectele E1 sunt mult mai pronuntate la loturile 2 si 3 (slab pozitive si negative) comparativ cu lotul 1.

E3 este activ doar la animalele serologic pozitive si respectiv negative cu valori maxime.

Solventul etilen glicol nu are efect la nici unul dintre loturi.

Datele comparative sunt prezentate in tabelul urmator:

Tab.10.

CONCLUZII

1) Aplicarea testului de transformare blastica in vitro folosind sange integral permite cuantificarea concentratiei lizozimului sintetizat, iar intrebuintarea metodei difuzimetrice pentru dozarea lizozimului este utila in determinarea unor cantitati ce depasesc 1,56 ug/ml.

2) Extractele vegetale utilizate in experimentul nostru au activitate asupra celulelor sangelui circulant, determinand in masura mai mare (E1) sau mai mica (E2 si E3) stimularea sau inhibarea sintezei lizozimului in vitro.

3) Parametrul studiat - concentratia lizozimului din supernatantele celulare - este comparabil sau chiar depaseste valorile serice, sub influenta unor extracte (E1 si E3).

4) Extractele vegetale aplicate pot fi folosite pentru cresterea capacitatii de aparare nespecifica in vivo, dupa efectuarea testelor de toleranta.

5) Cresterea lizozimului la lotul serologic pozitiv este mai intensa decat la lotul martor sub influenta extractului acetona, extract de petrol, metanol care in acest caz se dovedeste un bun stimulator.

BIBLIOGRAFIE

BALBAI V., POZSCI, N -1987 Bacterilogie Medicala

BLALOCK T.L., THAXON J.P., CONLICH J.: -1984, J.Nutr. 114,2; 2,312. (Vet. Boll. 4529/1984)

BORSTM GHA., Couinotte, G.H.M., -1984, Tijd.Diergunes, 109, N/16-626

BORST GHA., Couinotte,ghm., -1986, Vet.Res.Communic, 10/143-148

DENIZENKO V.V., Evrinova E.E., -1985 Dokl Vsesainzui Akad, Selst Novk: 9-24

FARID A., Selim, S.A. Abdel-Chani, M.Ismail, M. -1984 Arch Exp.Vet.Med.,Lipzing, 38, nov. 6,857-862

PONDA N.E. SODEK, P.O., EWENSON-MARIE-LOUISE, Scand. J Dent Res -1987, 95: pag. 216-220

HILL I.R. PORTER P., Immunology -1974, 26; pag. 1239

IACONE V.J. -1985 Infection and immunity 437-464

LAIRE-NANCY, J Germaine; G.R. -1985, Infection and immunity, 720-728

LIE O. Lyed M Solbu; H -1986 Acta Vet; Scand; 27,32-33

MARICA D. -1985 Curs de Microbiologie si Imunologie Genrala; Lito. Agronomia pag 95-108

MOFFAT, BARBARA; A. Studien, W.F., -1987, Cell Vol 49; 221-227

MOORE P.F.Vet.Pothol, 3; 757-762 -1986

NITTA K.,TSWGE, H. SUGAI; SH. SHIMAZAKI -The calcium

PAHOD J.J. SCHELLENBERG; D.Anu; Rech Vet.14; -1983; 4; 493

PATOVA T.V.Spolianski J.V. Nisambev, K.N. -1987 Veterinatija 5 60-63

PATOVA T.V. Spolianski J.V. Nisambev, K.N. -1988 Veterinatija 6 60-62

PAULIK, S. SLANIVA, L.POLACE, K.M-; Veterinarni Medicine 30 -1985  1-21

REINER H. -1984 Lysozym und Immunglobulin-best immungen in Tracheobronchialse; Kret von Pferden mit crinische, obstruvtiver Bronchiolis, teza de doctorat Hnovra

ROIT I.N. -1987 Essential Imunology Blatwell Scientific Publications 179-203

SOKOLOV A. -1985 Ptitevodstvo, 9,32 Vet Boll 56, 1986, 2.1177

WEBB D. WINKELSTEIN A. -1983 BASIC AND CLINICAL IMUNOLOGY 277-291

ZARNEA G. -1983 - Tratat de Microbiologie generala Ed. Academiei Buc. Vol I, 314-315

ZARNEA G. -1983 - Basic and clinical Imunology large medical publication.