Test calitativ ELISA in faza solida pentru detectia anticorpilor IgG - REZUMAT SI EXPLICATIA TESTULUI

ANTIBODY MONITORING SYSTEM:

HLA clasa I si clasa II (AMS1+2)

Test calitativ ELISA in faza solida pentru detectia anticorpilor IgG directionati catre antigenele HLA din clasa I si II specifice donatorului

Numai pentru diagnostic in vitro.

REZUMAT SI EXPLICATIA TESTULUI

HLA este un sistem antigenic major implicat in determinarea supravietuirii alotransplantelor sau plachetelor transfuzate la indivizii sensibili.¹ Anticorpii HLA pot fi dobanditi prin aloimunizare ca rezultat al sarcinii, transfuziei de derivate din sange, sau transplantelor anterioare. In general aloimunizarea conduce la producerea de anticorpi in cazul a 33% din indivizii expusi.²

Antigenele umane leucocitare din clasa I si II (HLA) sunt glicoproteine membranare puternic polimorfe. Anticorpii directionati catre antigenele HLA s-au dovedit implicate in esecul transplantului.^3-6 Monitorizarea post-transplant a acestor anticorpi este importanta in evaluarea supravietuirii potentiale a transplantului.^{7, 8}

PRINCIPIUL PROCEDURII

Glicoproteinele HLA sunt preparate din limfocite prin solubilizarea celulelor cu un detergent neionic. Dupa solubilizarte, lizatele de limfocite se adauga in godeurile in care au fost imobilizati anticorpi monoclonali specifici pentru HLA clasa I si clasa II. Glicoproteinele HLA sunt lasate sa se lege de anticorpii monoclonali, si apoi glicoproteinele nelegate sunt indepartate prin spalare. Godeurile continand glicoproteinele legate sunt testate cu ser uman pentru a detecta anticorpii anti-molecule HLA. Anticorpii nelegati sunt indepartati prin spalare. Se adauga apoi in godeuri un reactiv anti-globuline umane (anti-IgG) marcat cu fosfataza alcalina si godeurile se incubeaza. Anti-IgG nelegat se indeparteaza prin spalare si apoi se adauga substratul fosfatazei alkaline PNPP. Dupa 30 minute de incubare, reactia este oprita cu solutie de hidroxid de sodiu. Densitatea optica a culorii formate se masoara cu un spectrofotometru.

Kitul contine 3 sisteme de control:

Primul sistem e compus dintrun preparat de limfocite deshidratat (martorul limfocite deshidratate) si un anticorp (serul martor pozitiv) cunoscut ca fiind reactiv cu ambele clase de glicoproteine limfocitare (clasa I si clasa II). Limfocitele deshidratate se rehidrateaza si sunt solubilizate pentru a obtine un lizat. Lizatul se aplica in godeurile de control. Serul martor pozitiv se testeasa fata de lizatul martor pentru a confirma ca tamponul pentru liza limfocitelor si alti reactivi din test functioneaza bine.

Al 2-lea sistem de control este compus din 2 anticorpi monoclonali conjugate cu fosfataza alcalina. Unul (reactivul de control lizat clasa I) este directionat catre glicoproteinele HLA clasa I. Celalalt (reactivul de control lizat II) este directionat catre glicoproteinele HLA clasa II. Cand sunt testati direct fata de glicoproteinele capturate in godeuri, acesti reactivi vor da rezultate pozitive, indicand ca moleculele de HLA clasa I sau II au fost capturate in godeuri.

Al 3-lea sistem de control este martorul negativ. Reactiile pozitive sunt validate in godeurile de test daca sunt cel putin de 2 ori media martorului negativ.

REACTIVII

Numarul maxim de teste per kit: 44

Toti reactivii trebuie pastrati in modul indicat pe eticheta.

MS1 / MS2 Microgodeuri: stripuri cu microgodeuri cu fund plat, in care au fost imobilizati anticorpi specifici pentru glicoproteinele HLA clasa I (cod culoare albastru) si HLA clasa II (cod culoare purpuriu). Stripurile cu godeuri sunt introduse in ambalaje din folie care pot fi resigilate. Sunt gata de utilizare.

TCW Solutie de spalare concentrata (10x): solutie tamponata de tris (hidroximetil) aminometan care contine clorura de sodiu si Tween 20, 1% azida de sodiu. Inainte de utilizare diluati solutia de spalare cu apa distilata sau deionizata. Pastrati solutia de spalare pana la 48 de ore la temperatura camerei sau pana la 7 zile la 2 - 8 ^oC.

SD 3. Diluent pentru proba: tampon fosfat salin continand albumina bovina sau ser de soarece, 0.1% azida de sodiu. Gata de utilizare

SB 4. Tampon substrat: solutia contine dietanolamina si clorura de magneziu, 0.02% azida de sodiu. Gata de utilizare.

SS 5. Solutie de stopare: solutie 3M de hidroxid de sodiu. Gata de utilizare. Manipulati cu grija.

AG 6. Conjugat: anticorpi de capra purificati prin afinitate anti-IgG uman conjugati cu fosfataza alcalina. 0.1% azida de sodiu. Se dilueaza in diluentul pentru lizat si conjugat inainte de folosire.

LCD 7. Diluent pentru lizat si conjugat: tampon tris continand clorura de sodiu, 0.5% azida de sodiu. (capac albastru) Gata de utilizare.

LLB 8. Tampon pentru liza limfocitelor: tampon tris salin continand clorura de sodiu, 0.5% azida de sodiu. Se dilueaza in apa distilata sau deionizata inainte de folosire

LCR1 9. Reactiv martor lizat clasa I: anticorpi monoclonali specifici pentru HLA clasa I conjugati cu fosfataza alcalina. 0.1% azida de sodiu. Se dilueaza in diluentul pentru lizat si conjugat inainte de folosire. (capac albastru)

LCR2 10. Reactiv martor lizat clasa II: anticorpi monoclonali specifici pentru HLA clasa II conjugati cu fosfataza alcalina. 0.1% azida de sodiu. Se dilueaza in diluentul pentru lizat si conjugat inainte de folosire. (capac purpuriu)

DLC 11. Martor limfocite deshidratat: limfocite deshidratate. Se rehidrateaza inainte de folosire.

PN 12. Substrat PNPP (p-nitrofenil fosfat): pudra cristalina. Se reconstituie cu apa distilata sau demineralizata si se dilueaza in tamponul substrat inainte de utilizare.

PC  Ser martor pozitiv: ser uman, 0.1 % azida de sodiu. Se dilueaza in diluentul pentru proba inainte de utilizare.

NC  Ser martor negativ: ser uman. 0.1 % azida de sodiu. Se dilueaza in diluentul pentru proba inainte de utilizare.

PS 15. Sigilii pentru placi.

PRECAUTII

• Nu utilizati reactivii care sunt tulburi sau sunt contaminati.
• Lucrati cu grija pentru a evita contaminarea diluentului pentru lizat si conjugat, a LCR1, LCR2 si a conjugatului. Contaminarea nedorita a acestor reactivi cu ser uman va duce la neutralizarea conjugatului sau a LCR1 si LCR2 urmata de esecul testului.
• Nu utilizati reactivii dupa data de expirare.
• Godeurile si reactivii din trusa nu pot fi utilizati impreuna cu alte sisteme de testare
• Inlocuirea componentelor kitului cu unele diferite de cele din kit poate duce la obtinerea unor rezultate eronate.
• Eliminati orice portie de conjugat diluat, tampon pentru liza limfocitelor diluat, martorii lizat diluati, pozitiv si negativ diluati si reactiv PNPP diluat si reconstituit ramasa dupa fiecare desfasurare a testului.
• Cand realizati dilutiile urmati instructiunile producatorului privind pipetarea pentru o corecta clatire si distribuire a reactivilor.
• Reactia substrat enzima de la sfarsitul incubarii este sensibila la temperatura si trebuie realizata intr-un interval de temperatura controlat de 22 - 25 ⁰C.
• Datorita variatiilor consistente de temperatura a aparaturii si a camerei, este esential ca fiecare laborator sa-si stabileasca cel mai lung si cel mai scurt timp de incubare care poate fi folosit fara sa afecteze validitatea rezultatelor.
• Aglomerarea limfocitelor sau splenocitelor inaintea lizei poate duce la obtinerea unor lizate slabe si a unor rezultate cu valori scazute la testarea reactivilor martor lizat. Este important sa prelucrati celulele cu grija pentru a evita aglomerarea. Contaminarea unui preparat de limfocite cu hematii poate scadea cantitatea de glicoproteine HLA in lizat daca nu sunt indepartate inainte de estimarea volumului de cellule ambalat.
• Centrifugarea la viteze mai mari decat cele recomandate poate produce liza premature a limfocitelor, agregarea si pierderea limfocitelor.

ATENTIE

• Serurile utilizate pentru producerea martorului pozitiv si negativ au fost testate prin metode aprobete FDA si nu prezinta anticorpi pentru anti-HIV, anti-HCV si HBsAg. Cu toate acestea materialele trebuie manipulate cu grija si considerate ca fiind potential infectioase.
• Anumiti reactivi din acest kit contin azida de sodiu ca si conservant.

ATENTIE! Azida de sodiu reactioneaza cu plumbul si cuprul formand azide metalice explozive. Daca aruncati reactivii in chiuveta trebuie sa turnati o cantitate mare de apa pentru a evita formarea azidelor. Azida de sodiu este toxica daca este ingerata.

• Solutia de stopare (NaOH ) este coroziva. Evitati contactul cu pielea si cu ochii. In cazul contactului trebuie curatata imediat zona.
• Aruncati toate componentele utilizate respectand normale locale.

• Inlocuirea componentelor kitului cu unele diferite de cele din kit poate duce la obtinerea unor rezultate eronate.
• Eliminati orice portie de conjugat diluat, martor pozitiv si negative diluat si reactive PNPP diluat si reconstituit ramasa dupa fiecare desfasurare a testului.
• Cand realizati dilutiile urmati instructiunile producatorului privind pipetarea pentru o corecta clatire si distribuire a reactivilor.
• Reactia substrat enzima de la sfarsitul incubarii este sensibila la temperatura si trebuie realizata intr-un interval de temperatura controlat de 22 - 25 ⁰C.
• Datorita variatiilor consistente de temperatura a aparaturii si a camerei, este esential ca fiecare laborator sa-si stabileasca cel mai lung si cel mai scurt timp de incubare care poate fi folosit fara sa afecteze validitatea rezultatelor.

RECOLTAREA PROBEI

Celulele: Splina va fi recoltata conform metodelor locale. Splina va fi procesata in 72 de ore de la recoltare. Limfocitele din sangele periferic vor fi colectate pe heparinat de sodiu sau ACD utilizand tehnici aseptice, vor fi depozitate la temperatura camerei si procesate in 72 ore de la recoltare.

Serul: sangele va fi colectat fara anticoagulant utilizand o tehnica aseptica si va fi testat cat este inca prospat pentru a minimiza sansa de a obtine reactii fals pozitive sau fals negative datorita pastrarii necorespunzatoare sau a contaminarii probelor.

Probele de ser care nu pot fi testate imediat vor fi depozitate la 2-8 ⁰C nu mai mult de 48 de ore sau inghetate. Probele inghetate la - 20 ⁰C sau mai jos raman stabile 2 ani. Cu toate acestea evitati inghetarea/dezghetarea repetata, fiind recomandat ca probele sa fie inghetate in volume mici si apoi depozitate inghetate. Evitati congelatoarele frost free.

Serurile trebuie separate de hematii cand sunt stocate sau trimise catre alt laborator.

Particulele sau agregatele din probele de ser pot cauza reactii fals pozitive sau valori discordante intre duplicate. Probele ce contin particule trebuiesc clarificate prin centrifugare inaintea testarii.

Numai serul uman total este potrivit pentru acest test. Dilutiile anterioare probelor in orice altceva decat ser uman negativ pot afecta rezultatele.

Probele contaminate microbian, hemolizate, lipemice, icterice sau inactivate prin caldura pot da rezultate incorecte si vor fi evitate.

PROCEDURA

Materiale furnizate

1. 2 rame cu microgodeuri, fiecare continand 12 stripuri x 8 godeuri cu cod de culoare
2. 1 x 125 ml solutie de spalare concentrata
3. 1 x 30 ml diluent pentru proba
4. 1 x 30 ml tampon substrat
5. 1 x 30 ml solutie de stopare
6. 1 x 160 µl conjugat anti-IgG uman
7. 1 x 30 ml diluent pentru lizat si conjugat
8. 1 x 2.5 ml tampon pentru liza limfocitelor
9. 1 x 14 µl reactiv martor lizat (clasa I)
10. 1 x 14 µl reactiv martor lizat (clasa II)
11. 1 x 50 µl martor limfocite deshidratat
12. 6 x 50 mg substrat PNPP
13. 1 x 450 µl ser martor pozitiv
14. 1 x 700 µl ser martor negativ
15. 18 sigilii pentru placute
16. 2 foi de inregistrare (raportare a rezultatelor) (clasa I)
17. 2 foi de inregistrare (raportare a rezultatelor) (clasa II)
18. 2 fise de lucru pentru calculul lizatului

Materiale necesare nefurnizate:

1. Eprubete

2. Pipete de transfer si pipete ajustabile: 1-10 µl, 10-100µl si 100-1000 µl si varfurile aferente

3. Cronometru

4. Cititor elisa cu filtru de masura: 405 sau 410 nm si 490 nm

5. Apa distilata sau deionizata

6. Centrifuga

7. Incubator la 37 ^oC sau baie de apa.

8. Mediu pentru cultura celulelor complet (RPMI, Hank's Balanced salted solution)

9. Ficol sau mediu pentru separare pe baza densitatii

10. Gheata

11. Hartie absorbanta

Aceasta procedura este divizata in 2 parti principale: Prepararea lizatului si Modul de lucru.

Sugestii utile:

1. Martorul lizat si lizatul de la donator pot fi preparate inainte si pot fi congelate la -80⁰ C. Daca lizatul de control si cel de la donator au fost anterior preparate, treceti la "Modul de lucru".

2. Pentru monitorizare post-transplant, pastrati proba de ser pre-transplant pentru scopuri comparative.

3. Pentru fiecare lizat de la donator utilizat in test, un martor negativ si un martor lizat (lizat de control) trebuie incluse in test

4. Martorul pentru reactiv (serul martor pozitiv) trebuie inclus in fiecare test.

Prepararea lizatului (martorul limfocite deshidratat si lizatul de la donator)

1. Rehidratarea martorului limfocite deshidratat

Rehidratati DLC adaugand 500 ul de mediu de cultura complet la butonul de celule liofilizat

Lasati sa stea la temperatura camerei cel putin o ora.

Desfaceti butonul de celule cu ajutorul unui varf de pipeta pentru a obtine o suspensie celulara uniforma

Centrifugati amestecul la 1000-1500 rcf pentru 5 minute pentru separare.

Lasati supernatantul pe celule pana cand celulele sunt lizate

2. Izolarea celulelor de la donator
• Limfocitele pot fi separate din sange integral sau splina
• Sagele total sau splina trebuiesc procesate in 72 de ore

Sangele integral:

a)      Daca utilizam sange total, asterneti-l pe ficol sau mediul de separare pe baza de densitate si centrifugati la 1000-1500 rcf pentru 15-20 minute. Colectati stratul de celule de la interfata cu ficolul (sau mediul de separare). Incercati sa minimizati numarul de hematii din preparat. Daca preparatul de celule nu va fi utilizat pentru a detecta anticorpii pentru clasa II, vor fi recoltate si plachetele din stratul de deasupra interfetei.

b)      Transferati suspensia in tuburi mai mari si centrifugati la 1000-1500 rcfm pentru 5-10 min pentru a se separa celulele. Indepartati supernatantul.

c)      Adaugati un volum de mediu de cultura complet egal cu cel putin 5 ori volumul butonului de celule. Resuspendati celulele usor

d)     Centrifugati celulele pana se formeaza un buton si indepartati supernatantul (prima spalare)

e)      Repetati c) si d) pentru un total de 3 spalari

f)       Dupa spalarea finala, lasati supernatantul cu celulele pana celulele sunt lizate

Splina:

a)      Pentru a prepara limfocitele din splina, macerati tesutul in particule mici, suspendati in mediu complet de cultura, suspendati in ficol (sau mediu de separare pe baza de densitate) si centrifugati la 1000-1500 rcf pentru 15-20 minute. Colectati stratul de celule la interfata cu ficolul (sau mediului de separare).

b)      Transferati suspensia intr-un tub mai larg si centrifugati la 1000-1500 rcf pentru 5-10 minute pentru a se aduna celulele. Indepartati supernatantul.

c)      Adaugati un volum complet de mediu de cultura egal cu cel putin 5 ori volumul celulelor. Resuspendati usor celulele

d)     Centrifugati celulele pana se formeaza un buton si indepartati supernatantul (prima spalare).

e)      Repetati c) si d) pt. un numar total de 3 spalari.

f)       Dupa spalarea finala lasati supernatantul pe celule pana celulele sunt lizate.

3. Calcularea numarului de celule.

a)      Notati pozitia fiecarei probe de ser de testat utilizand fisele de inregistrare (clasa I si clasa II).

b)      Completati primul calcul in foaia de calcul pentru lizatul pentru a determina cantitatea de lizat diluat necesar.

c)      Completati al doilea calcul pentru a determina volumul de lizat nediluat necesar pentru stripurile clasa I.

d)     Completati al doilea calcul pentru a determina volumul de lizat nediluat necesar pentru stripurile clasa II.

e)      Pentru al 4-lea calcul adaugati volumul de lizat clasa I la volumul de lizat clasa II, obtinand volumul total de lizat nediluat necesar.

f)       Folositi ultimul calcul pentru a determina volumul de celule de preparat.

g)      Inregistrati toate dilutiile si calculele pe fisa de lucru.

4. Prepararea lizatului

a) Transferati volumul cerut de celule ale donatorului prin una din urmatoarele 2 metode:

Metoda 1

• Separati supernatantul de butonul de celule spalate
• Adaugati un volum egal de mediu de cultura complet la butonul de celule pentru a realiza o suspensie 50%.
• Agitati bine si transferati de 2 ori volumul de celule necesar (calculat in etapa 3 de mai sus) intr-un tub.
• Centrifugati suspensia de celule la 1000 - 1500 rcf 5-10 minute pentru a obtine o suspensie ce contine volumul cerut de limfocite.

NOTA: Etapa de centrifugare este critica, nu schimbati numarul de rotatii la centrifugare.

• Volumul de celule poate fi verificat adaugand un volum egal de apa intr-un tub identic si masurand volumul de apa.

Metoda 2

• Alternativ numarati limfocitele si transferati (utilizand urmatorul tabel ca ghid) numarul de celule adecvat intr-un tub de polipropilena. Centrifugati la 1000-1500 rcf timp de 5 minute pentru a obtine un buton de limfocite. Indepartati supernatantul.

b) Diluati tamponul pentru liza limfocitelor 1 la 10 in apa distilata sau deionizata. Pentru fiecare 100 μl limfocite de lizat, preparati 1.0 ml tampon diluat de liza adaugand 100 μl tampon de liza in 900 μl apa distilata sau deionizata. Depozitati tamponul diluat de liza in gheata pana la 4 ore.

NOTA: Tamponul de liza a limfocitelor este vascos. Clatiti varful de 2-3 ori in tampon de liza a limfocitelor inainte de dispersare si clatiti dupa adaugarea apei distilata sau deionizata. Agitati bine.

NOTA: Nu depozitati tamponul diluat de liza a limfocitelor pentru o viitoare utilizare.

c) Indepartati supernatantul din preparatul de limfocite ale donorului si din martorul limfocite liofilizat (DLC). Din nou, volumul de celule poate fi verificat adaugand un volum egal de apa intr-un tub identic si masurand volumul de apa.

d) Pentru fiecare 10 μl celule de la donator sau martor limfocite liofilizat (DLC) adaugati 100 μl tampon diluat de liza a limfocitelor. Agitati bine cu ajutorul unei pipete si prin vortexare pentru a resuspenda complet celulele. Centrifugati amestecul la la 1000-1500 rcf pentru 3-5 minute pentru a sedimenta membranele celulelor. Transferati supernatantul intr-un tub curat etichetat.

NOTA: Pentru a reduce efectul negativ al proteazelor asupra glicoproteinelor HLA, lizatele de limfocite vor fi tinute fie la 2-8 grade Celsius sau preferabil in gheata pentru o scurta perioda de timp, nu mai mult de 4 ore. Inghetati rapid orice rest de limfocite de la donator nediluat sau martor lizat in cantitati mici (o singura utilizare) in tuburi sigilate si etichetate la -70 ^oC, -80 ^oC pana la 2 ani. Daca este folosit lizatul inghetat, dezghetati o "portie" chiar inainte de utilizare si diluati dupa cum este descris in etapa 4 a modului de lucru (vezi mai jos) . Nu congelati lizatul a doua oara.

Modul de lucru

1. Aduceti toti reactivii la temperatura camerei (22-25 ^oC).

2. Preparati solutia de spalare de lucru diluand tamponul concentrat (TCW). Adaugati 1 volum de tampon concentrat in 9 volume apa distilata sau deionizata. Agitati bine.

3. Determinati numarul de probe de testat.

4. Diluati o cantitate adecvata de lizat de limfocite de la donator sau martor limfocite liofilizat in diluentul pentru lizat si conjugat (LCD), astfel:

a) Etichetati un tub: "Lizat donator clasa I". Preparati pentru stripurile clasa I, cantitatea necesara dintr-o dilutie 1 la 8 in diluentul pentru lizat si conjugat (LCD).

b) Etichetati un al doilea tub: "Lizat donator clasa II". Preparati pentru stripurile clasa I, cantitatea necesara dintr-o dilutie 1 la 4 in diluentul pentru lizat si conjugat (LCD).

c) Notati al treilea tub: "Martor limfocite liofilizat". Preparati o dilutie 1 la 4 adaugand 60 μl lizat din martorul de limfocite liofilizat la 180 μl diluent pentru lizat si conjugat (LCD). Acesta furnizeaza suficient lizat diluat pentru godeurile de control pentru reactiv pentru ambele stripuri:clasa I si clasa II.

5. Indepartati rama din punga. Scoateti stripurile necesare si resigilati stripurile ramase in punga protectoare.

NOTA: Numai 2 rame sunt furnizate in trusa. Nu le aruncati pana cand nu utilizati toate stripurile. Stripurile cand sunt asezate in rama trebuie sa aiba partea colorata in partea de sus.

6. Adaugati 50 µl lizat diluat de martor limfocite liofilizat la godeurile din ambele stripuri clasa I si clasa II desemnate ca martor pentru reactiv.

7. Adaugati 50 µl de lizat diluat de limfocite clasa I si clasa II ale donatorului in toate godeurile destinate probelor testati, martorului negativ si martorului lizat in fiecare din stripurile clasa I (albastru) si clasa II (purpuriu).

NOTA: daca se lucreaza mai multi pacienti in acelasi timp notati stripurile pentru a evita erorile.

NOTA: Nu adaugati lizat, probe sau reactivi in godeurile blank. Fiti siguri ca adaugati lizat diluat clasa I in stripurile albastre si lizat diluat clasa II in stripurile purpurii. Evitati adaugarea gresita a dilutiei pentru a evita obtinerea unui rezultat eronat.

8. Sigilati godeurile si incubati 30-35 de minute pe baie de apa la 37⁰ C. Daca folositi un incubator uscat cresteti timpul de incubare cu 10 minute.

PREPARATI PROBELE SI MARTORII

9. Diluati martorul pozitiv (PC), martorul negativ (NC) si serul pacientului 1:4 conform tabelului urmator si agitati bine.

NOTA: Aceste cantitati sunt suficiente pentru realizarea testarii a 2 godeuri clasa I si 2 godeuri clasa II.

10. Spalati de 3 - 4 ori cu 250  µl solutie de spalare / godeu.

11. Utilizand foaia de inregistrare ca ghid , adaugati probele diluate ale pacientului si martorii diluati in godeurile respective astfel:

a) Adaugati 50 µl de PC la godeurile martor pentru reactiv corespunzatoare din ambele stripuri, continand lizat din martorul limfocite liofilizat.

b) Adaugati 50 µl de NC in godeurile pentru martorul negativ corespunzatoare.

c) Adaugati 50 µl de diluent pentru lizat si conjugat in godeurile pentru martorul lizat din stripurile clasa I si clasa II. Acest lucru va preveni uscarea lor in timpul urmatoarei perioade de incubare.

d) Adaugati 50 µl de proba de pacient diluata in godeurile corespunzatoare , continand lizat donor din stripurile de clasa I si clasa II.

12. Sigilati godeurile si incubati 30 - 35 minute la 37⁰ C pe baie de apa. Daca folositi un incubator uscat cresteti timpul de incubare cu 10 minute.

NOTA: In timpul perioadei de incubare realizati urmatorii pasi:

13. Diluati conjugatul (AG) 1:100 in LCD dupa cum urmeaza:

NOTA: Conjugatul este vascos. Clatiti varful de 2 - 3 ori in conjugat inainte de dispersie si clatiti dupa adaugarea lizatului si conjugatului diluent. Agitati bine.

14. Diluati reactivii martor lizat (LCR1 si LCR2) in LCD dupa cum urmeaza:

Agitati bine.

NOTA: Masurarea cu acuratete a reactivilor LCR este importanta in obtinerea de valori acceptabile pentru martorii lizat.

15. Spalati de 3-4 ori cu 250 µl solutie de spalare.

NOTA: este foarte important sa se indeparteze complet solutia de spalare dupa ultima etapa.

16. Adaugati 50 µl/godeu martori lizat diluat in godeurile corespunzatoare pentru martorul:

a). Adaugati LCR1 diluat la stripurile de clasa I (albastre)

b). Adaugati LCR2 diluat la stripurile de clasa 2 (purpurii).

17. Adaugati 50 µl/godeu conjugat diluat (preparat anterior) in toate godeurile ramase mai putin in godeurile cu martori lizat si godeurile blank.

18. Sigilati godeurile si incubati 30 - 35 minute la 37 ⁰C pe baie de apa. Daca folositi un incubator uscat cresteti timpul de incubare cu 10 minute.

NOTA: In timpul perioadei de incubare realizati urmatorii 2 pasi:

19. Dizolvati substratul PNPP (PN) adaugand 0.5 ml apa distilata sau deionizata in fiecare fiola. Acoperiti fiola si agitati bine. Protejati de lumina pana la utilizare.

20. Diluati PNPP 1:100 cu tampon substrat (SB).

Agitati bine. Feriti de lumina pana la utilizare. Poate fi pastrat pana la 45 de minute la temperatura camerei (22 - 25 ⁰C) inainte de utilizare.

21. Spalati de 3-4 ori cu 250 µl solutie de spalare.

22. Se adauga 100 µl solutie PNPP diluata  in toate godeurile mai putin in godeurile blank.

23. Incubati 30 de minute la temperatura camerei (20-25 ^oC) la intuneric.

NOTA: Temperatura de incubare si temperatura dupa adaugarea PNPP sunt critice. Nu variati temperatura si timpul stabilit de incubare. Pentru siguranta incepeti cronometrarea de la adaugarea de reactiv PNPP in primul godeu.

24. Se adauga 100 µl solutie stopare (SS) in fiecare godeu in aceeasi secventa ca adaugarea substratului. Adaugati 200 µl solutie stopare in godeurile blank.

25. Cititi absorbanta la 405 - 410 nm utilizand ca filtru de referinta 490 nm. Daca rezultatele nu pot fi citite imediat tineti godeurile la intuneric pana la maxim 30 de minute.

26. Scadeti valorile obtinute in godeurile blank din godeurile probelor si martorilor. Multe cititoare ELISA sunt programate sa realizeze automat acest pas.

27. Inregistrati rezultatele pe fisa de inregistrare.

CONTROLUL DE CALITATE

Trusa contine seruri martor pozitiv si negativ si martor lizat pe baza carora se poate realiza controlul calitatii. Aceste controale trebuiesc incluse in fiecare determinare pentru a valida rezultatele.

Criterii pentru validarea testelor

Densitatile optice obtinute din testele duplicat nu vor fi validate daca au diferente mai mari de 20 % intre 2 valori. Probele ale caror rezultate sunt in afara acestor limite vor fi retestate.

NOTA: Duplicatele necorespunzatoare pot fi rezultatul omiterii reactivului sau probei , adaugarii necoraspunzatoare a reactivilor, temperaturii necoraspunzatoare in timpul incubarii, expunerii la lumina in timpul incubarii finale sau cross - contaminarii intre godeuri.

INTERPRETAREA REZULTATELOR

Rezultatele ce arata valori ale OD ≥ 2x media negativilor sunt pozitive.

LIMITE

Se pot obtine rezultate eronate in situatia contaminarii bacteriene a materialelor folosite in test, a perioadelor inadecvate de incubare, spalare inadecvata, in cazul expunerii substratului in lumina directa, omiterea unor reactivi, expunerea la temperaturi mai ridicate sau mai scazute decat cele specificate in procedura, sarirea pasilor.

Prezenta unor complexe immune sau a altor imunoglobiline in proba pacientului pot conduce la obtinerea unor rezultate fals pozitive.

Rezultatele acestui test nu trebuie folosite ca singura baza pentru decizia clinica.

Unii anticorpi cu titru scazut, cu afinitate scazuta pot sa nu fie detectati cu acest test.

Acest kit detecteaza numai anticorpii IgG.

PERFORMANTE SPECIFICE CARACTERISTICE

Pentru asigurarea reactivitatii si specificitatii potrivite, fiecare lot de AMS1+2 a fost testat inainte de comercializare, pe probe cunoscute ca avand anticorpi anti-HLA specifici pentru donator.

Evaluarea performantei

Sistemul AMS1+2 a fost evaluat independent in 2 laboratoare. Toate probele de ser au fost testate cu QUIKSCREEN (clasa I) si B-SCREEN (clasa II)pentru comparative. 219 probe au fost evaluate cu AMS HLA clasa I si 217 probe cu AMS HLA clasa II.

Acord: 94.1%

Acord: 85.1%

Fiecare din probele discrepante a fost testate prin citometrie de flux pentru a determina specificitatea anticorpilor. Probele care contineau anticorpi nespecifici pentru donator au fost excluse si datele ramase au fost reanalizate Rezultatele pot fi rezumate in modul urmator:

Acord: 99%

Co-pozitivitate: 98.2% (93.6% - 99.5%*)

Co-negativitate: 100% (96.2% - 100%*)

Marimea probei: 208

* calculate folosind intervale de siguranta 95%.

Acord: 96.3%

Co-pozitivitate: 90.9% (82.4% - 95.5%*)

Co-negativitate: 100% (96.7% - 100%*)

Marimea probei: 190

* calculate folosind intervale de siguranta 95%.

Precizia

Pentru a evalua precizia trusei AMS1+2, au fost realizate studii intra- si inter-testare. Evaluarea tuturor datelor s-a facut pe baza Protocolului pentru Evaluarea Performantei Testarii Calitative NCCLS: norma EP12-A aprobata. Datele au demonstrat 100% acord intra-testare (n=40), 100% acord de la o zi la alta (n=30) si 100% acord de la lot la lot (3 loturi, n=24).