Enzime pectolitice

Enzime pectolitice

Sunt enzime din clasa hidrolazelor, utilizate in industria alimentelor: sucuri din legume si fructe. Sunt cele mai utilizate enzime in industria alimentara, unde se mai folosesc enzime celulozolitice, amilolitice, hemicelulazele, glucoizomeraza.

Substratul asupra caruia actioneaza enzimele pectolitice este pectina. Substantele pectice se gasesc in tesutul tuturor plantelor, fiind constituenti ai peretilor celulelor. In peretii celulari pectina insolubila, numita protopectina, are rol structural umpland spatiile dintre fibrele de celuloza, hemiceluloza si lignina. Prezinta un rol de "ciment celular", de aceea pectinele plantelor ajunse la maturitate sunt insolubili in apa. In perioada de maturare se observa aparitia unor spatii intracelulare, datorita solubilizarii unei parti mari a protopectinei. Cu cat planta (fructul) este mai copt, cu atat cantitatea de pectina solubilizata de catre enzimele proprii este mai mare, de aceea fructele se inmoaie.

Prin termenul de substante pectice se intelege un complex de hidrati de carbon coloidali format din protopectina + acizii pectinici (pectina) + acizii pectici (pectati). Substantele pectice sunt heteropoliglucide, alcatuite din unitati de acid D-galacturonic, legati 1-4 glicozidic. Gruparea - COOH ale acizilor galacturonici pot fi esterificate cu grupare - CH₃.

Structura spatiala elicoidala

Protopectinele sunt substante pectice inalt esterificate si insolubile in apa. Acizii pectici sunt, in general, solubile in apa, iar in prezenta zaharozei si a ionilor de calciu formeaza geluri (gem, marmelada).

Prin hidroliza totala a substantelor pectice rezulta acid D-galacturonic + metanol + hidrocarburi + glucide.

Proprietatile fizice ale substantelor pectice depind de: greutatea moleculara, grad de esterificare, configuratia spatiala a macromoleculelor, legatura de hidrogen din molecula.

Tipuri de enzime pectolitice

Enzimele pectolitice sunt sintetizate de plante si microorganisme. Ele pot fi:

enzime de demetoxilare (saponifiante);

enzime depolimerizante.

Enzimele saponifiante sunt esteraze care catalizeaza demetoxilarea pectinei, rezultand MeOH. Se mai numesc si pectinesteraze PE.

PE incep hidroliza gruparii esterice vecine unei grupari - COOH libere. Cand concentratia - COOH libere creste, aceasta va duce la inhibarea PE.

Gruparile - COOH libere se gasesc ionizate: - COO^-. Sarurile metalelor alcaline si alcalino-pamantoase neutralizeaza gruparea - COO^-, de aceea acesti ioni sunt activatori ai PE atunci cand sunt in concentratie mica.

PE obtinute cu ajutorul fungilor si bacteriilor au mase moleculare cuprinse intre 35.000-37.000, pH₀ fungi=4,5-5, iar pentru bacterii 7,5-8.

Microorganisme:

Clostridium multifermentans, Phytophora infestans, Xantomonas compestris dintre bacterii;

Fungi: Alternaria brassicae, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Fusarium oxysporus, Botrytis cinerea sau drojdia Sacharomyces vini.

Enzimele depolimerizante sunt glicozidaze care actioneaza asupra lantului poligalacturonice, afectand legaturile 1-4 glicozidice.

Dintre enzimele depolimerizante cea mai utilizata in industria alimentara este endopoli-galacturonoza. Aceasta este produsa de microorganismele fitopatogene si invadeaza tesuturile vegetale: Botrytis, Fusarium, Trichoderma, Aspergillus. A fost de asemenea identificat in secretia hepato-pancreatica sau a glandei salivare la melci.

Actiunea poligalacturonozei se manifesta prin rapida scadere a vascozitatii solutiei. pH₀=3,5-5; T=30-45°C.

Obtinerea enzimelor pectolitice cu ajutorul fungilor

La Terapia Cluj: pe mediu de tarate de grau si felii de morcov. Preparatul are o culoare gri-cenusiu-negru cu miros de mucegai. Produsul se numeste Linpectin si este necompetitiv. De aceea se obtin produse in conditii submerse.

Se folosesc tulpini de Aspergillus niger cultivate pe un mediu lichid.

Inoculul se poate obtine:

pe medii solide (tarate de grau, rumegus, faina de orez, taitei de sfecla; 62-72 ore la 28-30°C, in care se introduce tulpina de Aspergillus niger);

in conditii submers [tescovina de mere, melasa, (NH₄)₂SO₄, (NH₄)₂HPO₄, CaCO₃ - in care se introduce suspensia de miceliu Aspergillus niger la pH=4,8-6; T=28-30°C; t=16-48 h.

Biomasa obtinuta atat pe mediul solid cat si in conditii submerse se inoculeaza in mediul de productie intr-un bireactor prevazut cu sistem de agitare, in care este acelasi mediu de cultura ca si la inocul. Mediul se supune apoi centrifugarii, iar filtratul obtinut se concentreaza sub vid pana la 1/7 din volum.

Enzimele pectolitice au fost utilizate inca de la mijlocul secolului trecut in industria alimentara la sucuri, vinuri, ceai, boabe de cacao si cafea, iar in industria textila la topirea plantelor textile (in, canepa).

Productia de enzime pectolitice este de cca 30 t/an.

Pectinele din furaje micsoreaza digestibilitatea acestuia. De aceea enzimele pectolitice se inglobeaza in furaje.

Enzime lipolitice

Lipaze sunt hidrolaze care actioneaza asupra legaturilor esterice din lipide. Dupa origine lipazele sunt:

de origine microbiana;

din plante;

din lapte;

pancreatice;

lipoprotein lipaze.

Microorganismele producatoare de lipaze sunt:

bacterii (Staphylococcus aureus, Pseudomonas fragi, pseudomonas nitroreducens, Bacillus licheniformis);

drojdii (Candida cylindacea, Sacharomyces lipolytica, Candida lipolytica);

fungii (Aspergillus niger, Rizopus, Mucor lipolytica, Penicillium funicolosum etc).

Lipazele microbiene sunt enzime extracelulare care pot fi obtinute din culturi tinere in perioada de crestere logaritmica.

Obtinerea lipazelor in cuturi submerse

Factori. Influenteaza compozitia mediului de cultura. Mediile contin drept sursa de carbon o mono- sau poliglucida, iar productia de lipaza nu depinde decat in mica masura de natura glucidei. Sursa de azot: peptona, ureea, NH₄I₂SO₄. Natura sursei de azot depinde de tipul de microorganism. Se pot folosi si aminoacizi, arginina, lizina, acid aspartic, acid glutamic. Introducerea lipidelor in mediul de cultura poate inhiba productia de lipaza la unele microorganisme (Penicillium, Fusarium), iar la altele poate avea efect diferentiat asupra lor in functie de tipul de lipida si microorganism:

tributirina creste productia de lipaze la Mucur muceda si Penicillium roqueforti.

Una din sursele cele mai importante de lipaza pentru biotehnologie este Aspergillus niger cand se foloseste ca mediu de cultura NH₄NO₃, KH₂PO₄, MgSO₄, FeSO₄, zaharoza si uleiul de masline.

Sursa optima de carbon este zaharoza: glucoza, maltoza si fructoza determina o crestere buna a miceliului, dar randamentul in lipaze este scazut.

Influenta aerarii

Creste productia de lipaze, pentru majoritatea microorganismelor, daca se foloseste aerarea. Gradul de aerare difera de la o specie la alta.

Influenta fazei de dezvoltare a celulelor

Cea mai mare cantitate de lipaza se produce in perioada cresterii logaritmice a micro-organismelor, pentru majoritatea microorganismelor, iar pentru unele la sfarsitul perioadei logaritmice sau in timpul perioadei stationare (Pseudomonas fluorescenses).

Purificarea lipazelor microbiene

Microorganismele se separa din mediu prin centrifugare sau filtrare. Apoi separarea diferitelor proteine prin precipitare fractionara implica urmatoarele tehnici:

precipitare selectiva cu ajutorul sarurilor neutre;

precipitare selectiva cu ajutorul solventilor organici miscibili cu apa (etanol sau acetona);

gel filtrarea;

cromatografia de interactiune hidrofoba;

cromatografia de afinitate, de schimb ionic etc.

Trebuie avut grija ca in timpul purificarii enzimatice sa nu se piarda activitatea enzimelor datorita:

denaturarii partii proteice a enzimei;

degradarea proteinelor datorita proteazelor din mediu;

in activarea reversibila sau ireversibila a centrului cationic al enzimei.

Pentru stabilizarea solutiilor care contin enzime se pot folosi NH₄I₂SO₄ si glicerina, care are avantajul ca permite conservarea extractului enzimatic si la temperaturi sub 0°C fara a congela enzima.

Aplicatii ale lipazelor microbiene

- producerea unor tipuri de trigliceride cu proprietati de topire dorite, realizate prin reactii de interesterificare, catalizate de lipaze;

- aplicarea lipazelor ca aditivi si detergenti pentru facilitarea scoaterii grasimilor din tesaturi in timpul spalarii. Este cea mai importanta utilizare a lipazelor.

Aceste lipaze trebuie sa fie stabile si active in prezenta proteazelor. S-au folosit tulpini de Asp. oryzae in care a fost inserata o gena pentru lipaze.

Glucoxidaze microbiene

Glucoxidaza este o enzima care prezinta specificitate pentru reactii de oxidare a -D-glucoza cu formare de D-gluconolactoza si H₂O₂:

In preparatele brute, glucoxidaza este insotita de catalaza care descompune H₂O₂ in H₂O + 1/2 O₂ care participa mai departe la reactia de oxidare.

Se folosesc sarurile acidului gluconic de Ca, Na, prin reactia acidului gluconic cu CaCO₃, Na₂CO₃ sau Ca(OH)₂, NaOH.

Oxidarea glucidelor la acid glucidic poate avea loc in doua moduri:

- se cultiva un organism producator de glucoxidaza pe un mediu de cultura care contine 20-30% glucide si saruri minerale. Acidul glucidic format se neutralizeaza pe masura ce se formeaza, pentru a impiedica cristalizarea. Se separa apoi biomasa, obtinandu-se o solutie ce contine un amestec de acid gluconic si gluconat de Na sau Ca. Acest proces se numeste oxidare microbiologica a glucidelor.

- se cultiva un microorganism producator de glucoxidaza pe un mediu de cultura specific producerii de enzime, continand cca 5-10% glucide si saruri minerale. Se va dezvolta o cantitate mare de biomasa cu activitate glucoxidazica. Se separa biomasa si se prelucreaza in scopul extractiei glucoxidazei. Preparate de glucoxidaze cu diferite grade de puritate pot fi ulterior utilizate la oxidarea unor solutii de glucide de diferite concentratii. Acest procedeu se numeste oxidare enzimatica a glucidelor.

Microorganisme producatoare de glucoxidaza

Fungi: Aspergillus niger, Penicillina nofatum, Penicillina glaucum

Bacterii: Acetobacter oxydans, Acetobacter gluconian, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis.

Fungii din genul Aspergillus, alaturi de cei din genul Penicillium sunt cele mai importante microorganisme folosite in biotehnologia de obtinere a enzimelor. Aceste microorganisme pot fi cultivate in conditii de laborator si de pilot industrial cu o dezvoltare rapida pe medii lichide. Sporii de Aspriger sunt insamantati pe medii cu extract de malt, agar-agar cu pH=6,4 (se corecteaza cu NaOH mediul astfel preparat), la temperatura de 30°C timp de 7 zile. Cultura de inoculare pe mediu solid, bine sporulata, serveste la insamantarea mediului de fermentatie care contine glucide, CaCO₃, NaNO₃, MgSO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄, KCl cu pH=6-6,5. Se sterilizeaza la 110°C timp de 20 minute. Inoculul se dezvolta in conditii de agitare si aerare timp de 26-30 ore.

Se separa biomasa fungica prin filtrare la vid. Miceliul separat este spalat cu apa distilata si este supus operatiei de spargerea peretilor celulari, in vederea eliberarii enzimelor (care este intracelulara). Aceasta se face prin mojarare cu nisip de cuart. Extractia enzimelor se face cu apa distilata. Se filtreaza miceliul epuizat de enzima, care contine si nisipul. Rezulta un filtrat care se concentreaza prin evaporare, apoi trecut pe o coloana ce contine un derivat de celuloza, care adsoarbe enzima.

Enzima este apoi eluata cu o solutie acetat, iar produsul rezultat este conditionat. Rezulta un preparat glucoxidazic sub forma de pulbere de culoare galben-pai. Aceasta prezinta temperatura optima de actionare de 50°C; pH₀=4,5; continutul in proteine 20% si este stabil 6 luni.

Se folosesc in industria alimentara pentru eliminarea O₂ din cutiile de conservare, din cutiile de bere, fiind considerat cel mai bun antioxidant biochimic. Se mai folosesc ca reactiv analitic de inalta specificitate in determinarea glucozei din lichidele biologice sau din mediile de biosinteza (teste de diagnostic, biosenzori).

Aplicatii ale celulazelor si enzimelor inrudite in ceretare-dezvoltare si in agricultura

Atat amestecurile cat si compontele izolate ale celulazelor, hemicelulazelor si pectinazelor au o gama larga de aplicatii potentiale in cercetare, asa cum sunt prezentate in tabelul de mai sus. De asemenea, aceste enzime au aplicatii potentiale in agricultura pentru controlul bolilor plantelor si pentru imbunatatirea cresterii si dezvoltarii plantelor. Cateva din principalele aplicatii ale celulazelor si enzimelor inrudite in cercetare-dezvoltare ca si in agricultura sunt descrise mai jos.

Producerea enzimatica a protoplastelor plantelor si fungilor

Amestecul de celulaze si alte polizaharidaze produs de varietatile de ciuperci Trichoderma si Penicillium sunt folosite pentru producerea protopastelor de plante si fungi. Aceste protoplaste pot fi combinate pentru a produce fie varietati hibride sau mutante cu caracteristiceile dorite. De asemenea, celulazele si enzimele inrudite pot fi instrumente potentiale pentru a genera noi varietati capabile sa produca nivele ridicate de enzime de interes comercial. S-au evaluat o serie de preparate celulazice comerciale si necomerciale folosite pentru productia protoplastelor din varietati salbatice si mutante de Penicillium. Ei au aratat ca enzimele din Trichoderma viride Persoon, crescute pe cultura solida folosind tarate de grau, si din Penicillium pinophilum 87160iii, crescute ca cultura submersa pe un substrat amestec (laminarin si pereti celulari de P. pinphilum) au dat cele mai bune rezultate pentru obtinerea protoplastelor fungice. Astfel, o combinatie de preparate enzimatice continand celulaze si hemicelulaze pot fi utilizate cu succes pentru producerea protoplastelor de plante si fungi.

Controlul enzimatic/microbial al bolilor plantelor si imbunatatirea cresterii plantelor

Celulazele si enzimele inrudite din anumite fungi sunt capabile de a degrada peretele celular al agentilor patogeni al unor plante si astfel sa opreasca imbolnavirea plantei. S-a aratat ca β-1,3-glucanaza si N-acetil-glucosaminidaza din Trichoderma harzianum varietatea P1 inhiba sinergic germinatia sporilor si elongatia excrescentelor tubulare de B. cinerea. β-1,3-glucanaza din T. harzianum CECT 2413 induc schimbari morfologice ca gonflarea filamentelor corpului fungilor, scurgerea citoplasmei si formarea a numeroase septe si inhibarea cresterii R. solani si Fusarium sp.. Astfel, β-1,3- si β-1,6-glucanazele din T. harzianum CECT 2413 hidrolizeaza peretele celular al filamentelor fungilor si inhiba cresterea fungilor testate. Mai mult, varietatile mutante de T. harzianum, care produc nivele mai ridicate de β-1,3- si β-1,6-glucanaze decat varietatile salbatice, s-a dovedit a a avea de asemenea activitate anti-fungica. Un mutant hypercelulolitic de T. longibrachiatum care produce nivele mai ridicate de β-1,4-endoglucanaza decat varietatea salbatica, reduc incidenta de boli datorate Pythium (un agent patogen pentru plante) asupra rasadurilor de castravete de la 60 la 28%. Astfel, o combinatie de varietati de fungi si enzimelor lor pot fi folosite ca agenti de control bio pentru a proteja semintele si plantele fata de agentii patogeni. Multe fungi celulolitice, incluzand Trichoderma sp., Geocladium sp., Chaetomium sp., and Penicillium sp. sunt cunoscute pentru rolul cheie pe care il joaca in agricultura prin facilitarea unei germinari ridicate a semintelor, cresterea si inflorirea mai rapida a plantelor, un sistem radicular imbunatatit ca si productii mai mari. Desi aceste fungi au efect atat direct (probabil prin factorul difuzabil de promovare a crestere) cat si indirect (prin controlul bolii plantei si a agentului patogen) asupra plantelor, nu este foarte clar cum aceste fungii faciliteaza imbunatatirea performantelor plantei. Cercetari ulterioare sunt necesare pentru a dezvalui intregul potential al microorganismelor in agricultura.