Biotehnologii de obtinere a aminoacizolor

Biotehnologii de obtinere a aminoacizolor

Plantele isi sintetizeaza aminoacizii din compusi anorganici simpli: CO₂, H₂O, NH₃. Animalele sintetizeaza aminoacizii prin sintetiza endogena in cazul celor neesentiali si exogena pentru cei esentiali: izoleucina, treonina, valina, metionina, triptofan, fenilalamina, leucina, izoleucina. La acestia se adauga cei 2 aminoacizi facultativi esentiali: histidina si arginina. Arginina ocupa o pozitia aparte, este foarte utilizat in industria farmaceutica si alimentara, deci cererea este foarte mare.

Necesitatea adaosului de aminoacizi in hrana se impune mai ales pentru marirea valorii nutritive a alimentelor de natura vegetala. Acestea sunt foarte sarace in aminoacizi esentiali: faina de porumb nu contine lizina si triptofan, iar gliadina din grau contine lizina in cantitati mici.

Aminoacizii sunt utilizati in alimentatie, furajare, medicina, cosmetica, industria chimica.

Folosirea aminoacizilor in alimentatie se bazeaza pe valoarea lor nutritiva, pe gust, proprietati chimice si activitatea biologica. Din totalul aminoacizilor produsi industrial in lume 66% provin din alimente, 31% din furaje, 4% din cosmetica, medicina, industria chimica.

Aminoacizii se pot obtine pe 4 cai:

1) Hidroliza proteinelor vegetale si animale; prin acest proces s-a obtinut L-glutamatul din faina de grau, soia sau din melasa. Astazi aceasta metoda nu este foarte des folosita, deoarece se folosesc cantitati foarte mari de materie prima (alimente);

2) Sinteza chimica; metoda este laborioasa, costisitoare si se obtin preparate racemice (amestec de 2 izomeri optici + si -) din care se separa antipozi optici (cu izomeri);

3) Biosinteza microbiologica;

4) Sinteza enzimatica.

Prin ultimele doua procedee se obtin compusi optic activi. Sunt folosite pe scara industriala si prezinta avantaje si dezavantaje.

Metoda microbiologica foloseste materie prima ieftina dar necesita timp. Aminoacizi trebuie separati de alti aminoacizi din mediul de impuritati (inclusiv cel microbian).

Sinteza enzimatica este rapida, eficienta si nu produce impuritati si deseuri dar se folosesc materii prime foarte scumpe. Substratul este un precursor sau o substanta inrudita chimic cu aminoacidul ce se doreste a fi sintetizat. Deoarece enzimele sunt foarte scumpe, metoda microbiologica este cea mai raspandita.

In 1955 japonezii au inceput studiul enzimatic al formarii aminoacizilor de catre microorganisme, folosind tulpini cunoscute sau nou izolate. Cele mai active producatoare de aminoacizi sunt bacteriile apartinand genurilor Microccocus, Mycobacterium Corynebacterium, Brevibacterium. In mediul de cultura se acumuleaza mai multi aminoacizi si doar rar cate unul. Cei mai frecventi sunt: glicocolul, alanina, serina, valina, leucina, acidul glutamic, acidul aspartic.

Pentru productia microbiologica de aminoacizi se respecta urmatoarele conditii:

stimularea sintezei enzimatice implicate si a activitatii lor;

stimularea potrivita in cel a substantelor nutritive care utilizeaza ca material de pornire in biomasa;

impiedicarea reactiilor secundare;

inhibarea activitatii enzimatice care produc degradarea aminoacizilor;

stimularea secretiei de aminoacizi in mediu.

Realizarea acestor deziderate s-a facut folosind mutageneza si prin cunoasterea mecanismelor de reglaj metabolice la nivel molecular.

Productia microbiologica de aminoacizi se realizeaza:

cu tulpini salbatice (prototrofe): acidul L-gluconic, L-valina, L-alanina, L-prolina;

cu mutante auxotrofe de aminoacizi: L-lizina, L-treonina, leucina, L-prolina;

cu mutante auxotrofe de biotina: acidul L-glutamic;

cu mutante regulatoare: L-lizina, L-treonina, L-arginina, metionina;

cu precursori de biosinteza: L-triptofan, L-fenilalanina, L-serina, L-histidina.

Factorii care influenteaza productia microbiologica de aminoacizi:

a) culturile microbiene;

b) mediul de cultura.

Culturile microbiene

In productia microbiologica de aminoacizi se folosesc mai ales mutante auxotrofe si reglatoare. Principiul folosirii acestor mutante: daca o cultura microbiana obtinuta pe cai folosind ramificatii complicate, mutantele produc in mediu doar aminoacizi care intereseaza. Deci ele pot fi auxotrofe de catre un aminoacid care este un intermediar cheie in calea biosintetica sau pot fi auxotrofe de un aminoacid obtinut prin una din caile de ramificatie.

In primul caz, cand aminoacidul cheie se afla in apropierea punctului de ramificatie, va fi blocata enzima care actioneaza:

A - compus intermediar comun

B - aminoacidul care ne intereseaza

C - aminoacidul cheie intermediar

D - aminoacidul obtinut pe calea ramificarii

enz - enzima cheie a transformarii din A in C

Ex.: Productia microbiologica de lizina - homoserina este primul aminoacid format pe calea ramificarii (C), iar mutantele auxotrofe de homoserina au blocat activitatea enzimelor (homoserin dehidrohenaza).

In al doilea caz, mutanta este auxotrofa de un aminoacid obtinut pe una din caile ramificarii si se va bloca activitatea enzimelor care catalizeaza formarea acestui aminoacid:

A - compus intermediar comun

B - aminoacidul care ne intereseaza

C - aminoacidul cheie intermediar

D - aminoacidul care se formeaza alaturi de B

enz - enzima cheie a transformarii din C in D

Stabilitatea genetica a culturii este o caracteristica importanta pentru obtinerea de productivitati mari. Testarea stabilitatii se poate constata exclusiv pe baza cresterii acesteia in lipsa substantelor pentru care ea este auxotrofa.

Mutantele reglatoare producatoare de aminoacizi si-au pierdut o anumita cale de reglare biochimica. Cele mai importante sunt cele rezistente la un analog al aminoacidului. Unii compusi au structura asemanatoare cu cea a aminoacizilor naturali si cu efecte inhibitoare asupra cresterii anumitor microorganisme. Aceste substante se numesc izosteri pentru a sublinia similitudinea stereochimica. Cei mai importanti izosteri sunt analogii aminoacizilor care functioneaza ca si inhibitori de tip feed-back sau inhiba incorporarea aminoacizilor in proteine.

Mediul de cultura

Sursa de carbon: cele mai bune rezultate le-au dat glucoza si zaharoza, dar din cauza pretului ridicat, se prefera melasa, insa aceasta trebuie testata, pentru ca poate contine substante inhibitoare. Sursa de azot depinde de caracteristicile nutritionale ale culturii. Microorganismele auxotrofe necesita saruri de sau sau hidrolizatele de proteina din faina de soia, seminte de bumbac.

Pentru obtinerea acidului glutamic si lizinei, ureea este sursa de azot ideala, pH-ul optim este intre 6 si 8, cel ideal fiind 7; temperatura este intre 25-37°C, dar cea optima trebuie testata experimental pentru fiecare proces in parte (ex.: pentru acidul glutamic este de 28°C). Aerarea: productia de aminoacizi are loc in mediu aerat.

Pe plan mondial prin acest procedeu se obtin urmatorii aminoacizi: lizina, treonina, metionina, acidul glutamic, triptofan. Cele mai mari companii ce produc aminoacizi apartin japonezilor. La noi prin acest procedeu se obtine lizina, acidul glutamic.

Biotehnologia obtinerii acidului glutamic

Sursele naturale sunt insuficiente si de aceea se obtin prin metode microbiologice.

Biosinteza din glucoza si microorganisme. S-a facut prima data in Japonia in 1956 cand s-a izolat un microorganism capabil sa produca glutamat intr-un mediu cu glucoza si . Aceste microorganisme Microccocus glutamicus prezinta caracterul genurilor Corynebacterium si Brevibacterium. De aceea azi se numesc Corynebacterium glutamicum. Mecanismul producerii glutamatului din glucoza si saruri de NH₄ este relativ simplu: glucoza este oxidata la acid citric, care pe calea ATC se transforma in α-cetoglutamat. Enzimele implicate sunt NADP dehidrogenaza in prezenta de   izocitratdehidrogenaza si L-glutamatdehidrogenaza:

In conditii aerobe se acumuleaza glutamat, iar in conditii anaerobe acid lactic.

Un alt factor care regleaza producerea de acid glutamic este cantitatea de biotina (vitamina H) din mediu: daca cantitatea este mare continutul de acid glutamic este scazut si invers.

Glutamatul de sodiu este sarea acidului glutamic. In alimente si tesuturi, acidul glutamic poate exista in 2 forme:

una legata , cand se leaga de alti aminoacizi pentru a forma proteine;

una libera; doar glutamatul liber joaca un  rol important in gustul mancarii.

Studii recente au aratat ca mancarea care contine glutamat este sursa principala de energie a intestinului. Tot glutamatul din mancare se converteste in intestin in glutamat liber. Glutamatul este utilizat in creier ca neurotransmitator.

Glutamatul apare in numeroase alimente: carne, peste, vegetale, cereale, sub forma legata, iar in cea libera: rosii, lapte, cartofi, sos de soia, branza. Ca aditiv este folosit in supe, sosuri, chipsuri.

Producerea glutamatului monosodic se realizeaza prin fermentatie bacteriana. Bacteria Corynebacterium glutamicum se creste intr-un mediu lichid ce contine zahar, melasa sau amidon ca si substrat de fermentare. Bacteria este capabila sa produca acid glutamic in mediu, apoi se separa prin fitrare, purificare si prin neutralizare, rezultand glutamat monosodic.

In productia acidului glutamic sunt implicate urmatoarele:

- tulpinile ce produc acidul glutamic trebuie sa prezinte o activitate scazuta sau nula a α-ceto-glutaratdehidrogenazei, care sa nu permita ca acidul α-cetoglutaric sa fie transformat in acid succinic.

- tulpinile ce produc acidul glutamic trebuie sa aiba enzima L-glutamat dehidrogenaza intr-o forma mai sensibila la inhibitia feed-back manifestata de glutamat sau sa fie inhibate doar la concentratii ridicate de acid glutamic.

- tulpinile trebuie sa aiba permeabilitatea membranelor alterate pentru a permite acumularea acidului glutamic in mediu si eliminarea lui. Aceasta se poate realiza prin folosirea unei concentratii scazute de biotina in mediu sau a mutantelor auxotrofe de biotina. O alta posibilitate este adausul de penicilina sau de acizi grasi saturati.

Productia industriala a acidului glutamic

Mediul de cultura contine:

sursa de carbon - de obicei glucoza (5 - 200%). De curand se foloseste melasa, ce contine o serie de acizi organici sau amestec de glucoza+fructoza+zaharoza;

sursa de azot: sarurile de ;

hidrolizat de faina de soia, in cantitati mai mari decat cele calculate pentru transformarea glucozei in acid glutamic;

cereale oparite;

sulfati, fosfati de Ca²⁺, Mg²⁺, K⁺;

urme de Fe, Zn, Mn, Co;

biotina.

pH-ul este intre 6 si 8; timpul in care mediul se inoculeaza in cultura este intre 15-30 ore, iar temperatura este intre 27-30°C. Mediul se mentine bine aerat, iar pH-ul se regleaza cu solutie de NH₄OH pentru deplasarea echilibrului in favoarea aminarii reductive a α-ceto-glutaratului. Producerea acidului glutamic are loc in doua etape:

prima etapa dureaza 10-20 ore, in care are loc cresterea culturii;

in etapa a doua are loc acumularea acidului glutamic.

Procesul este terminat in 30-50 ore. La o concentratie de 100 g glucoza/l mediu, se formeaza 50-60 g glutamat/l.

Ca sursa de carbon s-a realizat cu specii de Brevibacterium cu un randament de 60 g/l acid glutamic. Aceste tulpini care folosesc etanolul ca si sursa de carbon, necesita biotina ca factor de crestere.

Producerea de acid glutamic pe baza de parafine s-a realizat cu o tulpina auxotrofa de glicerol de Corynebacterium alcanaliticum rezultand 40 g glutamat/l.

In prezent productia mondiala de glutamat este de 250.000 t/an in Japonia. La noi, la Terapia, cu mutante de Brevibacterium lactofermentum pe un mediu standardizat (gluco 10-12%, uree 2-3%, MgSO₄ 0,05%) se formeaza 60-70 g/l glutamat in conditii de aerare puternica in 20-30 ore.

In organismele animale si umane acidul glutamic nu este utilizat doar in sinteza proteina, el exercita si alte functii foarte importante in organism. Astfel acest acid este un important neurotransmitator in creier si precursor al GABA. Acidul glutamic ca atare nu poate trece de bariera hemato-encefalica decat daca este transformat in glutamina, glutamina ce este apoi utilizata de creier ca un "carburant" celular pentru sinteza proteica.

Se presupune ca acidul glutamic intervine de asemnea in functiile cerebrale de invatare si memorizare, dar in concentratii prea mari poate determina aparitia unor afectiuni patologice cum sunt cele intanite in scleroza laterala amitrofica sau boala Alzheimer. In concentratii prea mari acidul glutamic este deci toxic pentru neuroni, toxicitate ce se leaga de un aflux excesiv si necontrolat de ioni de calciu in celule, ce depaseste cu mult capacitatea de stocare intracelulara. Aceasta duce la alterarea functiei mitocondriale tradusa prin eliberarea citocromilor P450 implicati in apoptoza (moarte celulara controlata). De asemena, toxicitatea glutamatului se traduce printr-o supra-expresie a factorilor de transcriptie a genelor pro-apoptotice sau la inhibarea factorilor anti-apoptotici (factori mediati de glutamat si ionii de calciu). Toate aceste teorii se bazeaza pe observatiile post-mortem realizate asupra pacientilor epileptici.