Aplicatii ale colorantilor in biologia moleculara

APLICATII ALE COLORANTILOR IN BIOLOGIA MOLECULARA

In 1924, Policard a observat ca porfirinele se gasesc in concentratii mai mari in

Tumorile maligne decat in tesuturile normale. Asemenea porfirine sunt inofensive dar pot avea un efect foarte toxic pentru celulele in care ele sunt concentrate daca sunt expuse la lumina. In acest fel o tumoare poate fi distrusa prin aplicarea luminii, daca contine o concentratie relativ mare de porfirine.

Tesuturile normale, vecine supravietuiesc deoarece ele contin putina porfirina.

Apare astfel o noua terapie a cancerului, "terapia fotocromica" ce se bazeaza pe distrugerea selectiva a tumorilor prin intermediul injectiei intravenoase a o serie de coloranti fototerapeutici, urmata de expunere la lumina rosie. Concentratia marita a acestor coloranti in tumorile maligne poate fi de asemenea folosita pentru detectia cancerului daca sunt coloranti fluorescenti.

Principiul PDT a fost aplicat in jurul anilor 1930 (cand von Tappeiner si Jesionek) cand a fost tratata o tumoare de piele prin aplicarea Eosinei (1) si ulterior iradierii cu lumina alba.

Eosina se obtine conform reactiilor:

Sarea de sodiu are culoarea rosie cu fluorescenta verde.

In 1948 Figge si colaboratorii sugereaza utilizarea porfirinelor si metalporfirinelor pentru PDT a cancerului. In 1950 a fost utilizata hematoporfirina (2).

Hematoporfirina se obtine din hemina (hematoporfirina cu grupe -CH=CH₂ in loc de HO-CH-CH₃ si Fe) prin tratare cu acizi cand are loc eliminarea fierului si aditia apei la cele doua grupe vinilice.

Rezultate mai bune in introducerea PDT pentru tratamentul cancerului s-au obtinut numai in jurul anilor 1970 dupa aparitia pe piata a sursei de lumina laser si a fibrelor optice. Aceste instrumente au permis medicilor accesul direct la sursele de lumina pentru tratamentul tumorilor maligne.

Cercetarile in domeniu sunt in real progres. De exemplu 45% din compusii fotoporfirinelor au fost cunoscuti in 1989. Ester si eteroligomerii hematoporfirinei ca de exemplu (3) si (4) au fost cunoscuti in ultimul timp.

1.1.Mecanismul fotodestructiei

Etapa primara caracteristica a fotodestructiei este absorbtia unui foton de catre colorant ce produce un singlet cu stare excitata

1.1.1.Fotonica colorantilor

ASPECTE STRUCTURALE

Majoritatea sistemelor cromogene contin elemente structurale polimetinice (I) caracterizate prin prezenta unei catene constituita din N atomi X, X Y, apartinand grupelor IV, V, VI din tabelul periodic si a unui sistem format din N+1 electroni π.

Structura polimetinica ideala se caracterizeaza printr-0 distributie simetrica si o delocalizare maxima a electronilor π in catena, adica prin energie de rezonanta mare, intensitate de oscilatie mare, corelata cu benzi de absorbtie de lungime de unda mare, polarizabilitate optica intensa, egalizarea maxima a ordinelor de legatura si distributie alternanta pronuntata a densitatii electronilor π in stare fundamentala.

Alternarea distributiei densitatii electronilor π de-a lungul catenei confera polimetinelor reactivitate electrofila si nucleofila. De fapt, sistemele cromogene ar trebui reprezentate ca intermediari intre structurile limita polimetinice si aromatice, dependent de marimea energiei de rezonanta pentru elementele structurale implicate.

Trecerea de la o structura polimetinica la una aromatica sau polienica este insotita de diminuarea efectelor cauzate de alternarea densitatii sarcinii electrice si de polarizabilitateamare a polimetinelor.

Evident, se considera si eventualele modificari ale geometriei moleculare, corelate cu gradul de hibridizare a atomilor constitutivi, cu caracterul legaturilor implicate, cu efectele inductuve si de hiperconjugare, a interactiilor sterice intra si intermoleculare.

Geometria moleculara si distributia electronilor in substanteleorganice colorate atesta prezenta unor sisteme coplanare, stabilizate energetic datorita prezentei sextetului aromatic si a gruparilor structurale polimetinice. Perturbarea acestor sisteme ideale, consecinta a ramificarii sistemului conjugat sau a asimetriei fragmentelor polimetinice prin efecte de substituent, conduce la cuplarea elementelor structurale aromatice si polimetinice prin intermediul legaturilor polienice. Sunt posibile si interactiuni columbiene, ce determina modificari in alternarea densitatii de sarcina electrica.

Prezinta interes tratarea comparativa a elementelor structurale si a distributiei electronice din colorantii implicati in transferul de energie. Astfel, in colorantii triamino-trifenilmetanici (II) au fost identificate fragmente metincianinice ramificate.

Colorantii cianinici derivati din colorantii azometinici prin inlocuirea grupelor alchil de la atomii de azot marginali cu inele heterociclice: exemplu

Datorita ramificarii simetrice a sistemului de rezonanta polimetinica in pozitiile para, se remarca diminuarea aromaticitatii ciclurilor benzenice constitutive in favoarea caracterului polienic (doua legaturi centrale ale ciclurilor sunt mai mici).

In cazul colorantilor acridinici si triazinici au fost puse in evidenta structuri aza-polimetinice. Pentru percloratul de bis10-metil-acridin-9-monoaza-monometilcianinice (III) sunt caracteristice structuri aza-hepta-metinice, in timp ce albastrul de metilen (IV) corespunde unei structuri-aza-nonametinice.

Cationul colorantului acridinic III contine grupe metinice ramificate, precum si 4 cicluri aromatice (6π).

In structura IV se remarca elemente polienice (alternarea legaturilor simple si duble), datorita ramificarii sistemului carbociclic cu rezonanta polimetinica. In plus cele doua legaturi C-S sunt mai scurte decat legatura simpla C-S, ceeea ce indica o rezonanta metinica suplimentara, ce implica atomul de sulf. Aceasta structura favorizeaza agregarea intermoleculara a colorantului.

Derivatii flavinici colorati contin heterocicli condensati liniar si un nucleu fenilic, cromofori de acest tip fiind importanti pentru enzime si coenzime.

De exemplu 5-acetil-3,7,8,10-tetrametil-1,5-dihidroaloxazina (V) dispune, pe langa scheletul aromatic si de elemente structurale macrometinice.

Legatura C=C relativ scurta dintre cele doua inele heterociclice poate fi considerata ca parte constitutiva a unei structuri trimetinmezocianinice (mezocianinele sunt coloranti neionici, ce contin un sistem cromofor de forma >N-(C=C)_n-C=O↔>N+-(C-C=)_n-C-O^-) la care participa atomii de azot 1 si 5 si gruparea 2-carbonilica. Datorita efectului steric, rezonanta monometinica dintre gruparea 5-acetil si atomul de azot heterociclic este redusa.

Cromoforii porfirinelor (VI) si compusilor inruditi sunt polimetine cuplate ciclic, ce contin 18 electroni π, intr-o catena de 6 atomi.

Alternarea densitatii electronilor π conduce la conjugarea interna, ciclica si la proprietatile diamagnetice.

Structura polimetinica, dovedita prin difractie cu raze X, este confirmata de valorile medii ale lungimilor legaturilor din tetrametilporfirine (VII). Distante interatomice de acelasi ordin de marime sunt caracteristice pentru diferiti derivati porfirinici.

Legaturile C-N, de lungime egala, exclud posibilitatea localizarii a doi protoni sau a ionilor metalici la atomii de azot. Lungimea legaturilor in fragmentele trimetincianinice indica o structura polimetinica cu legaturi C-C de ~ 1,39 Å si distante C-N extinse, atribuite efectului de ramificare in ciclurile pirolice. Ramificarea determina caracterul polienic al celorlalte legaturi C-C din ciclurile pirolice, modificate la 1,44 Å in sensul legaturii simple si la 1,36 Å, in directia legaturii duble.

Planurile substituentilor fenil sunt rasucite cu un unghi de 90s fata de cel al ciclului porfirinic, astfel fiind impiedicata rezonanta dintre diferitele sisteme ciclice.

Legaturile specifice polimetinelor cuplate ciclic nu se regasesc, insa, in tetraoxoporfirinogen (VIII), unde predomina caracterul aromatic al ciclurilor pirolice, lungimea legaturilor fiind de ~1,40 Å.

Marirea in mica masura a legaturii C=O (1,23 Å) si micsorarea lungimii legaturii C-C (fata de 1,44 Å in ciclul porfirinic) indica o rezonanta redusa in sistemul macrociclic.

1.1.1.1.Starile electronice excitate

Reactivitatea si timpul de viata al starilor electronice excitate sunt determinate decontinutul energetic, respectiv de distributia sarcinii electrice, corespunzator tranzitiilor unielectronice intre diferite orbitale moleculare.

Comportarea fotofizica si fotochimica a compusilor organici se coreleaza deci, cu energetica intramoleculara, cu caile de populare a orbitalelor moleculare, cu valorile constantelor vitezelor de dezactivare a formelor excitate. Diagrama energetica a nivelelor electronice si vibrationale precum si a tranzitiilor posibile in compusii organici este data de figura 1.Explicarea si detalierea elementelor din figura 1 sunt prezentate in tabelul 2.

Starile electronice implicate in reactiile fotochimice ale colorantilor sunt ¹(ππ*), ³(ππ*), ¹(nπ*), ca si cele de transfer de sarcini ¹(CT) si ³(CT).

Starile ππ*, rezulta in urma tranzitiilor π*←π in sisteme polienice si aromatice, cu conjugare extinsa, caracterizandu-se prin moment de tranzitie paralel cu planul moleculei si absorbtii intense in domeniile vizibil si U.V. apropiat (ε_max.>10³l.mol.^-1.cm^-1). Banda de absorbtie poate fi deplasata batocrom in prezenta solventilor polari sau ca urmare a grefarii pe sistemul cromogen a unor substituenti electronodonori.

Compararea proprietatilor starilor ππ* singlet si triplet, indica probabilitatea mare a tranzitiei intercombinationale singlet-triplet, corelate cu delocalizarea pronuntata a orbitalilor in moleculele colorantilor.

Fig.1. Schema energetica a nivelelor electrono-vibrationale si a tranzitiilor fotofizice in compusi organici

Tabelul 2. Tranzitii electronice

Observatii:

1) In stare fundamentala, electronii sunt dispusi pe orbitali moleculari ocupati, spinii sunt antiparaleli, spinul total este S=0, iar multiplicitatea J=2S:+1=1 (stare singlet S₀).

2) In fotochimia colorantilor nu prezinta interes tranzitiile σσ*.

3) Starile electronice excitate triplet sunt consecinta reorientarii spinului electronic (S=1, J=3). Au energie mai mica decat starile singlet corespunzatoare. Se formeaza prin conversie intercombinationala pentru ca probabilitatea tranzitiei directe este neglijabila.

4) Timpul de existenta al starilor excitate singlet si triplet se determina pe baza relatiilor:

τ_S*1=1 =10^-9-10^-6 s;τ_T2=1 =10^-3 -10 s.

K_f1+K_S1T1+K_S1S2 K_fosf+K_T1S0

In cazul compusilor ce contin grupari >C=O, -N=N-, >C=N-, NO₂ etc. sunt posibile tranzitii π*← n datorita deplasarii electronilor neparticipanti de la N si O intr-un orbital de antilegatura π*. Benzile de absorbtie π*← n sunt localizate la lungimi de unda mai mari decat cele corespunzatoare tranzitiei π*← n sunt localizate la lungimi de unda mai mari decat cele corespunzatoare tranzitiei π*←π. Starile nπ* se caracterizeaza printr-un moment de tranzitie perpendicular pe planul moleculei, intensitate relativ mica (ε_max.<10³ l.mol^-1.cm^-1) mediul acid si solventii polari determinand o deplasare hipocroma a maximului de absorbtie. Datorita acoperirii spatiale mici intre orbitalii n si π* diferenta de energie intre starile 1(n π*) si 3(n π*) este mica, iar tranzitia singlet-triplet decurge cu viteza mare.

Starea ³(n π*) prezinta reactivitate mare comparabila cu cea a radicalilor liberi.

Pe de alta parte, prin insertia unei stari nπ* (prin intermediul substituentilor) intre starile electronice 1(nπ*) si 3(ππ*) se mareste probabilitatea tranzitiei intercombinationale, favorizata si de efecte de solvent.

Starile de transfer de sarcina sunt rezultatul unei deplasari intramoleculare in sisteme conjugate π-electronice, R, ce contin la extremitati grupuri electronodonoare, D, si electronoacceptoare A, avand una din formele: D⁺R^-A, DR*A^-, D⁺RA^-,DR*A.

In general, complecsi moleculari cum sunt cei ai nitroderivatilor aromatici cu hidrocarburile aromatice, se datoresc unei interactiuni covalente slabe intre electronii π ai componentei donoare de electroni (D: hidrocarbura aromatica) si cea acceptoare (A. Nitroderivatul)

DA ↔ D⁺ A^-

I II

Se caracterizeaza prin nivele singlet si triplet de energie apropiata, prin benzi de absorbtie intense (ε_max.>10⁴ l.mol^-1.cm^-1), situate la lungimi de unda mai mari decat cele corespunzatoare moleculelor ce contin un singur tip de substituenti.

Starile de transfer de sarcina prezinta un moment de dipol permanent si o deplasare batocroma a maximului de absorbtie sub actiunea solventilor polari.

In general, prin alegerea unor solventi adecvati, ca si prin grefarea anumitor substituenti pe sistemele cromogene, pot fi influentate proprietatile de absorbtie, tranzitiile electronice precum si reactivitatea fotochimica a acestora. O exemplificare interesanta poate fi oferita de derivatii porfirinici (tabelul4).

Derivati porfirinici

Aparitia unei benzi caracteristice in spectrul electronic al complexului se datoreste unei tranzitii electronice de la starea fundamentala la care contribuie mai mult I, la starea excitata, mai apropiata de II. Formarea complexului se explica prin interactiunea unui orbital de legatura ocupat din D cu un orbital de antilegatura vacant din A. Intrepatrunderea acestor orbitali duce la o stabilizare a sistemului si totodata la transferul unei sarcini negative de la D la A → complecsi de transfer de sarcina.

Clorine (clorofila)-produsi rezultati prin hidrogenarea unei legaturi duble din cicluri pirolice.

Bacterioclorine-produsi rezultati prin hidrogenarea a 2 legaturi duble in cicluri pirolice.

Azoporfirine-produsi in care puntile metinice sunt inlocuite cu atomi de N.

Benzoporfirine-produsi care contin 4 cicluri izoindolice legate prin punti metinice.

Ftalocianine-tetrabenzotetraazoporfirine.

Metaloporfirine-saruri complexe in care atomul de metal este legat de cei 4 atomi de N prin legaturi chimice echivalente.

Porfirinele prezinta spectre electronice similare caracterizate prin prezenta a patru benzi de intensitate mare (banda Soret) la limita U.V.-Viz. Benzile de absorbtie de lungime de unda mare sunt corelate cu tranzitiile ππ* din sistemul electronic extins al macrociclului tetrapirolic, pozitia si intensitatea relativa a acestora depinzand de natura substituentilor.

Pe de alta parte, tranzitiile ππ* in heterocicli cu azot corespund la λ≥310 nm, deplasarile batocrome fiind corelate cu prezenta unor legaturi de hidrogen intramoleculare.

Formarea metalporfirinelor conduce la modificari ale spectrului de absorbtie, care se caracterizeaza in domeniul vizibil prin doua maxime, precum si prin prezenta benzii Soret ingustata, cu pozitia putin modificata de complexare. Deplasarea batocroma mica a maximului de absorbtie

(~30 nm) determinata de natura metalului este insotita de micsorarea stabilitatii complexului in seria:

Pd>Pt>Ni>Co>Ag>Cu>Zn>Mg>Cd>Ca

Deplasarea hipsocroma a maximului de absorbtie, paralela cu cresterea stabilitatii matalporfirinelor, se datoreste interactiei slabe, prin legaturi σ, intre atomul de metal central si sistemul π electronic al ligandului.

Proprietatile optice ale metaloporfirinelor sunt corelate cu tranzitiile electronice intre doua orbitale superioare ocupate (a_1n, a_2n) si doua orbitale inferioare libere (e_gu, e_gy), precum si interactiile configurationale. Prin interactia configuratiilor a_1n.e_g si a_2n.e_g se formeaza o stare in care dipolmomentele de tranzitie se modifica si se reduc reciproc, ceea ce conduce la tranzitiile Q slabe (domeniul vizibil) si tranzitiile V intense (limita U.V.-vizibil).

Complexarea porfirinelor cu ioni metalici implica interactie dintre nivelele singlet-triplet ale ligandului si orbitalele d vacante ale metalului, fiind posibile doua cazuri (fig.2).

Fig.2. Interactiile intre nivelele singlet-triplet ale ligandului si orbitalele vacante ale metalului in metalo-porfirine.

In primul caz (fig.2a) orbitalele vacante d sunt dispuse mai sus decat nivelul liber e_gπ al ligandului, nu exista conditii pentru transferul electronului excitat pe nivelul d al metalului, fiind posibile, insa, tranzitii singlet-triplet. In cel de-al doilea caz (fig.2b), electronul de pe nivelele excitate S, T poate trece pe nivelele neocupate ale metalului, diferenta de energie intre nivelele d si π* fiind mica.

Influenta metalului asupra fotonicii metaloporfirinelor a fost pusa in evidenta in procesele redox fotochimice ale derivatilor ce contin diferite metale tranzitionale.

1.1.1.2. Fenomene de asociere

Asocierea moleculelor de coloranti si formarea unor agregate intermoleculare sunt de incontestabil interes teoretic si aplicativ servind la clarificarea unor aspecte legate de natura starilor electronice excitate si rolul acestora in procese chimice, biologice, fotochimice in energetica intermoleculara. Asocierea moleculelor de coloranti influenteaza proprietatile fotofizice ale acestora, cum ar fi pierderea capacitatii luminiscente si redistribuirea energiei de radiatie. Gradul si ordinul de asociere, ca si constitutia agregatelor depind de natura solventului, de structura si concentratia colorantului, precum si de temperatura. Procedeele de studiere a agregarii implica o serie de metode: difuziune, conductibilitate electrica, dispersia luminii, polarografie, rezonanta electronica paramagnetica, spectroscopie de absorbtie si fluorescenta.

Ca urmare a agregarii, in spectrele electronice ale colorantilor se produc trei categorii de modificari: ingustarea benzii de absorbtie principale (coloranti cianinici), micsorarea intensitatii absorbtiei (coloranti triazinici) si distributia benzii de absorbtie in doua sau mai multe componente (coloranti xantenici, acridinici si alti coloranti nonchinoizi).

Asocierea moleculelor de coloranti se produce in apa, solventi nepolari, sau amestecuri de solventi polari si nepolari.

In solventi polari, datorita unui puternic efect de solvatare agregarea colorantilor este posibila doar la concentratii mari. In toate cazurile, scaderea temperaturii solutiilor de coloranti intensifica asocierea. Problematica vasta a asocierii moleculelor de coloranti identici sau diferiti, in solventi unitari sau amestecuri, include:

-determinarea constantelor de asociere;

-elucidarea structurii geometrice a agregatului;

-stabilirea naturii si concentratiei combinatiilor asociate in solutie, in indicarea timpului si intensitatii fortelor de interactie.

O asociere deosebit de puternica se produce in solutii apoase

concentrate. Astfel, Scheibe a pus in evidenta complecsi ai colorantilor cianinici caracterizati printr-o absorbtie neta, intensa, la 574 nm a caror structura a fost explicata de Förster.

Modelul Förster postuleaza dispunerea stratificata, echidistanta a moleculelor plane ale colorantilor care face posibila compunerea oscilatiilor in faza. Intensitatea mare a noii benzi de absorbtie se coreleaza cu momentul rezultant al tranzitiilor, in timp ce latimea mica a acesteia, cu asigurarea simetriei de tranzitie de-a lungul axei combinatiei complexe. Aceasta stratificare ordonata a fost pusa in evidenta si la coloranti cianinici in solutii de apa-etanol, pe baza spectrelor U.V. si a celor de dicroism circular.

Prin marirea concentratiei colorantilor si micsorarea temperaturii, echilibrul dintre moleculele monomere si cele asociate se deplaseaza in sensul formarii asociatiilor, dupa cum s-a dovedit pentru solutii apoase de coloranti xantenici, coloranti tiazinici, amestecuri de coloranti acridinici si tiazinici.

Adaugarea de solventi organici la solutiile apoase ale colorantilor diminueaza tendinta de asociere.

Punctele de vedere referitoare la asocierea colorantilor in solventi organici polari sunt contradictorii, din cauza identificarii dificile a asociatiilor. De altfel, datorita solvatarii moleculelor de colorant, gradul de asociere este redus, iar spectrele de absorbtie ale speciilor monomere si asociate difera foarte putin.

Structura colorantului (cationic) este determinanta pentru formarea de asociatii in timp ce influenta contraionului (anionul) este neglijabila.

Studiul asociatiilor moleculelor de coloranti implica stabilirea numarului de molecule asociate si a constantei de agregare.

Determinarea dificila a acestor constante, direct din date spectrale, a condus la aplicarea unor metode grafice sau estimarii devierii de la legea Beer.

In majoritatea calculelor teoretice efectuate asupra agregatelor de coloranti se considera ca acestea au structura regulata, desi geometria asociatiilor este influentata de conditiile experimentale.

Determinarea geometriei combinatiilor complexe este conditionata de cunoasterea concentratiei asociatiilor in solutie. Aceasta marime poate fi obtinuta pe baza spectrelor de absorbtie, a determinarii masei moleculare medii numerice sau a dependentei de gradul de polimerizare si randamentul cuantic al luminiscentei.

Pe langa dimeri intensiv studiati, au fost puse in evidenta si alte tipuri de agregate.

Cunoasterea structurii geometrice a asociatiilor poate contribui la clarificarea naturii interactiilor dintre moleculele de coloranti prin forte van der Waals, legaturi de hidrogen sau forte hidrofobe.

Energia de atractie intre doua molecule identice, aflate la distanta mica cu maximul de absorbtie λ₀₁ este proportionala cu ~f²λ₀³,, fiind implicate forte van der Waals intre dipoli si cudrupoli sau cuadrupoli in diferiti solventi.

Dependenta dintre eficacitatea procesului de asociere, natura solventilor folositi si structura colorantilor a adus in atentie legaturile de hidrogen intre moleculele de colotanti ca atare sau prin intermediul puntilor de apa. De exemplu, in solutiile apoase ale colorantilor xantenici si trifenilmetanici asociatiile se realizeaza prin legaturi de hidrogen intre perechi de ioni: RN-H..A^-Rn⁺-R. De asemenea, se mentioneaza interactii prin legaturi de hidrogen in solutii apa-etanol si amestecuri binare de solventi polari sau nepolari. Pe de alta parte, agregarea moleculelor de coloranti poate fi influentata de interactia cu anionii inconjuratori, dupa cum poate fi conditionata de interactii hidrofobe.

Agregarea moleculelor de coloranti conduce, de obicei, la pierderea luminiscentei, totusi au fost pusi in evidenta complecsi fluorescenti ai acridin-oranjului (I), eosinei (II) si rodaminei (III).

Formarea agregatelor luminiscente in solutiile solorantilor se coreleaza cu modificari ale spectrelor de absorbtie si emisie. Astfel, benzile de emisie, deplasate batocrom sau hipsocrom dependent de natura solventului, devin mai late, iar gradul de polarizare a luminiscentei este mai mic decat pentru monomeri. Prin racirea solutiilor apoase de coloranti xantenici, poate aparea o noua banda de emisie deplasata batocrom. Fara a fi fost elucidate aspectele structurale si fotoenergetice, se pare ca formarea agregatelor luminiscente este consecinta distrugerii omogenitatii solutiilor concentrate de coloranti.

La asocierea moleculelor compusilor organici, nivelele excitate singlet sufera modificari importante in timp ce nivelele triplet doar mici deplasari ceea ce s-a verificat si in cazul agregatelor de coloranti.

1.2.Procese fotochimice in biosisteme

1.2.1.Fotocromism

Fotocromismul sau fototropismul consta in tranzitii reversibile induse de lumina, ce conduc la stari cu stabilitate cuanto-chimica, dar instabilitate termodinamica.

Fotocromismul implica urmatoarele modificari intramoleculare: tautomerie, ciclizare, izomerizare cis-trans, scindare hetero-sau homolitica, modificari conformationale, formare de agregate.

Fenomenul izomerizarii cis-trans fotoinduse a compusilor fotocromici este insotit de modificarea proprietatilor fizico-chimice, ceea ce poate servi la modelarea unor bioprocese cum ar fi fotoreglarea activitatii unor enzime, fotocromul, (cromoforul priodismului vegetal), inrudit structural cu pigmentii bilei, prin absorbtia radiatiilor de λ_max.=664 nm trece intr-un izomer care absoarbe in domeniul rosu indepartat (λ_max.=724 nm). Fotocromismul datorita deplasarii intramoleculere a doi atomi de hidrogen (tautomer), implica modificarea proprietatilor chimice ale proteinei asociate si se soldeaza cu efecte fotomorfologice in plante:

Rodopsina, pigmentul vederii, constitue un sistem fotocromic, ale carui transformari reversibile, induse de lumina, implica o izomerizare

cis-trans. In retina, rodopsina se gaseste sub forma unui complex al 11-cis-retinalului cu opsina. Sub actiunea luminii cis-retinalul se transforma in trans-retinal, ceea ce distruge compatibilitatea geometrica dintre poliena si proteina si conduce la descompunerea ropsinei.

La intuneric, sub actiunea retinen-izomerazei, se regenereaza rodopsina.

Spectrul de absorbtie al rodopsinei (solutie, pH=7, temperatura de 22,5sC) indica disparitia maximului de absorbtie de la 550 nm caracteristic complexului si aparitia unei benzi de absorbtie corespunzatoare trans-retinalului.

Deoarece nici poliena si nici opsina nu absorb in domeniul sensibilitatii maxime a ochiului (560 nm), se considera ca intre gruparea carbonilica a 11-cis-retinalului si gruparea aminica din lizina constitutiva a opsinei se formeaza un produs de condensare, de tipul bazelor Schiff, care prin protonare la azot conduce la o deplasare batocroma a absorbtiei (complexul).

Studiul spectroscopic si fotochimic al sistemelor model baze Schiff ale cis-retinalului cu n-butil-amina a pus in evidenta implicarea starii excitate triplet in fotoizomerizarea rodopsinei.

Au fost concepute sisteme model pentru rodopsina cu protonare intramoleculara a bazelor Schiff prin intermediul acizilor minerali, al acizilor organici sau al copolimerilor vinilici ce contin resturi de aminoacizi si cromofor N-(8'-Apocaroten-8'-iliden)-butilamina (XI).

Pe de alta parte, s-a examinat fotoizomerizarea unor polipeptide aromatice ce contin in molecule laterale azobenzen sau acid cinamic, pentru simularea modificarilor conformationale ale opsinei.

Astfel, s-au inregistrat inversari, induse de lumina, ale elicei polipeptidice la un continut mai mare de 50% cis-azobenzen in copolimeri ai β-benzil-L-aspartanului cu β-p-(fenilazo)-benzil-L-aspartanului (XII).

Participarea clorofilei in procesul de fotosinteza si regenerarea sa rapida se pot corela cu fotocromismul structurii [18]-anulenice.

Aceasta confera moleculei proprietati electronodonoare si electronoacceptoare, ca si reactivitate redox argumentata de prezenta metalului in structura complexului.

Efectul fotocromic al sistemelor donor-acceptoare in care se formeaza complecsi cu transfer de sarcina este conditionat de formarea ionilor in mediu polar, la excitare monofotonica, in domeniul benzii de transfer de sarcina.

Pe de alta parte, au fost concepute sisteme fotocromice redox, sub forma unor copolimeri care contin ca oxidant un colorant triazinic, iar ca reducator un derivat etanol-aminic (XIII):

Particularitatile fotocromiei polimerilor sunt determinate sunt determinate de limitarea mobilitatii fotocromice incluse in structura macromoleculara, de modificarile conformationale si de polaritatea comonomerului, fiind net diferentiate comportarile in stare solida, de cele in solutie.

Fotocromismul solutiilor de copolimeri ai stirenului si metacrilatului de metil cu spirospirani in solventi cu polaritate mica se deosebeste mult de cel al spirospiranilor datorita influentelor polare si sterice ale structurii macromoleculare.

In cazul polielectrolitilor ce contin grupari fotocromice azoice, modificarea conformatiei polielectrolitului, determinata de izomeria cis-trans a cromoforului, in functie de pH-ul solutiei cu constanta vitezei de reactie la intuneric.

Comportarea fotocromica a cromoforilor inclusi in polimeri solizi (materiali) depinde de structura fizica a acestora, fiind diferita de cea a copolimerilor cu grupe fotocromice legate covalent.

Pe langa aplicarea polimerilor fotocromici in realizarea

Elementelor-memorie pentru calculatoare, a filtrelor de lumina cu densitate variabila, a dispozitivelor de obtinere a imaginilor, este deosebit de interesanta si utilizarea lor ca elemente ale modelarii unor bioprocese fotoperiodice.

1.2.2. Reactii de oxido-reducere

Moleculele fotoexcitate prezinta energie de ionizare scazuta si afinitate electronica mare, ceea ce determina capacitate de reducere in interactiile cu acceptorii de electroni, ca si o tendinta sporita de oxidare, fata de donorii de electroni. Aceasta modificare a proprietatilor redox in stare excitata comparativ cu starea fundamentala constitue forta motrice a multor reactii fotochimice in solutie. Astfel, in acest mediu se poate realiza fotoreducerea sau fotooxidarea colorantilor, etapa preliminara fiind fotoexcitarea la starea triplet, randamentul de formare al acesteia fiind influentat de fenomene de agregare.

In general, sistemele cromogene cu tendinta mai mare de oxidare decat de reducere sunt cele care prezinta o stare ³(π,π*) ca cea mai joasa stare excitata, cum ar fi colorantii acridinici, xantenici, tiazinici, unele porfirine si riboflavina.

Sistemele cromogene cu stare ³(π,π*), ca cea mai joasa stare excitata, cum sunt colorantii antrachinonici si policiclocetonici, se caracterizeaza prin reactivitate marita fata de donorii de hidrogen.

Comportarea fotochimica a sistemelor cromogene poate fi modificata prin introducerea anumitor substituenti in structurile mentionate care schimba natura celei mai joase stari excitate sau conduce la intermediari intramoleculari cu viata scurta.

Factori ca: natura solventului, prezenta agentilor oxidanti sau reducatori, a donorilor sau acceptorilor de electroni a compusilor tensioactivi, electrolitilor sau polimerilor, influenteaza mecanismul reactiei redox si natura produsilor rezultati.

Reactiile de oxido-reducere constau intr-un transfer de electroni intre doi compusi A, B, ce conduc la stabilirea unui echilibru in solutie:

Majoritatea proceselor redox implica hidrogenare sau dehidrogenare sensul si intensitatea fluxului de electroni fluxului de elctroni depinzand de afinitatile relative pentru electroni ale celor doua sisteme, caracterul oxidant sau reducator se estimeaza pe baza proprietatilor redox.

1.2.2.1. Fotoreducere

Reducerea fotochimica a sistemelor cromogene, D, implica doua trepte unielectronice, cu formarea semichinonei si respectiv a leucoderivatului, dependent de variatia energiei libere ΔG si a energiei libere de activare ΔG*. Acest lucru s-a dovedit prin spectroscopie electronica, potentiometrie si rezonanta electronica paramagnetica.

Starea reactiva care se fotoreduce este o stare triplet (iar reactia in solutia este de ordin pseudounu).

Colorantul in stare redusa prezinta tendinta de a ceda electroni si de a trece in stare oxidata. S-a constatat accelerarea reducerii

(la sistemul: albastru metilen-acid ascorbic sau L-cisteina), in prezenta agentilor tensioactivi cationici, efectele micelare depinzand de pH-ul mediului si de prezenta electrolitilor.

Rezultatele pot fi interpretate prin modificarea starii de disociere a substratului pe suprafata micelui la legarea leucoderivatului.

Acest model redox simuleaza conditiile enzimatice, deoarece structura micelara, datorita asociatiilor dintre agentii tensioactivi, prezinta proprietati similare cu cele ale prteinelor sferice.

1.2.2.2. Fotooxidare

Mecanismul fotooxidarii in solutie este conditionat de concentratia speciei cromogene D si a agentului oxidant.

La concentratii mici de colorant (≤10^-5 mol.dm^-3) si solutii saturate cu aer ([O₂])≈2,5x10^-4mol.dm^-3), fotooxidarea implica un mecanism D-O, adica un transfer de electroni de la colorantul excitat la agentul oxidant, cu formarea unui radical al colorantului semioxidat si o molecula de oxigen semiredusa:

Astfel de radicali semioxidati au fost pusi in evidenta, de exemplu, pentru colorantii xantenici halogenati (XIV):

La concentratii mari ale colorantului, fotooxidarea urmeaza un mecanism D-D in care etapa determinanta este transferul de electroni intre starea triplet a colorantului si starea fundamentala a acestuia cu formarea unor radicali semioxidati si semiredusi:

Astfel la fotooxidarea eosinei s-au decelat spectroscopic o forma semiredusa (λ_max.=405 nm) si o alta (λ_max.=462 nm).

In procesul de fotooxidare este posibila formarea unui intermediar periodic D.O₂, iar procesul se poate solda cu formarea de H₂O₂:

Colorantul oxidat poate la randul sau oxida alte substante, prin transferul oxigenului activat din intermediarul peroxidic sau prin deplasarea de elctroni, el revenind la starea sa fundamentala.

1.2.2.3. Procese redox biologice

Energia necesara proceselor biologice, inmagazinata in special in ATP (adenozin trifosfat), provine din participarea ADP in procese oxidative cum ar fi: ciclul acizilor tricarboxilici, transferul de electroni si protoni in lantul enzimelor redox, dehidrogenarea unor substraturi.

Schimbul de electroni si protoni in procesele de oxido-reducere biologice este asigurat, indeosebi, de piridin-nucleotide (si de sistemul pteridinic, datorita transformarilor redox reversibile).

Nicotin-amid-adenin dinucleotida (NAD) si nicotin-amid-adenin dinucleotid-fosfatul (NADP) sunt coenzime pentru dehidrogenaze, in structura flavin-enzimelor-flavoproteine.

In piridin-nucleotide transferul hidrogenului se produce la nivelul nucleului piridinic, concomitent cu modificarea proprietatilor de absorbtie a luminii, forma redusa prezentand un maxim de absorbtie la 340 nm:

Riboflavina este coenzima flavoproteinelor, fie sub forma de

6,7-dimetil-9-(D-l'-sibitil)-izoaloxazin-5'-fosfat (FMN), fie sub forma unei combinatii fosfodiesterice (FAD) intre flavin-mononucleotida (FMN) si adenin-nucleotida.

Transferul hidrogenului de catre flavin-enzime (in forma oxidata de culoare galbena) implica nucleul izoaloxazinic si determina o modificare a absorbtiei in domeniul 450-460 nm:

Sistemul enzimatic redox permite distribuirea economica a energiei la nivelul celular, datorita asigurarii transmiterii in lant a protonilor, electronilor si altor particule cu sarcina electrica, potentialul redox crescand pe masura avansarii in ciclu.

Tendinta de autooxidare a FMN-H2, corelata cu valoarea mica a energiei celei mai inalte orbitale moleculare ocupate, confera flavoproteinelor rolul de forta motrice in lantul de transfer al electronilor.

Procesele redox biologice presupun o redistribuire a orbitalelor moleculare, formei oxidate, a coenzimei riboflavinice corespunzandu-i cea mai mica valoare a energiei celei mai joase orbitale moleculare libere, iar formei reduse ii corespunde cea mai mare valoare a energiei celei mai inalte orbitale moleculare ocupate. Acceptarea unui electron de catre forma oxidata a FMN determina o marire a energiei de delocalizare in ciclul izoaloxazinic de 37,8 Kj/mol.

Desi procesele redox biologice sunt considerate bielectronice, flavinele participa la reactii unielectronice care implicaintermediari oxidati sau redusi, ca si flavosemichinone. Acestea au rol de donori sau acceptori de electroni, care constitue centri de legare uni - sau dielectronici in lanturile de transfer de electroni.

Reactivitatea flavinelor in procese redox se coreleaza, de asemenea cu formarea complecsilor cu transfer de sarcina si cu fenomenul de fotosensibilizare.

Reactiile redox reversibile, cu participarea structurilor heterociclice condensate, similare nucleului aloxazinic, susceptibile de reactii cu precursorii nucleotidelor si polizaharidelor sunt esentiale pentru procesele biologice.

1.2.2.4.Anion-radicalul de oxigen in procese biochimice

Anion-radicalul de oxigen, O₂.^-, participa la reactii de protonare si transfer de electroni. El este implicat in reactii redox enzimatice ca interactia hemului cu oxigenul, mecanismul fagocitozei, biosinteza prostaglandinelor, reactiile catalizate de ceruloplasma. El se formeaza prin fotoreducerea unielectronica a oxigenului cu flavine, coloranti xantenici, tiazinici sau acridinici.

1.2.2.4.1.Participarea O₂.^- in procese redox enzimatice

Interactiile dintre transportori de electroni in sistemul xantin-oxidaza-flavinadenin-dinucleotida (FAD), indica oxidarea coenzimei reduse in doua etape: prima, rapida, presupune reactia oxigenului cu flavina si transferul a 5 electroni, iar cea de-a doua, lenta, implica transferul unui electron prin interactia oxigenului cu ferredoxina.

Dupa cum se vede, flavoproteinele reduse pot reactiona cu oxigenul dand compusi peroxidici care se descompun cu formare de flavosemichinona si O₂.^- compusi ce pot rezulta si dintr-un complex cu transfer de sarcina.

Anion-radicalul de oxigen este dezactivat de superoxid-dismutaza, enzima ce contine un metal cu valenta variabila (Cu,Mn, Fe), pe baza unui mecanism redox ca si pe baza coordinarii O₂.^- la atomul de metal, ca donor de protoni servind resturile de imidazol ale enzimei constitutive:

E-Cu²⁺ + O₂.^- → E-Cu⁺ + O₂

E-Cu⁺ + O₂.^- + 2H⁺ → E-Cu²⁺ + H₂O₂

1.2.2.4.2. Implicarea O₂.^- in reactii redox ale complecsilor macrociclici ai metalelor

Interactia complecsilor porfirinici (P) ai fierului cu oxigenul poate fi prezentata schematic in forma:

Hemoglobina (Hb) si mioglobina (Mb) formeaza complecsi oxidati stabili (HbO₂), MbO₂), in timp ce pentru citocromi nu au fost puse in evidenta forme oxidate stabile.

Structura complecsilor oxigenati ai hemului nu este elucidata, fiind posibile atat forma (A) cat si forma (B) dar mai probabil un echilibru intre acestea. Ionul superoxidic se poate forma la descompunerea complecsilor oxigenati ai hemului, reactia fiind favorizata de prezenta fenolilor, fenil-hidrazinei si menadionei. In reactiile cu agentii electrodonori O₂.^- este redus la HOO-, in timp ce acceptorii de electroni produc oxidarea unielectronica directa a oxihemoglobinei.

De interes deosebit si reactia O₂.^- cu citocromul C:

Citocromul C este o enzima izolata din drojdie.Contine drept grupa proteica un hem asemanator Hb.

Aceasta reactie se caracterizeaza printr-o viteza relativ mica si dependenta de pH a constantei vitezei de reactie, in corelatie cu modificarea conformatiei citocromului.

1.2.3.Fotosensibilizare

Actiunea fotosensibilizatoare a sistemelor cromogene, datorita proprietatilor redox, se coreleaza cu formarea starilor triplet cu eficienta cuantica mare, cu posibilitatea transferului energiei triplet, cu initierea unor procese reversibile induse de lumina in biosisteme, cu inducerea unor procese fotofizice si fotochimice de catre agregatele de coloranti in stare excitata.

1.2.3.1.Procese de transfer de energie

Fototransferul electronului in biosisteme poate fi descris pe baza teoriei benzii de conductie si a efectelor de transfer de sarcina

Migrarea starilor excitate singlet sau triplet, precum si transportul purtatorilor sarcinii electrice, determina transferul de energie, dependent de distanta dintre donorul si acceptorul din sistem.

Astfel, transferul de energie implica interactia dintre dipolii sarcinilor electrice ale moleculei fotoexcitate si ale celei acceptoare, daca acestea se gasesc la distanta de 60Å. Pe de alta parte, la distante mai mici de 15Å, transferul de energie presupune interactia noilor electroni ai moleculei excitate si acceptoare:

Pe langa transferul de energie ce implica starea triplet a donorului D si starea singlet a acceptorului A, este posibil si un transfer de triplet-triplet fie cu medii rigide, la temperaturi de 77K, fie cu solutie, in cazul in care procesul este controlat de difuziune, cand trebuie indeplinita conditia:

1 ≤ K_dif.[A]

τ_o

in care τ_o reprezinta timpul de existenta al starii excitate, K_dif. Constanta vitezei de difuziune a moleculelor in medii vascoase, la temperatura ambianta

(K_dif.=10^-10.l.mol^-1.s^-1) iar [A] concentratia acceptorului. Eficacitatea transferului de energie de la starea excitata triplet superioara a sensibilizatorului, la substrat depinde de multiplicitatea starii electronice a acestuia. Posibilitatea transferului de la nivelul triplet excitat al sensibilizatorului (donor de energie) la nivelul triplet al moleculei substratului (acceptorul de energie) este mai mare decat pentru transferul la nivelul singlet (corespunzator principiului spinului sistemului). Conditia energetica pentru formarea directa a starii priplet in solutii, in prezenta unui fotosensibilizator excitat, impiedica o valoare mai mare a energiei triplet a donorului decat a acceptorului. Se asigura astfel aditia energetica indeosebi in transferul intramolecular in sisteme bicromofore separate de catene de atomi de carbon, ca si in transferarea energiei liganzilor organici la unii ioni metalici.

1.2.3.2.Complecsi cu transfer de sarcina

Proprietatile complecsilor cu transfer de sarcina, corelate cu potentialul de ionizare si afinitatea pentru electroni ale componentelor donoare si acceptoare constitutive ale unui sistem se estimeaza pe baza energiilor celei mai inalte orbitale ocupate E_HEMO si a celei mai joase orbitale libere (E_LUMO).

Acestia prezinta spectre de absorbtie modificate, caracterizate prin asimetrie si latime relativ mare a benzii de absorbtie datorita energiei mici de legare a componentilor complexului. Flavinele sau complecsi cu transfer de sarcina cu bazele purinice si pirimidinice, banda de transfer de sarcina fiind situata in domeniul

400-500 nm.

Transferul de sarcina conduce la o stabilizare a semichinonei flavinei, formata in mediu reducator.

Purinele sunt donori de electroni mai puternici decat pirimidinele, cea mai mare capacitate electrodonoare caracterizand guanina. Pirimidinele au tendinta moderata de a accepta electroni, in timp ce purinele sunt acceptori slabi. Pe de alta parte, perechea de baze guanina-citozina poseda, conform calculelor cuanto-chimice, cea mai accentuata tendinta de a ceda si a accepta electroni.

Corelatia buna dintre potentialele de ionizare, respectiv energia celei mai inalte orbitale moleculare ocupate si constantele de asociere indica participarea sistemului de electroni π din purine la transferul de sarcina. Datorita dimensiunilor moleculare, bazele purinice prezinta o acoperire mai mare a orbitalelor donoare cu flavinele acceptoare decat pirimidinele si, implicit, valori mai mari ale constantelor de asociere.

Pe de alta parte, alchilarea gruparii 7-aminice din purina conduce la o marire a capacitatii de complexare cu riboflavina.

Formarea legaturilor de hidrogen in mediu apos mareste caracterul electronoacceptor al ciclului izoaloxazinic. Evaporarea solutiilor apoase echimolare de purina-roboflavina conduce la obtinerea complecsilor cu transfer de sarcina in stare solida, puternic colorati, cu modificari de absorbtie fata de flavina, complecsi implicati in reactiile de transfer de electroni si care constirue modele ale FAD.

Au fost pusi in evidenta complecsi cu transfer de sarcina ai triptofanului cu enzimele redox (FMN, FAD), la a caror formare contribue probabil si atractia columbiana intre cationul indolic si anionul izoaloxazinic.

Porfirinele formeaza complecsi cu transfer de sarcina atat cu donori, cat si cu acceptori de electroni, complecsi implicati in fotooxidarea sensibilizata si in fotosinteza.

Formarea complecsilor porfirinei conduce la modificari spectrale in special in solventi nepolari sau in stare solida. Complecsii cu transfer de sarcina ai sistemelor cromogene si ai bazelor azotate ar putea si implicati in structurarea informatiei la nivelul biosistemelor prin cooperare intermoleculara.

Conform teoriei Mulliken-Pearson, intr-un sistem constituit dintr-un donor de electroni (D) si un acceptor (A) se formeaza o legatura intermoleculara, prin interactii van der Waals (DA) si dative (D⁺-A^-), ce asigura transferul de electroni de la donor la acceptor si formarea unui dipol D^+δA^-δ in care δ este gradul de transfer de sarcina.

Starea triplet ³W a complexului cu transfer de sarcina formata dupa tranzitia electronului de la donor la acceptor, este dispusa, de obicei, la un nivel energetic superior starii singlet, cu exceptia complecsilor π-π.

Disocierea complecsilor donor-acceptor in ion-radicali este actul primar al unui proces complex, ce conduce la modificarea spectrului de absorbtie, dupa fotoexcitare in banda de transfer de sarcina, proces implicat in fotooxidarea sensibilizata si in fotosinteza.

Prezenta legaturii intermoleculare in complecsii cu transfer de sarcina elimina limitarea de catre difuziune a desfasurarii fotoreactiilor si asigurare prin ionizarea componentului donor fotoexcitat, posibilitatea folosirii unor radiatii electromagnetice din domeniul 250-1500 nm.

Aplicarea sistemelor cromogene in complecsii cu transfer de sarcina, corelata cu prezenta unor sisteme conjugate extinse, prezinta avantajul asigurarii unor deplasari spectrale in functie de modificarea dimensiunilor domeniului de conjugare. Astfel, trecerea din starea fundamentala in forma de cation sau anion a colorantului determina o deplasare batocroma, in timp ce transformarea in leucoderivati a colorantilor tiazinici si trifenil-metanici sau in forma lactonica a celor xantenici se soldeaza cu efect hipsocrom. Alegerea componentelor donor si acceptor de electroni se face tinand cont de domeniul sensibilitatii maxime la lumina in conditii diferite de fotoexcitare. Complecsii cu transfer de sarcina pot influenta configuratia biosistemelor prin modificarea conformatiei, unghiurilor si a direcsiilor dintre moleculele constitutive, dupa cum pot conditiona proprietatile semiconductoare ale biopolimerilor. Biosistemele bazate pe transport de elctroni (de exemplu fosforilarea oxidativa din mitocondri) se caracterizeaza prin stari inalt organizate, in care actioneaza un mecanism de transmitere a sarcinii electrice si de modificare a potentialelor redox prin intermediul unui lant de molecule, in care anumite parti functioneaza ca donori sau ca acceptori de electroni, pe masura formarii unor complecsi cu transfer de sarcina.

1.2.3.3. Reactii fotosensibilizate

1.2.3.3.1.Fotoreducere sensibilizata

Multi coloranti fotoexcitati se reduc in prezenta unor substraturi electrono-donoare (L-cisteina, alil-tioureea, acid ascorbic) sau a agentilor chelatizanti ce contin atomi de azot secundari sau tertiari (acid etilendiamino-tetraacetic), functionand in stare redusa ca fotosensibilizatori pentru alte reduceri.

Un aspect important in contextul modelarii sistemelor redox biologice este participarea la reduceri fotosensibilizate a complecsilor cu transfer de sarcina. Astfel este reducerea colorantului tiazinic albastru de metilen (AM) cu hidrocarburi dihidroaromatice (ZH₂), in prezenta unor hidrocarburi aromatice (Ar).

Ca dovada au fost remarcate noi benzi de absorbtie in domeniul 500-600 nm pentru complecsii cu transfer de sarcina in raport 2:1 intre coloranti si hidrocarburi aromatice. De asemenea, au fost semnale si in domeniul 600-650 nm pentru complecsii in raport 1:1 intre colorant si hidrocarburile dihidroaromatice (9,10-dihidroantracen, 9,10-dihidrofenantren, 4,5-dihiropiren), in solutie de 1,2-dicloretan si absenta oxigenului.

Un sistem model pentru coenzima FMN este oferit de reducerea albastrului de metilen (AM) cu acid ascorbic (AsH₂), in mediu de dicloretan, catalizata de complexul cu transfer de sarcina dintre 1,3-dimetil-aloxazina (DMA) si piren (P) in raport 2:1, in domeniul de pH 9-10.

Mecanismul probabil al reactiei presupune etape la care participa complecsi donor-acceptori ai colorantului si ai catalizatorului cu hidrocarbura aromatica.

Astfel de sisteme pot contribui la clarificarea actiunii coenzimatice a flavinelor si a intermediarilor de reducere.

1.2.3.3.2.Fotosensibilizarea sensibilizata

Fotooxidarea sensibilizata de sistemele cromogene D poate decurge prin transfer de oxigen sau prin reactia de extragere a hidrogenului.

1.2.3.3.2.1.Transfer de oxigen

Etapa preliminara a transferului de oxigen este fotoexcitarea colorantului la starea singlet si conversia la starea triplet a acestuia. Au fost propuse trei mecanisme pentru transferul de oxigen de la colorantul fotoexcitat la substrat.

In mecanismul Schönberg-Schlenk se considera ca specie reactiva complexul metastabil dintre colorant si oxigen.

³D + O₂ → [D.O₂] + A → D + AO₂

Kautsky-Egerton postuleaza ca procesul decurge in sisteme separate de coloranti si substraturi, fiind implicate specii volatile oxidate, conform interactiei D-O sau D-D:

³D + O₂ → D⁺ + O₂.^{- 3}D + D → D⁺ + D^-

D⁺ + A → D + A_OX D- + O2 → D + O₂.^- O₂.^- + H+ → HO₂

2 HO₂ H₂O₂ + O₂

Cel de-al treilea mecanism presupune prezenta unor specii activate de oxigen, datorita excitarii prin sistemul cromogen.

Determinari cinetice si de stereoselectivitate cu diferiti acceptori stabilesc ca specia reactiva este oxigenul singlet care se caracterizeaza prin energie de 22 Kcal/mol, electrofilicitate, tipm de existenta relativ lung si posibilitatea participarii la reactii bioelectronice, datorita unei orbitale vacante.

Fig.3.Nivele energetice ale moleculei de oxigen excitate

Astfel este reprezentativa succesiunea de reactii de fotooxidare sensibilizata caracteristica pentru biosisteme:

³D + ³O₂ → D + ¹O₂ (¹Δ_g)

¹O₂ (¹Δ_g) + A → AO₂

1.2.3.3.2.2.Reactii de extragere a hidrogenului

Sistemele cromogene chinonice in stare fotoexcitata ³(n,π*) constitue sensibilizatori pentru reactii de transfer de electroni sau de hidrogen (mecanism D-R), radicalul colorantului semiredus format intermediar revenind la starea fundamentala prin oxidare:

In absenta oxigenului, colorantul semiredus trece in leucoderivat, iar in absenta unui substrat poate surveni fotodistructia sensibilizata a colorantului.

Cei mai eficienti sensibilizatori (S) sunt cei ce formeaza stari triplet cu viata lunga si randament cuantic mare, vitezele de formare si dezactivare ale starilor excitate fiind prezentate mai jos:

Fig.4.Viteze de formare si dezactivare ale starilor excitate ale sensibilizatorilor

O astfel de comportare prezinta pigmentii naturali (clorofila, hematoporfirina, flavinele), colorantii tiazinici, xantenici, cetonici si unele hidrocarburi aromatice (antracen).

Reactiile de fotooxidare sensibilizata depind de conditiile de desfasurare, mecanismele D-D, D-O, D-R decurgand separat sau combinate. Directia reactiilor si natura produsilor sunt functie de concentratiile substratului, colorantului, oxidantului, de prezenta donorilor si acceptorilor de electroni, de raportul dintre vitezele de desfasurare a proceselor concurente sau consecutive, precum si de legarea colorantilor de structurile biopolimere.

S-au efectuat studii cinetice de formare fotosensibilizata a H₂O₂ si ionilor superoxid O₂.^- in solutia apoasa ce contine eosina, oxigen si EDTA, pe baza mecanismelor de initiere D-D, D-O, D-R. Astfel, s-au determinat constantele vitezelor de reactie, care implica intermediari D+..D- si D+.. O₂.^-, in prezenta oxigenului si EDTA (acid etilen-diamino-tetraacetic).

S-a remarcat o marire a randamentului de formare a H₂O₂ prin mecanism D-O, la adaos de borat sau carbonat de sodiu.

Studiul cinetic al oxidarii leucoderivatilor colorantilor trifenilmetanici (XV-XVIII) sensibilizata de perilen, indica posibilitatea modificarii spectrale cu utilizarea unor fotoni de energie joasa, in stare singlet in reactiile fotoredox, pe baza sensibilizarii transferului de electroni.

(XV) R=R'=N(CH₃)₂ (XVI) R=N(CH₃)₂, R'=H

(XVII) R=N(C₂H₅)₂, R'=H; (XVIII) R=NH₂, R'=NC₆H₅

X=H, CN

Acest sistem redox constitue un model pentru transferul de electroni la fotoreducerea CO₂ la acid oxalic sau formic, utilizand apa drept sursa de hidrogen.

De asemenea model pentru actiunea primara a clorofilei in sistem polimer si sensibilizator, al transferului de electroni, similar cu cel din pigmenti in fotosinteza.

1.2.3.3.3.Pigmentii naturali si fotosensibilizarea

Procesele de sensibilizare in biosisteme urmeaza o cinetica Stern-Volmer , care implica un intermediar activ, ce se poate consuma intr-o reactie monomoleculara sau poate reactiona cu alte combinatii, asemanator reactiilor enzimatice.

Tranzitiile conformationale produse de fotooxidarea sensibilizata in substraturile macromoleculare pot conduce la dezactivarea centrilor activi ai enzimelor. Un astfel de efect se manifesta in interactia tripsinei cu flavinele. Desi proprietatile riboflavinei difera de cele ale majoritatii fotosensibilizatorilor, s-a dovedit sensibilizarea oxigenului singlet cu sistemul model, ca si fotooxidarea sensibilizata a bilirubinei.

Pe de alta parte, un proces de fotooxidare sensibilizata de bilirubina prin iradierea tesuturilor la maximul de absorbtie al acesteia (450 nm) este implicat in tratamentul icterului.

Carotinoidele naturale asigura protectia de efectele nocive ale fotosensibilizatorilor (endogeni si exogeni), probabil datorita unui proces de transfer de energie de la oxigenul in stare singlet, favorizat de valoarea unica a energiei starii excitate triplet a polienei. Dezactivarea oxigenului singlet este controlata de difuziune, fapt dovedit de dependenta procesului de lungimea catenei polienice. Viteza de dezactivare este maxima pentru catene de 11-19 legaturi duble conjugate si devine neglijabila pentru un lant de 7 legaturi. Astfel, fotosensibilitatea din unele porfirine, provocata de acumularea in piele a protoporfirinelor, poate fi atenuata prin administrarea de β-caroten.

Carotinoidele protejeaza cloroplastele de distructia oxidativa, fotosensibilizata de clorofila, conform succesiunii de interactii prezentate in fig. 5.

Fig.5. Protectia cloroplastelor de distructie fotodinamica prin intermediul carotinoidelor

Probabil, transferul de energie de la oxigenul singlet (22 Kcal) presupune participarea carotinoidelor cu n ≥ 9 duble legaturi, in timp ce transferul de energie de la clorofila excitata (29 Kcal) implica carotinoide cu n ≥ 7 duble legaturi.

Directia si viteza transferului de energie in sistemul cloroplaste-oxigen-carotinoide depind atat de lungimea catenei polienice, care conditioneaza nivelul energetic triplet, cat si de concentratiile locale in oxigen si caroten.Fotosensibilizarea este implicata si in efectul fotodinamic.

1.3.Fotosinteza

Fotosinteza in plantele verzi presupune reducerea CO₂ si oxidarea H₂O, conducand la formarea de zaharuri si oxigen. In acelasi timp bacteriile fotosintetizante/substraturile care se oxideaza pot fi H₂S, H₂ sau donorii organici (succinat).

Radicalii liberi implicati in modificarile unielectronice induse de lumina mediaza conversia energiei electromagnetice in energie chimica. In acelasi timp radicatii liberi ce participa la reactii secundare (la intuneric), reflecta capacitatea biosistemelor de folosire a potentialului chimic pentru initierea unor reactii vitale (reducerea NADP, fosforilarea oxidativa).

Elucidarea mecanismelor de fotosinteza este conditionata de aplicarea spectroscopiei electronice, rezonantei electronice de spin (fotolizei de impuls), tehnicii impulsului laser, de studierea sistemelor model porfirinice, ca si a celor separate din centrii activi ai fotosistemelor.

1.3.1.Proprietati redox ale porfirinelor

Lantul transportor de electroni generat de clorofila in fotosinteza se coreleaza cu un proces redox.

Reactiile de oxido-reducere in solutie presupun formarea unui complex donor-acceptor, fiind posibile doua mecanisme de transfer de electroni si de descompunere a complexului.

in care P reprezinta derivatul porfirinic, iar A acceptorul de electroni.

Reactivitatea derivatilor porfirinici excitati este influentata de structura electronica a metalului central, de interactiile cu donori si acceptori de electroni, ca si de formarea extracomplecsilor.

In general, derivatii porfirinici ai metalelor tranzitionale nu urmeaza mecanismul (reactiei a doua de mai sus) pentru ca timpul de existenta al starii excitate triplet

este ≤ 10^-9 s, nefiind compatibil cu un proces controlat de difuziune. Reducerea fotochimica a complecsilor porfirinelor cu metale netranzitionale decurge in mai multe etape, presupunand formarea anion-radicalilor, ce au tendinta de protonare, cu producerea unei porfodimetene PH₂ (λ_max.=435-465 nm). Porfodimetena reactioneaza cu ioni hidroxil dand monohidroderivatul PH^-. (λ_max.=435-463 nm si 800 nm).

Final, prin oxidarea cu aer, la intuneric sau fotochimic, se reformeaza metaloporfirina. Pe de alta parte, pentru derivatii porfirinici ai metalelor din subgrupa aluminiului sunt caracteristice fotoreduceri multifotonice. In reactiile cu acceptori de electroni porfirinele manifesta proprietati π-donoare, dovedite de valorile mari ale constantei de echilibru a complecsilor cu transfer de sarcina. Pozitia benzii de transfer de sarcina se coreleaza cu interactiile din sistemul de electroni π-[18]-anulenic, un rol important revenind substituentilor din catenele laterale ale ligandului tetrapirolic.

In prezenta acceptorilor de electroni se micsoreaza intensitatea fluorescentei derivatilor porfirinici, fara semnalarea unor benzi noi de emisie. Pe de alta parte, interactiile porfirinelor cu donorii de electroni determina o deplasare a benzii de fluorescenta, fara afectarea spectrului de absorbtie.

Formele ion-radicalice ale pigmentilor tetrapirolici au reactivitate mare, cation-radicalii sunt oxidanti puternici, iar anion-radicalii au tendinta de protonare.

Reactivitatea marita a anion-radicalilor macrociclului tetrapirolic confera proprietati fotosensibilizante in prezenta sistemelor cromogene flavinice si trifenilmetanice.

A fost formulata si o ipoteza referitoare la sensibilizarea intramoleculara in procese redox fotochimice, conform careia la excitarea sistemului π electronic porfirinic se deplaseaza un electron, cedat de donorul prezent in sistem, pe orbitala vacanta d a metalului constitutiv. Functiile biologice esentiale ale metaloporfirinelor se coreleaza cu formarea unor extracomplecsi (XIX) cu liganzi (L) ca: apa, oxigenul, peroxidul de hidrogen, derivatii heterociclici cu azot, proteinele.

Formarea extracomplecsilor metaloporfirinelor este favorizata: cresterea sarcinii pozitive la atomul de metal, capacitatea mai mare electronodonoare si π-electronoacceptoare a liganzilor, diminuarea interactiilor de solvatare si acido-bazice ale extraliganzilor cu mediul, limitarea efectelor sterice. Extracoordinarea derivatilor porfirinici determina deplasarea benzii de absorbtie corespunzatoare tranzitiei π→π*.

Derivatii porfirinici si ftalocianinici constitue modele de interes biologic, precum si fotosensibilizatori potentiali in procesele de stocare a energiei solare.

1.3.2.Conditii energetice in fotosinteza

Cuanta de lumina absorbita de molecula de clorofila (Chl) deplaseaza un electron de pe nivelul fundamental pe un nivel excitat, de unde se produce transferul pe un nivel energetic inferior apartinand acceptorului (A) din sistemul de fotosinteza. Pe de alta parte, golul format pe nivelul fundamental al moleculei de clorofila este compensat prin cedare de electron de pe un nivel energetic superior, apartinand donorului (D) din sistem (fig.6). Astfel, in stadiul initial al fotosintezei se formeaza o pereche constituita dintr-un reducator (A^-.) si un oxidant D⁺, asemanator cu procesul de generare a electronilor si golurilor in semiconductori.

Reducatorul A^- se consuma intr-un lant complex de transformari catalitice, reducand CO₂ la zaharuri:

4A^- + 3H₂O + CO₂ → 4A + 1/6 (C₆H₁₂O₆) + 4HO^-

Oxidantul D⁺ participa la un ciclu de transformari, soldat cu oxidarea apei la oxigen molecular:

4D+ + 4HO- → 4D + 2H₂O + O₂↑

Fig.6. Nivele energetice si tranzitii posibile in fotosinteza

Astfel, procesul global de fotosinteza in plante poate fi prezentat sub forma unei reactii catalitice:

Variatia potentialului energiei libere Gibbs pentru reactia aceasta este de

ΔG≈120 Kcal/mol.. Realizarea ciclului de reactii prezentat reclama opt cuante de lumina, fiecare cu o energie de 40 Kcal/einstein.

Aprecierile teoretice arata ca intr-o reactie care presupune opt cuante de energie, coeficientul maxim de folosire a energiei este de 15%, valoarea relativ mica fiind corelata cu compensarea unor pierderi energetice in lanturi lungi de reactii redox biologice.

Clorofila, respectiv bacterioclorofila prezinta benzi de absorbtie in domeniul lungimilor de unda mari, deplasate batocrom datorita agregarii cu componente proteice.

1.3.3.Posibilitati de conversie a energiei solare in energie chimica

Conversia energiei solare in energie chimica presupune descompunerea apei cu formare de hidrogen, prin cuplarea unor procese endoenergetice si deplasarea echilibrului chimic in anumite stadii ale unui proces redox fotocatalizat.

In prezenta unor donori si acceptori adecvati, anumiti coloranti (acridinici, xantenici, tiazinici, trifenilmetanici si complecsi ai acestora cu metale tranzitionale) excitati in banda de transfer de sarcina, pot servi ca fotocatalizatori, similar clorofilei in fotosinteza. Excitarea in banda de transfer de sarcina si susceptibilitatea de modificare a gradului de oxidare asigura transformari multielectronice eficiente si procese redox reversibile. Energia ΔG acumulata de fotocatalizatorul colorant la absorbtia unei cuante de lumina este egala cu diferenta de energie dintre starile sale excitata si fundamentala.

Totusi, energia disponibila pentru transformarea urmatoare este mai mica datorita conversiei colorantului din prima stare excitata intr-o stare triplet, cu nivelul energetic mai scazut, dar cu timp de viata mai mare. Eficacitatea mecanismelor de fotodescompunere a apei este conditionata de asigurarea coordinarii sau adsorbtiei radicalilor H. Si HO. Ceea ce contribue la micsorarea energiei lor de formare.

Au fost concepute si realizate celule fotovoltaice bazate pe utilizarea diferitilor fotocatalizatori donori si acceptori bazate pe succesiunea modificata a proceselor de fotoexcitare si oxido-reducere, dovedindu-se avantajoase, sistemele micelare.