CELULA - TEHNICI MODERNE

CELULA - TEHNICI MODERNE

Celula , isi dezvaluie tainele functionarii sale normale , respectiv ale modificarilor datorate patologicului , numai daca experimentatorul este capabil sa rezolve cu ingeniozitate doua aspecte:

1. Modelarea experimentala a fenomenelor celulare - adica sa intervina accelerand , incetinind sau inhiband diferitele etape ale procesului celular astfel incat sa patrunda sensul si intimitatea evenimentelor
2. Tehnici si metode adecvate de urmarire a fenomenelor celulare prin care sa poata sesiza efectele modelarilor experimentale

Cu cat spectrul tehnicilor si metodelor de studiere a fenomenelor celulare este mai larg si mai diversificat cu atat fenomenul celular poate fii cunoscu mai profund si descrierea sa este mai sigura.

Metodele de urmarire a fenomenelor celulare sun foarte diverse :

1. Citometria in flux este o tehnica ce prmite analiza si separarea celulelor pe baza unor caractere morfologice si biochimice
2. Fractionarea celulara este o tehnica ce permite izolarea diferitelor elemente ultrastructurale si biochimice ale celulelor
3. Morfologia si morfometria permit analiza calitativa si cantitativa a imaginilor de microscopie optica , respectiv electronica pentru anumiti parametrii alesi de experimentator.
4. Citochimia si citoenzimologia constituie modalitati de evidentiere si localizare pana la nivel ultrastructural pentru diferite componente biochimice ale celulei
5. Imunocitochimia este o ramura a citochimiei , in care recunoastrea componentei de studiat si localizat , de exempul un antige , se bazeaza pe o reactie imuna cu un anticorp specific.
6. Fluorescenta si imunofluorescenta reprezinta modalitati de evidentiere citochimica si imunocitochimica pe baza trasorilor fluorescenti .
7. Microfiziologia si microinjectia permit studierea proceselor celulare prin introducerea de microelectrozi si micropipete ce permit injectarea diversilor compusi biochimici si urmarirea efectelor asupra acestora dar si a celulelor invecinate.
8. Radioautografia prin care se urmaresc diferiti trasori radioactivi administrati la inceputul experimentului.
9. Metode biochimice ce permit studiul proceselor celulare la nivel molecular
10. Tehnici si metode de biologie moleculara reprezinta o clasa aparte de abordari biochimice ptr. Studiul celulelor  prin manipularea materialului genetic si in general prin manipularea acizilor nucleici AND sau ARN.

MORFOMETRIA

Date morfometrice pot fi obtinute la ora actuala prin folosirea de aparatura electronica speciala nunita analizor de imagine.Acesta contine un sistem de achizitie al imaginii obtinute la microscopul optic sau electronic fie de pe fotografii. Acestea pot fii apoi analizate cu ajutorul unor computere de mare putere.

Se alege mai intai criteriul dupa care se va efectua analiza , de ex. Dimensiunea -se vor fixa apoi limitele intervalelor dimensionale dupa care se vor imparti celulele. Scopul este de a stabili proportia in care celulele se distribuie in intervalele prestabilite. Computerul , analizeaza imaginea si va da o prima informatie colorand diferit populatiile celulare.

Rezultatul analizei cantitative este afisat sub forma unei histograme.

CITOMETRIA IN FLUX

Este metoda ce permite masurarea simultana a mai multor caracteristici fizice ale unei celule.

Se realizeaza cu ajutorul citometrelor de flux.

Ofera informatii asupra :

1. marimii relative a celulelor
2. granularitatii interne ( neomogenitatea interna citoplasmatica ) relativa
3. intensitatea relativa a fluorescente.

Citometrul de flux

Utilizeaza un sistem optico-electronic care inregistreaza interactiunea celulelor cu un fascicul laser coerent si de mare intensitate.

Razele luminoase transmise ofera informatii asupra dimensiunilor celulelor in timp ce razele imprastiate ofera informatii asupra granularitatii acestora. Culegerea si analiza informatiilor se face pentru fiecare celula in parte deoarece , prin fata fasciculului laser, celulele trec una cate una.

Informatiile prelucrate de computer se  obtin sub forma unor histograme sau a unor reprezentari prin puncte numite dot plot. Fiecare grup de puncte diferit colorat , reprezinta o populatie de celule cu granularitate si dimensiuni diferite.

Una dintre performantele citometrului in flux este separarea populatiilor de celule pe baza unor criterii biochimice sau morfologice prin marcarea fluorescenta specifica.

Permite :

analiza unui nr. mare de celule : 500 - 4000/ sec.

evaluari statistice ptr. ca nr. celulelor analizate este foarte mare

determinarea precisa a intensitatii fluorescentei

nu poate detecta componenta fluorescenta din celula , ci doar a celulelor fluorescente

analiza simultana a mai multor parametri celulari independenti

Domenii de utilizare :

Biologia celulara

Imunologie

Oncologie

Hematologie

Genetica

Prin :

masurarea caracteristicilor fizice ale celulei

identificarea si separarea populatiilor de celule sanguine ( granulocite , monocite , limfocite T sau B)

masurarea cantitatii de AND din celula

masurarea cantitatii intracelulare de Ca

masurarea pH-ului intracelular

FRACTIONAREA CELULARA

Este o metoda prin care se pot izola si identifica organitele celulare dupa distrugerea integritatii membranei.

Are mai multe etape :

Omogenizarea - ce consta in distrugerea integritatii tisulare si apoi celulare cu obtinerea unei suspensii de organite si membrane veziculate in mediul de omogenizare

Separarea prin centrifugare si/ sau ultracentrifugare - adica centrifugare la forte centrifugale mare 10000 - 500000 de ori acceleratia gravitationala , procedeu prin care se obtine izolarea si purificarea componentelor ultrastructurale.

OMOGENIZAREA

Se poate executa in 3 moduri :

a.      prin soc osmotic , de ex. La obtinerea membranelor eritrocitare care se bazeaza pe suspendarea celulelor tesutului maruntit in solutii hipotone . Diferenta de osmolaritate intre mediul i.c. si cel e.c. duce la umflarea celulelor pana la ruperea membranelor.Continutul se devarsa in mediul de omogenizare , iar membranele care nu pot exista cu capete libere se veziculeaza

b.     prin ultrasonicare - presupune ruperea membranelor sub actiunea undelor ultrasonice

c.      cu omogenizatoare se realizeaza sub actiunea fortelor de frecare si torsiune care contribuie la ruperea membranelor. Aceasta metoda este cea mai folosita ; socul osmotic nu da intotdeauna rezultate satisfacatoare , iar ultrasonicarea este o metoda dura ce necesita precautii suplimentare referitoare la timpul de omogenizare si puterea undelor5

Omogenizatorul

Este format dintr-o eprubeta cu pereti grosi care are la capat o camera de fuga pentru materialul supus omogenizarii , si un pistil care in prezent este format dintr-o tija de otel inoxidabil cu un cap de teflon.

Poate avea diferite calibre , adica distanta dintre suprafata capatului pistilului si peretele eprubetei poate varia intre 10 - 100 mm.

Alegerea omogenizatorului se face in functie de marimea celulelor supuse omogenizarii. Operatia de omogenizare se realizeaza prin trecerea fortata a suspensiei de celule intre peretele eprubetei si capatul pistilului ca urmare a miscarii de dute- vino intre cele doua componente. Miscarea de rotatie imprimata pistilului fie manual fie ca urmare a cuplarii acestuia la un electromotor genereaza fortele de torsiune care maresc eficienta ruperii membranelor celulare.

SEPARAREA

Din omogenatul obtinut , organitele se pot izola prin utilizarea centrifugarii , respectiv ultracentrifugarii . Acestea se pot realiza in doua moduri:

diferential - cand organitele se depun la baza tubului , in ordinea densitatii lor prin centrifugari repetate la forte din ce in ce mai mari

in gradient de densitate - cand printr-o singura centrifugare la forte suficient de ridicate se obtin organitele ca fractii separate . Ele floteaza in diferite pozitii ale gradientului la nivelul la care acesta are o densitate echivalenta cu a componentelor.

Etape  se recolteaza un fragment de tesut care se marunteste si apoi este supus omogenizarii. Se obtine suspensia de organite in mediul de omogenizare. Omogenatul weste last in repaus pentru a se depune resturile celulare si celulele neomogenate. Ssupernatantul este colectat si supus unei prime centrifugari timp de 20 min. la o 1000g obtinandu-se fractia nucleara. Supernatantul obtinut dupa depunerea fractiunii nucleare este supus unei noi centrifugari TIMP DE 20 MIN. LA 10000g obtinandu-se un al doilea sediment ce contine mitocondriile si lizozomii. Supernatantul este din nou centrifugat la 106000g obtinandu-se fractia microzomala ce contine RER , REN , si aparat Golgi.

Daca se face un tratament cu deoxicolat de sodiu 2% si fractia obtinuta se centrifugheaza tot la 106000g sedimentul va contine ribozomii la baza iar veziculele de RE deasupra acestora.

In acest fel se pot obtine diverse organite celulare cu grade suficiente de puritate ptr. A fii supuse analizelor ulterioare.

CENTRIFUGAREA IN GRADIENT DE DENSITATE

Se poate realiza pe gradiente continui sau in trepte . Gradientii cei mai folositi se bazeaza pe solutii de sucroza , Ficoll sau percol.

Gradientul cu solutie de percol se poate autogenera in timpul centrifugarii. Forma sa depinde de concentratia percolului si forta de centrifugare . Variatia acestor parametrii duce la obtinerea de gradienti cu distributie diferita.

AUTORADIOGRAFIA

Este o tehnica de investigare celulara ce permite ce permite identificarea morfologica si ultrastructurala a unor compusi radioactivi.

In calitate de trasori radioactivi se pot utiliza fie precursori de macromolecule biologice cum ar fii : aminoacizi , glucide , nucleotide , fosfat sau sulfat radioactiv , realizandu-se astfel marcarea metabolica a componentelor celulare fie liganzi radioactivi specifici pentru anumiti receptori sau anticorpi radioactivi realizandu-se variante ale metodelor citochimice respectiv imunocitochimice.

Pregatirea preparatelor ptr. autoradiografie presupune o etapa suplimentara fata de obtinerea preparatului pentru microscopia optica .Aceasta etapa consta in acoperirea la intuneric a sectiunii , adica a preparatului microscopic ce contine trasorul radioactiv cu o pelicula fotografica speciala.

Dupa o expunere la temperaturi scazute , durata depinzand de cantitatea de compus radioactiv din preparat sandwichiul format de suport , preparat si pelicula impresionata va fii supus unei developari fotografice. La examinarea la microscop , peste imaginea preparatului se suprapune imaginea granulelor de Ag. redus datorita radioactivitatii si tehnicii ,indicand localizarea trasorului in celula sau tesutul examinat.

Aceasta tehnica a fost folosita de profesorul George Emil Palade in experimentele ce au dus la descoperirea ciclului secretor celular. Experimentul a constat in administrarea in perfuzie a unor aminoacizi tritiati celulelor pancreatice in situ. Dupa eliminarea excesului de trasori nepreluat de celula s-a urmarit localizarea radioactivitatii la diferite intervale de timp. Astfel , dupa 3 min. , emisia radioactiva era localizata perinuclear respectiv in RE. Dupa 20 min. radioactivitatea era maxima in zona ap. Golgi , iar dupa 90 min. era concentrata la polul apical al celulei in zona corespunzatoare granulelor de secretie.

Acest experiment a permis stabilirea etapelor parcurse de proteinele destinate exportului. Astfel , aceste proteine sunt sintetizate la nivelul RER ,maturate si impachetate la nivelul ap. Golgi , stotocate temporar in granule de secretie si eliminate din celula prin exocitoza.

METODE BIOCHIMICE

Metodele utilizate in studiile de biologie celulara sunt intr-o permanenta perfectionare si largire a gamei

ELECTROFOREZA

Este metoda prin care , particulele incarcate electric migreaza intr-un mediu vascos , sub actiunea unui camp electric.

Practic orice molecula sau macromolecula biologica incarcata electricpoate fii analizata electroforetic.

De regula , in biologia celulara aceasta metoda se foloseste pentru studiul proteinelor si a acizilor nucleici.

Mediul in care se realizeaza electroforeza are la baza acrilamida sau agaroza.

Electroforeza proteinelor poate fii

a.      unidimensionala , cand migrarea se realizeaza in gel intr-o singera directie

b.     bidimensionala , cand migrare se realizeaza succesiv in doua directii

Electroforeza unidimensionala se foloseste in prezent in doua situatii :

SDS - PAGE

FOCALIZAREA IZOELECTRICA

1.Electroforeza in gel de poliacrilamida in prezenta dodecilsulfatului de sodiu - realizeaza separarea proteinelor dintr-un amestec pe baza gabaritului molecular direct proportional cu masa moleculara.

Principiul metodei se bazeaza pe capacitatea detergentului folosit , dodecilsulfat de sodiu , de a se adsorbi unitar pe proteine realizand o densitate de sarcina negativa uniforma. Este astfel anulata contributia gruparilor incarcate electric din proteina nativa . Parametrul care influenteaza astfel migrarea este gabaritul molecular :cele mici migrand mai repede , cele mari mai greu datorita frecarii cu interstitiul gelului.

Evidentierea proteinelor in gel dupa electroforeza se pote face cu o serie de coloranti , cel mai folosit fiind ..briliant blue R 250.

2.Focalizarea izoelectrica , reprezinta o metoda prin care separarea proteinelor dintr-un amestec se face pe baza punctului lor izoelectric.

Gelul , lax , de poliacrilamida sau agaroza contine niste compusi cu capacitatea de a realiza sub actiunea campului electric un gradient stabil de pH. Acesti compusi se numesc amfoliti.

Protinele , in functie de incarcarea lor electrica initiala , dependenta de punctul izoelectric , migreaza catre unul din capetele gelului corespunzator anodului sau catodului . Cand ajung in zona cu pH-ul identic cu cel al punctului lor izoelectric devin neutre oprindu-si miscarea. Unele dintre ele sufera chiar precipitarea la punct izoelectric.

Electroforeza bidimensionala

Presupune migrarea proteinelor in doua directii :

in prima directie in functie de punctul lor izoelectric este o FOCALIZARE IZOELECTRICA

a doua directie este o SDS - PAGE , in functie de greutatea moleculara a proteinelor.

Rezultatul se prezinta sub forma unei harti cu proteinele separate in planul gelului.

Prin acest tip de electroforeza se pot evidentia pana la cateva mii de entitati moleculare proteice ale unei celule.

IMUNOELECTROFOREZA

Este o varianta a electroforezei ce combina migrarea in camp electric a proteinelor cu realizarea unei reactii imune , conducand la obtinerea unor benzi de precipetare a complexelor Ag - Ac.

Reactia imuna se poate face fie dupa terminarea migrarii electroforetice imunoelectroforeza decurgand in doua etape , fie concomitent , imunoelectroforeza in racheta. Aceasta permite aprecierea cantitativa a Ag din proba de analizat pe baza suprafetei descrise de linia de precipitare cu linia de start. La acest tip de imunoelectroforeza Ac se afla in masa gelului iar Ag se aplica in punctele de start.

TRANSFERUL ELECTROFORETIC

Reprezinta o metoda de extragere a proteinelor separate electroforetic dintr-un gel , cu adsorbirea lor pe niste hartii cu proprietati speciale.

Hartiile utilizate sunt obtinute din nitroceluloza sau naylon . Proteinele astfel expuse sunt usor accesibile unor reactii de recunoastere specifica prin intermediul unor interactiuni afine de tip receptor - ligand sau Ag - AC. Partenerul de reactie introdus in mediul de incubare al hartiei ce contine.