LIZOZIMUL ENZIMA ACTIVA ÎN PROTECTIA ANTIMICROBIANA

LIZOZIMUL ENZIMA ACTIVA ÎN PROTECTIA ANTIMICROBIANA

În 1929, Alexandru Fleming studiind probe de secretie nazala a descoperit un "element bacteriolitic" cu activitate enzimatica denumit "lizozim".

Ulterior lizozimul a fost pus in evidenta in alte lichide si secretii ale organismului si in leucocite. Testarile efectuate au desemnat ca reactant o specie de micrococ extrem de sensibila, careia de altfel, i s-a atribuit denumirea de "lysodicticus".

S-a semnalat (Fleming, 1929) existenta fenomenului de rezistenta fata de actiunea lizozimului, rezistenta care determina o scadere a fagocitozei si de aceea pastrarea sau exacerbarea virulentei germenului infectant.

O privire sistemica asupra actiunii acestei  enzime demonstreaza prezenta ei in structura unor plante (Fleming, 1929) si sinteza sa de catre unele bacterii.

A urmat o stagnare a cercetarilor in domeniul lizozimului pana in anii ´60 cand Jahren Jolles si colaboratorii sai s-au ocupat de clasificarea structurii si modul sau de actiune (PAULIK -1985, REINER H. -1984) iar apoi Wilson si Progen (cit de Reiner) studiaza modificarile antigenice ale lizozimului la diferite specii. S-a demonstrat ca in timpul evolutiei la fiecare specie apare lizozimul propriu.

Gandsword si Virella (1978, cit de Reiner) observa similitudinea dintre lizozimul uman si cel canin, dar nu si intre enzima de la om si cea din lapte sau albusul de ou (REINER H. -1984).

În medicina veterinara lizozimul a fost cu precadere, dozat pentru aprecierea calitatii laptelui pentru consum (REINER H. -1984) si a celui destinat sugarilor in corelatie cu rolul in prevenirea infectiilor la acestia.

Definitii si structura

Lizozimul este un factor fundamental al imunitatii naturale, facand parte dintre factorii umorali.

Lizozimul (muranidaza) are structura primara a unui lant polipeptidic, cationic, prezenta legaturilor disulfidice determinand organizarea secundara si tertiara, clarificate in amanuntime doar in unele cazuri (lizozimul din albusul de ou, lizozimul uman) (REINER H. -1984, ZARNEA G. -1983 - Basic and clinical).

Greutatea sa moleculara variaza intre 14000 si 18000 (REINER H. -1984) constanta de sedimentare este de 1,8 s, iar punctul izoelectric al moleculelor studiate pana in prezent este la un pH optim 11. În camp magnetic migreaza formand o banda postgamma.

Raspandire in organism

Exceptand factorii constitutionali care asigura rezistenta sau sensibilitatea, innascuta fata de diferite infectii, exista o serie de sisteme nespecifice antimicrobiene recunoscute drept "mostenite" (de ex fagocitoza) in sensul neafectarii lor intrinsece printr-un contact anterior cu antigenul (NITTA K. -The calcium).

Rezultand din interventia unor structuri obisnuite rezistenta naturala are caracter de specie (MARICA D. -1985). Protectia se asigura prin interpunerea pasiva a unor elemente sau prin interventia activa a altora.

Lizozimul este larg raspandit, gasindu-se in organismul animalelor, plantelor si in bacterii. Se gaseste in sange, lacrimi, saliva, mucus, chisti ovarieni secretati din aparatul respirator, digestiv si urogenital (MARICA D. -1985).

Pielea si mucoasele reprezinta barierele naturale impenetrabile pentru majoritatea agentilor infectiosi, consolidate prin interventia unor secretii (acid undecilinic la nivelul pielii, secreti gastrica).

Sinteza

Sinteza lizozimului are loc in ribozomii reticulari endoplasmatici si "de nevo" in macrofage (BORST GHA -1986).

1.4. Functii

Fleming a descris in 1922 actiunea litica a lizozimului asupra unei tulpini bacteriene test Micrococcus lysodeicticus. Efectul nu este atat de pronuntat in cazul utilizarii altor bacterii.

Functional lizozimul este o carbohidraza care desface selectiv legaturile glicozidice B (BALBAI V., POZSCI -1987, BLALOCK T.L. -1984, BORSTM GHA. -1984, BORST GHA -1986) intre acidul N-acetilmuranic si N-acetil glucozamina, element ce intra in componenta peptidoglicanului din peretele bacterian. Prin distrugerea retelei de peptidoglican (mureina) nu se mai echilibreaza diferenta de presiune osmotica intre interiorul si exteriorul celulei care este astfel distrusa (MARICA D. -1985, REINER H. -1984, ZARNEA G. -1983 - Tratat de Mic., ZARNEA G. -1983 - Basic and clinical).

Lizozimul actioneaza asupra stafilococului auriu absorbandu-se in celula activand autolizinele din peretele ei. Tulpinile 1030Rf Cd sunt putin susceptibile in conditii de anaerobioza (LIE O. -1986, MOFFAT -1987). Uneori efectul constatat este cula de agregare apoi liza (PONDA N.E. -1987).

Selectivitatea T7ARN polimerozei este folosita pentru transcrierea si replicarea bacteriofagului T7 ADN in decursul infectiei. S-a demonstrat ca lizozimul formeaza cu T7 ARN - polimeraza un complex, inhiband astfel transcrierea, o proprietate utilizabila pentru controlul replicarii virale (MOFFAT -1987).

Rolul in fagocitoza

Distrugerea microorganismelor de catre neutrofile se realizeaza prin mecanisme grupabile in doua mari categorii: oxigen dependente si oxigen independente.

Fig. 1. Sistemele antimicrobiene ale granulocitului neutrofil

a)     Oxigen dependente

Micloperoxidaza - mediata: componentele acestui sistem includ:

Micloperoxidaza

HO

Cofactorul oxidabil

Acid

Micloperoxidaza - independent:

HO

Anionul superoxid (O‾)

Singlet - oxigenul (O)

Radicalul hidroxid

b)     Oxigen - independente

Proteinecationice

Lactofeina

pH-ul acid

Histonele nucleare; Elastaza dupa (ZARNEA G. -1983 - Basic and clinical)

Sistemele activitatii bacteriene independente respiratorii neoxidative au o importanta evidenta, unele microorganisme putand fi distruse de neutrofile in conditii de anaerobioza (P. aeruginoza, Candida parapsiloris, bacteriile anaerobe).

Fig. 2. Mecanisme oxigen independente

pH-ul acid ..........favorizeaza actiunea lizozimului

Lizozimul ......... .distruge mucopeptidele din peretele bacterian

Proteine cationice .....altereaza membrana microbiana

Enzime proteolitice ..... distrugerea microorganismelor omorate

(inclusiv elastaza)

Alte enzime hidrolitice ....distrugerea microorganismelor

Lizozimul care se gaseste atat in granulatiile primare cat si in cele specifice, ataca mucopeptidele peretelui celular. Bacteriile intrinsec insensibile

la actiunea enzimei devin susceptibile in prezenta acidului asorbic sau a complementului hemolitic si a peroxidului de hidrogen. Deoarece adesea moartea bacteriei premerge in timp, actiunea lizozimului se pare ca interventia se face mai curand prin capacitatea de digestie decat prin capacitatea bactericida (BALBAI V., POZSCI -1987, REINER H. -1984, ROIT I.N. -1987, ZARNEA G. -1983 - Basic and clinical).

Opsonizarea. Activitatea complementului

În prezenta complementului si a lizozimului, IgA este capabila sa lizeze E coli. Exista date legate de opsonizare care subliniaza actiunea stimulativa a lizozimului prin fluidul duodenal asupra fagocitozei, sub forma complexului antigen - anticorp - lizozim determina fenomenul cunoscut sub denumirea de "efect de opsonizare" (REINER H. -1984). Alaturi de factorul C al sistemului complement, IgG si IgM, lizozimul poate avea rol de opsonina (REINER H. -1984).

Lizozimul intervine impreuna cu IgA in activarea complementului pe cale alternativa, procesul fiind finalizat prin distrugerea celulelor infectate Gram pozitiv sau chiar Gram negative.

Particularitati ale lizozimului la diferite specii

Lizozimul la rumegatoare

Continutul abamoral provenit de la bovine, caprine si ovine prezinta o activitate bacteriolitica intensa datorita continutului crescut de lizozim. Prin electrofocusare s-au evidentiat fenomene moleculare diverse, predominand (18%) cele cu greutate de 15000, pH optim 5,0 si dovedind o remarcabila stabilitate conformationala.

Analiza secventei amino - acizilor evidentiaza caracteristici cunoscute (4 - legaturi disulfidice lizina N - terminala si doua resturi prolina).

Omogenitatea structurala a lizozimului la cele trei specii s-a demonstrat prin crossreactivitate imunologica (PAHOD J.J. -1983).

În intestinul subtire la bovine s-a detectat o forma de lizozim similara celui din mucoasa abomasala (DENIZENKO V.V. -1985).

Studiul concentratiei lizozimului seric la vitei demonstreaza absenta la 6% si prezenta in cantitati reduse 0,05 - 0,5 ug/ml la 90% respectiv 0,5 - 1,4 ug/ml la 4% din totalul animalelor investigate (PAULIK -1985).

1.4.2. Lizozimul la porcine

Investigarea prezentei lizozimului in secretiile cervicovaginale, uterina si in lichidul folicular la scroafe deceleaza valori spontane fata de cele semnalate la bovine: 10,6 ug/ml vagin, 6,47 ug/ml uter si 1,99 ug/ml in lichidul folicular fiind accentuata cresterea in caz de infectie (15,9 - 18,94 ug/ml) (HILL I.R. -1974).

1.4.3. Lizozimul la cabaline

Lizozimul la aceasta specie apartine tipului e (chicken), in baza secventei sale de aminoacizi. La pH - neutru enzima cupleaza ionul de Ca in timp ce lizozimul uman si cel din albusul de ou nu au aceasta proprietate.

Legarea Ca este probabil implicata in stabilirea structurala (NITTA K. -The calcium).

1.4.4. Lizozimul la caine

La caine tehnica de evidentiere a lizozimului imunoactiv s-a dovedit a fi utila in scopul aprecierii repartitiei macrofagelor.

Majoritatea macrofagelor din ganglionii limfatici, splina, alveole pulmonare lamino proprea intestinului contine cantitati mari de lizozim. În contrast celulele dendritice prezentatoare de antigen, celulele epidermale si mucoase, reticulare, periarticulare sunt lipsite de acestea (MOORE P.F. -1986).

1.4.5. Lizozimul la om

Prezenta lizozimului in saliva are un rol deosebit in asigurarea protectiei antimicrobiene in cavitatea bucala. Studiul intreprins in legatura cu producerea lizozimului in corelatie cu beta - N - acetil - D - glucozaminidaza de catre glanda parotida si glandele salivare submandibulare demonstreaza functionarea lor in dependenta, capacitatea litica a lizozimului fiind sporita in probele de saliva provenite din glandele submandibulare iar activitatea NAC - azei este crescuta in saliva parotidiana (PONDA N.E. -1987).

CAPITOLUL II

METODE DE DOZARE A LIZOZIMULUI

Sensibilitatea deosebita a bacteriilor Micrococcus si Micrococcus luteus (MOORE P.F. -1986) fata de actiunea lizozimului a stat la baza utilizarii acestora pentru aprecierea capacitatii litice a enzimei prin metode difuzimetrica sau turbidimetrice (spectrofotometrice).

2.1. Metoda difuzimetrica

Aceasta metoda utilizata pentru dozarea activitatii litice a probei (ser, saliva, lactoser, etc) difuzia simpla in mediul solid - agar sau agaroza in care se inglobeaza tulpina Test de micrococ. Placile cu probele biologice studiate se pot mentine la temperatura camerei 20 de ore sau se incubeaza la termostat, la 37ºC, acelasi interval de timp. Lizozimul continut in proba, determinand aparitia unei zone circulare de liza al carei diametru este direct proportional cu concentratia. În cazul fiecarei serii de testari, se lucreaza in paralel o proba cu concentratia de lizozim, de obicei albusul de ou cu 100 ug/ml sau 10000 unitati/mg proteina.

Valorile obtinute in mm pot fi convertite in unitati litice prin calcul sau in ug/ml folosind curba de integrare alcatuita, (utilizand albusul de ou in dilutii succesive, fiind decelabile chiar 2*10 ug/ml ) (NITTA K. -The calcium).

2.2. Metoda spectrofotometrica

Aplicata de numerosi cercetatori, metoda se bazeaza pe reducerea densitatii optice a suspensiei de micrococ sub actiunea enzimei litice din proba de examinat.

Pornind de la o suspensie bacteriana cu densitatea optica (DO) stabilita spectrofotometric si o solutie de lizozim cu concentratia cunoscuta, se bazeaza ca si in cazul tehnicii descrise anterior pe un grafic etalon pentru interpolarea valorilor (DO) obtinute experimental si exprimarea lizozimului in ug/ml. Timpul de expunere al suspensiei la actiunea probei poate fi variabil. Pentru pasari s-a stabilit DO initiala optim de 0,200. iar ritmul de contact 30minute la temperatura camerei de 20-30ºC (ZARNEA G. -1983 - Tratat de Mic.). Sensibilitatea metodei este mare, deceland cantitati de 0,02 ug/ml. (BORST GHA -1986, PONDA N.E. -1987).

Cu toate ca dupa unii autori (NITTA K. -The calcium) dozarea difuzimetrica este superioara celei spectrofotometrice, erorile volumetrice fiind eliminate, rezultatele obtinute prin cele doua tehnici se coreleaza. Acest fapt indica variatia individuala a activitatii specifice, a diferitelor tipuri enzimatice (NITTA K. -The calcium).

Rezultatele pot fi influentate in cazul ambelor metode chiar daca se foloseste aceeasi solutie standard de lizozim, de prezenta in lichidele biologice testate a unor amine sau poliamine (lizina, arginina, putresceina, cadaverina, spermina, spermadina). Aceasta determina obtinerea unor valori crescute in urma difuziei in placa, in timp ce prin spectrofotometrie se inregistreaza o inhibare accentuata a lizei, motiv pentru care interventia posibila a acestor factori nu trebuie omisa.