METODE DE DOZARE A LIZOZIMULUI

METODE DE DOZARE A LIZOZIMULUI

Sensibilitatea deosebita a bacteriilor Micrococcus si Micrococcus luteus (MOORE P.F. -1986) fata de actiunea lizozimului a stat la baza utilizarii acestora pentru aprecierea capacitatii litice a enzimei prin metode difuzimetrica sau turbidimetrice (spectrofotometrice).

1. Metoda difuzimetrica

Aceasta metoda utilizata pentru dozarea activitatii litice a probei (ser, saliva, lactoser, etc) difuzia simpla in mediul solid - agar sau agaroza in care se inglobeaza tulpina Test de micrococ. Placile cu probele biologice studiate se pot mentine la temperatura camerei 20 de ore sau se incubeaza la termostat, la 37ºC, acelasi interval de timp. Lizozimul continut in proba, determinand aparitia unei zone circulare de liza al carei diametru este direct proportional cu concentratia. În cazul fiecarei serii de testari, se lucreaza in paralel o proba cu concentratia de lizozim, de obicei albusul de ou cu 100 ug/ml sau 10000 unitati/mg proteina.

Valorile obtinute in mm pot fi convertite in unitati litice prin calcul sau in ug/ml folosind curba de integrare alcatuita, (utilizand albusul de ou in dilutii succesive, fiind decelabile chiar 2*10 ug/ml ) (NITTA K. -The calcium).

Metoda spectrofotometrica

Aplicata de numerosi cercetatori, metoda se bazeaza pe reducerea densitatii optice a suspensiei de micrococ sub actiunea enzimei litice din proba de examinat.

Pornind de la o suspensie bacteriana cu densitatea optica (DO) stabilita spectrofotometric si o solutie de lizozim cu concentratia cunoscuta, se bazeaza ca si in cazul tehnicii descrise anterior pe un grafic etalon pentru interpolarea valorilor (DO) obtinute experimental si exprimarea lizozimului in ug/ml. Timpul de expunere al suspensiei la actiunea probei poate fi variabil. Pentru pasari s-a stabilit DO initiala optim de 0,200. iar ritmul de contact 30minute la temperatura camerei de 20-30ºC (ZARNEA G. -1983 - Tratat de Mic.). Sensibilitatea metodei este mare, deceland cantitati de 0,02 ug/ml. (BORST GHA -1986, PONDA N.E. -1987).

Cu toate ca dupa unii autori (NITTA K. -The calcium) dozarea difuzimetrica este superioara celei spectrofotometrice, erorile volumetrice fiind eliminate, rezultatele obtinute prin cele doua tehnici se coreleaza. Acest fapt indica variatia individuala a activitatii specifice, a diferitelor tipuri enzimatice (NITTA K. -The calcium).

Rezultatele pot fi influentate in cazul ambelor metode chiar daca se foloseste aceeasi solutie standard de lizozim, de prezenta in lichidele biologice testate a unor amine sau poliamine (lizina, arginina, putresceina, cadaverina, spermina, spermadina). Aceasta determina obtinerea unor valori crescute in urma difuziei in placa, in timp ce prin spectrofotometrie se inregistreaza o inhibare accentuata a lizei, motiv pentru care interventia posibila a acestor factori nu trebuie omisa.