PROCEDURA SPECIFICA

IZOLAREA SI IDENTIFICAREA GERMENILOR DIN GENUL SALMONELLA

CAP. 1. SCOP. DOMENIU DE APLICARE

SCOP

Izolarea din materiale patologice si alte produse a germenilor din genul Salmonella si identificarea lor pe baza caracterelor culturale, microscopice, biochimice, serologice.

DOMENIU DE APLICARE

Prezenta procedura se aplica in cadrul Compartimentului de Sanatate Animala pentru diferite categorii de probe de materiale patologice, receptionate si procesate in cadrul sectiei de Bacteriologie a LSVSA Cluj.

CAP.2. DOCUMENTE DE REFERINTA SI CONEXE

DOCUMENTE DE REFERINTA

Metoda omologata- cod 1.20 Metoda de izolare si identificare a germenilor din genul Salmonella

Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2004 - capitol 2.10.3; capitol 2.7.5

ISO 6579:2002  anexa D

ISO 6579/2003

PG-L-01: Controlul documentelor

PG-L-02: Analiza cererilor de oferta, ofertei si contractelor

PG-L-07: Controlul inregistrarilor

PG-L-10: Controlul echipamentelor de analiza

PG-L-11:Managementul probelor:

PG-L14: Localuri, conditii de mediu si protectia personalului

PG-L-15: Executia analizelor si asigurarea calitatii rezultatelor analizelor:

PG-L-16: Controlul datelor

DOCUMENTE CONEXE

IL-LBT-01-Instructiune de lucru Termostat MIM- 37⁰C, serie LP 1222725181, nr. inv. 2235

IL-LBT-11- Instructiune de lucru Termostat LP - 30⁰C, serie LP 123836208, nr. inv. 3111

IL-LBT-12- Instructiune de lucru Termostat MIM - 41.5⁰C, serie LP 11612862603, nr. inv. 3079

IL-LBT-02 - Instructiune de lucru Autoclav RAYPA AES - 75, seria : 17084,nr. Inv. 2260

IL-LSR-14 - Instructiune de lucru Balanta cu taler Gibertini,serie 107443

IL-LBT-04 - Instructiune de lucru Etuva Veb Mlw Medizinische HS 200, serie 15-191, nr. inv. 3142

IL-LBT-05 - Instructiune de lucru Microscop tip Olympus model CHS, seria 4A0274, nr. inv. 3017

IL-LBT-06- Instructiune de lucru Hota cu flux laminar Optofina, Bucuresti, nr. Inv. 2183

IL-LBT-13- Metode uzuale de colorare a frotiurilor

IL-LBT-14 -Reactia de aglutinare pe lama

IL-LBT- 15-Utilizarea sistemului API 20 E

CAP. 2. DEFINITII SI ABREVIERI

DEFINITII

Salmonella - microorganisme care formeaza colonii tipice sau mai putin tipice pe medii selective solide si care manifesta caracteristicile biochimice si serologice descrise conform standardului SR EN ISO 6579/2003.

ABREVIERI

MC MANUALUL CALITATII;

PG - PROCEDURA GENERALA DE SISTEM;

PO PROCEDURA OPERATIONALA;

PS PROCEDURA SPECIFICA DE INCERCARE ;

IL - INSTRUCTIUNI DE LUCRU ;

SC - SISTEMUL CALITATII ;

AC - ASIGURAREA CALITATII;

HG - HOTARARE GUVERNAMENTALA;

AI AUDITUL INTERN ;

LBT - LABORATOR BACTERIOLOGIE;

BA BULETIN DE ANALIZE ;

RAC RESPONSABIL ASIGURAREA CALITATII;

EIMI ECHIPAMENTE INCERCARE ;

DC DOCUMENTELE CALITATII;

RTL RESPONSABILUL TEHNIC DE LABORATOR;

CAP. 3. DESCRIEREA ACTIVITATII PROCEDURATE

CONDITII PREALABILE

Modul de analiza, acceptare si inregistrare a cererilor de incercare (analiza) este conform MC si PG-L-02

Receptia, verificarea, circuitul, inscriptionarea si esantionarea probelor de analizat se face conform MC si PG-L-11.

Prepararea mediilor de cultura si a reactivilor se face conform Anexei B din SR ISO 6579/2003.

Protectia personalului

Este obligatorie purtarea halatului alb (din bumbac) de protectie si a bonetei.

Deoarece suspensiile obtinute din probele ce urmeaza a fi analizate analizate, culturile si subculturile realizate in diferite etape ale procesului analitic, cat si culturile microbiene martor folosite sunt potential contaminante, manipularea acestora se va face cu maxima precautie.

Pentru a se evita ingerarea materialului potential patogen, pipetele folosite in procesul analitic se vor asigura cu dop de vata. Dupa utilizare, pipetele se vor depune in recipiente din sticla cu solutie dezinfectanta.

Protectia mijloacelor de incercare si/sau masurare

Toata sticlaria care se foloseste in aceasta determinare se pastreaza numai sterilizata, in dulapuri sau sertare speciale, pentru a evita prafuirea, contaminarea sau deteriorarea ambalajului in care au fost sterilizate.

Balantele cu care se efectueaza cantaririle se instaleaza pe suprafete plane, fara trepidatii, in mediu lipsit de praf si schimbari bruste de temperatura.

Termostatele pentru incubarea mediilor insamantate se urmaresc zilnic si se inregistreaza valorile temperaturilor in fi;ele de monitoriyare a temperaturii.

Verificarea starii de functionare si confirmare metrologica a mijloacelor de masurare si/sau incercare

Balantele, in perioada de valabilitate a verificarii metrologice/ etalonarii, se verifica periodic conform instructiunilor prevazute in Manualul Calitatii, conform PG-L-10.

In cazul termostatelor, in perioada de valabilitate a verificarii metrologice, inregistrarea temperaturii se face de doua ori/zi in fisele de monitorizare a temperaturii FG-L-14-11.

Se verifica starea tehnica a sticlariei care se va folosi la determinare.

Nu se vor utiliza mijloace de masurare a caror perioada de valabilitate metrologica este depasita, care nu functioneaza la parametrii corespunzatori sau care nu se incadreaza in clasa de precizie impusa de standardul de lucru.

Lampa bacteriologica-UV se verifica pentru eficienta sterilizarii prin teste de sanitatie de pe suprafetele asupra carora a actionat.

RESURSE NECESARE

ECHIPAMENTE DE INCERCARE SI MIJLOACE DE MASURARE

Termostat la 37^oC tip MIM, seria: LP 1222725181, nr. inv. 2235- IL-LBT-01

Termostat la 41.5^oC tip MIM, seria LP 11612862603, nr. inv. 3079- IL-LBT-12

Autoclav RAYPA AES - 75, seria 17084, nr. inv. 2260 -IL-LBT

Balanta cu taler Gibertini, serie 107443- IL-LSR-14

Etuva tip Veb Mlw Medizinische HS 200, serie 15-191, nr. inv. 3142- IL-LBT

Microscop tip Olympus model CHS, serie 4A0274, nr. inv. 3017 - IL-LBT-05

Hota cu flux laminar tip Optofina, Bucuresti, nr. Inv. 2183 - IL-LBT

MATERIALE SI STICLARIE DE LABORATOR

Foarfeca;

Bisturiu;

Pensa anatomica;

Anse bacteriologice de unica folosinta cu capacitate de 1 μl;

Spatula;

Bec de gaz;

Stative pentru eprubete;

Tavi de inox;

Lame micorscopice;

Baloane Erlenmeyer, sterile (100, 200 ml);

Eprubete sterile cu diametre diferite (16/160 mm, 18/180mm, 10/100mm);

Pipete gradate sterile, cu capacitatati diferite (1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml), cu gradatii de 0,1 ml;

Placi Petri sterile, cu diametrul de 90 mm;

Recipienti de sticla cu solutie dezinfectanta pentru pipetele Pasteur;

Recipienti de sticla cu solutie dezinfectanta pentru lamele folosite la reactia de seroaglutinare;

Cilindrii gradati sterili, cu capacitati diferite (25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml);

Anse bacteriologice cu bucla cu diametru de aprox. 3 mm, din nichel-crom si/sau ace de insamantare sterile;

Hartie de filtru;

Manusi chirurgicale.

MEDII DE CULTURA SI REACTIVI

Apa peptonata tamponata - preparata conform Anexa B1 din SR EN ISO 6579/2003 si Caiet medii de cultura-compozitie 1, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Mediu semisolid modificat Rappaport-Vassiliadis  (MSRV) - preparat conform Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Bulion selenit-cistina - preparat conform Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate.

Agar xiloza-lizina-dezoxicolat (agar XLD) - preparat conform Anexa B4 din SR EN ISO 6579/2003 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Mediul Istrati-Meitert - preparat conform Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate.

Agar nutritiv - preparat conform Anexa B5 din SR EN ISO 6579/2003 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Bulion nutritiv - preparat conform Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Agar TSI (triple sugar/iron agar) - preparat conform Anexa B6 din SR EN ISO 6579/2003 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Mediul mobilitate-indol-uree (MIU) - preparat conform Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate.

Reactiv Kovacs - preparat conform Anexei B11 din SR EN ISO 6579/2003 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Solutie salina fiziologica - preparat conform Anexa B13 din SR EN ISO 6579/2003 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Seruri imune utilizate pentru confirmarea serologica prin reactia de aglutinare pe lama.

Tulpini de referinta

violet de gentiana, ;

sol. Lugol ;

sol. fuxina diluata1/10 ;

sol. de alcool-acetona ;

albastru de metilen sol. apoasa 1% ;

sange defibrinat de oaie.

Oleu de cedru.

EXECUTIA ANALIZEI, ACTIVITATII

Trebuie avut in vedere faptul ca o singura schema de izolare nu poate fi aplicabila tuturor categoriilor de probe destinate examenului bacteriologic pentru izolarea si identificarea germenilor din genul Salmonella, motiv pentru care se impune utilizarea unei combinatii de scheme corespunzatoare si capabile sa permita izolarea si identificarea tulpinilor de Salmonella suspicionate in proba.

Pregatirea probelor se realizeaza de catre personalul executant de incercare sub supravegherea responsabilului de incercare.

Pentru determinare se folosesc mijloace de masurare si/sau incercare prevazute la

materiale supuse examinarii

A.De la animale vii fecale, material seminal, secretii cervico-vaginale, lapte mastitic, lichide fetale, invelitori placentare, avortoni, oua pentru incubat

B. De la animale moarte: ficat, splina, rinichi, limfonoduri mezenterice, intestitn subtire, sac vitelin, cecum, pulmon, vezica biliara, os lung nedeschis, member cu articulatii afectate, s.a.

C. Alte materiale: embrioni, probe de asternut, meconiu si puf din statiile de incubatie, probe de sanitatie prelevate pe tampoane de pe pardoseala, pereti, jgheaburi de furajare, de pe suprafata carcaselor, rigole de scurgere, buncare pentru furaje, cuibare, ape reziduale, probe de sol, fainuri proteice sau furaje concentrate care contin astfel de ingrediente, cadaver rozatoare.

PREGATIREA PROBEI DE ANALIZAT SI PREIMBOGATIREA SELECTIVA

In vederea evitarii contaminarii mediului si a probei luata in lucru, se recomanda a se lucra in incaperi speciale sau in nisa cu flux laminar.

Probele se vor manipula astfel incat sa se evite orice risc de contaminare. Pentru a se realiza aceasta, cand nu se lucreaza in nisa, se lucreaza in vecinatatea flacarii;

1. Preimbogatirea - nu este necesara tuturor categoriilor de probe si se realizeaza asfel:

Continutul intestinal se insamanteaza in proportie de 1/10 in mediu de preimbogatire :apa peptonata tamponata ;

Continutul oualor se amesteca in proportie de 1/10 cu apa peptonata tamponata intr-un pahar Erlenmeyer.

Puf, resturi de incubatie, dejectii se amesteca in proportie de 1/10 cu apa peptonata tamponata ;

Embrioni : continutul sacilor vitelini se insamanteaza in proportie de 1/10 in apa peptonata tamponata ;

Furaje, fecale de pasari vii : se insamanteaza in proportie de 1/10 (10 g proba se suspensioneaza in 90 ml) apa peptonata tamponata la temperatura camerei si se omogenizeaza prin agitare timp de 30 min.

Mediile de preimbogatire (apa peptonata tamponata) insamantate, se introduc in termostat la 37 C pentru incubare timp de 18 2 ore.

IMBOGATIREA SELECTIVA

Din organe , insamantarile se fac abundent, cu pipeta Pasteur pe mediul de imbogatire lichid : bulion selenit cistina , nefiind necesara o etapa de preimbogatire.

Pentru probele mentionate la punctul 1, se ia 1 ml cultura in apa peptonata tamponata si se insamanteaza in 10 ml mediu de imbogatire lichid- bulion selenit cistina.

Pentru probele de furaje si fecale de la pasari vii se face suplimentar o insamantare in mediul semisolid Rappaport-Vassiliadis (MSRV) astfel :

- 0,2 ml cultura preimbogatita se insamanteaza in picaturi pe suprafata mediului semisolid Rappaport-Vassiliadis (MSRV)

Toate mediile de cultura insamantate se incubeaza la 37 °C, cu exceptia mediului semisolid Rappaport-Vassiliadis (MSRV) care se incubeaza la 41,5 °C timp de 24-48 ore, prelungirea timpului de incubatie fiind necesara pentru unele serovariante care cresc mai greu

( S. abortusovis, S. gallinarum), coloniile devenind vizibile dupa 36-48 ore.

IZOLARE SI IDENTIFICARE

Din culturile in medii de imbogatire se efectueaza dispersii pe suprafata mediilor selective si de diferentiere (XLD si Istrate-Meitert) in vederea obtinerii de colonii izolate. Mediile selective se incubeaza la 37 °C timp de 24-48 ore.

In cazul in care, pe mediile selective nu se obtin colonii izolate dintr-o cultura abundenta, se repeta dispersia culturilor din mediile lichide si semisolide (MSRV) pe cate doua placi cu mediu selectiv in vederea epuizarii culturii si obtinerea de colonii izolate -aceasta etapa fiind un punct critic de control.

Coloniile tipice de Salmonella crescute pe agar XLD au un centru negru si o zona transparenta luminoasa, de culoare rosiatica, datorata schimbarii culorii indicatorului.

NOTA- variantele de Salmonella H₂S negative (de exemplu Salmonella paratyphi A) crescute pe agar XLD sunt roz cu centrul roz inchis. Salmonella lactoza -pozitiva crecuta pe agar XLD este galbena, cu sau fara negreala.

Coloniile de Salmonella crescute pe mediul Istrate Meitert au culoare verzuie sau verde-albastrui cu centrul negru.

CONFIRMARE

Alegerea coloniilor pentru confirmare

Selectarea coloniilor pentru confirmare- se ia din fiecare placa cu fiecare mediu selectiv cel putin o colonie suspecta si alte 4 colonii daca prima este negativa. Se insamanteaza coloniile selectate pe suprafata uscata in prealabil a placilor cu agar nutritiv, in asa fel incat sa se permita dezvoltarea de colonii izolate. Se incubeaza placile inoculate la 37 C, timp de 24 3 ore.

Pentru confirmare biochimica si serologica se folosesc culturi pure.

Confirmarea biochimica

Se pot folosi chituri de identificare pentru examinarea biochimica a Salmonellei, disponibile in comert. Folosirea chiturilor de identificare se refera la confirmarea biochimica a coloniilor. Aceste chituri trebuie sa fie folosite cu respectarea instructiunilor fabricantului.

Agar TSI.

Se insamanteaza suprafata inclinata a agarului prin striere si masa mediului prin intepare. Se incubeaza la 37 C, timp de 24 3 ore.

Se interpreteaza schimbarile in mediu dupa cum urmeaza:

Culturile tipice de Salmonella prezinta suprafata inclinata a mediului alcalina (rosie) si masa mediului acida (galbena) cu formare de gaze (bule) si ( in circa 90% din cazuri) formare de hidrogen sulfurat (innegrirea agarului).

Cand se izoleaza o Salmonella lactozo-pozitiva, suprafata inclinata a mediului TSI este galbena. Totusi, confirmarea preliminara a culturilor de Salmonella nu trebuie sa se bazeze numai pe rezultatele testului pe agar TSI.

Mediul mobilitate-indol-uree (MIU) - Colonia suspecta se insamanteaza cu ansa de insamantare. Se incubeaza la 37°C timp de 24 ore.

Se interpreteaza schimbarile in mediu dupa cum urmeaza:

- opacifierea mediului:  -- mobilitate + (Salmonella mobila)

- dezvoltarea culture pe linia de insamantare - mobilitate - (Salmonella imobila)

- mediu de culoare roz inchis : -- uree + (Proteus spp)

- mediu de culoare galbena -- uree - (Salmonella spp)

- inel rosu dupa adaugarea reactivului Ehrlich-Kovacs indol +

- inel galben dupa adaugarea reactivului Ehrlich-Kovacs indol - (Salmonella spp)

Interpretarea testelor biochimice

Salmonella in general prezinta reactiile date in Tabel. 1:

a) preluat din referinta (5)

b) aceste procente indica faptul ca nu toate izolatele de serotipuri de Salmonella dau reactii marcate + sau -.

c) procentele nu sunt date in literatura publicata

d) Salmonella typhi este anaerogenica.

e) Salmonella enterica subspecia arizonae da o reactie lactozo- pozitiva sau negativa, fiind necesara efectuarea de teste suplimentare pentru aceasta specie.

Confirmarea serologica si serotipica

Sunt mai multe tipuri de seruri aglutinate continand anitcorpi fata de unul sau mai multi factori antigenici O, adica antiseruri continand una sau mai multe grupe O (antiseruri monovalente sau polivalente), antiseruri Vi si antiseruri continand anticorpi fata de unul sau mai multi factori H ( antiseruri H monovalente sau polivalente). Trebuie sa ne asiguram ca antiserurile folosite pot identifica toate serotipurile de Salmonella. Cercetarea antigenelor O, Vi sau H ale Salmonellei se efectueaza prin aglutinarea pe o lama de sticla cu serul corespunzator, a coloniilor pure dupa eliminarea suselor auto-aglutinabile.

a. Eliminarea suselor auto-aglutinabile

Pe o lama de sticla curata colonia suspecta se suspenda intr-o picatura de solutie salina astfel incat sa se obtina o suspensie omogena si tulbure. Se misca lama timp de 30-60 secunde. Dca bacteriile s-au adunat in gramezi mai mult sau mai putin distincte, susa este considerata atuo- aglutinabila si nu se mai supune incercarilor ulterioare deoarece punerea in evidenta a antigenelor nu mai este posibila.

b. Punerea in evidenta a antigenelor O

Colonia suspecta se suspenda intr-o picatura de antiser O. Daca se produce aglutinarea, reactia este considerata pozitiva. Se utilizeaza serurile polivalente si monovalente unul dupa altul.

c. Punerea in evidenta a antigenelor Vi

Colonia suspecta se suspenda intr-o picatura de antiser Vi. Daca se produce aglutinarea, reactia este considerata pozitiva.

d. Punerea in evidenta a antigenelor H

Se inoculeaza agar nutritiv semisolid cu o colonie pura neaglutinabila. Se incubeaza mediul la 37 C, timp de 24 3 ore. Se utilizeaza aceasta cultura pentru punerea in evidenta a antigenelor H prin suspendarea coloniei intr-o picatura de antiser H. Daca se produce aglutinarea, reactia este considerata pozitiva.

Interpretarea reactiilor biochimice si serologice

Tabel. 2 reda interpretarea testelor de confirmare efectuate pe coloniile folosite.

Confirmare definitiva

Susele considerate a fi Salmonella sau banuite a fi Salmonella (a se vedea tabelul 2), vor fi trimise la un centru autorizat pentru identificarea Salmonellei in vederea determinarii definitive a serotipului.

Expedierea trebuie insotita de toate caracteristicile observate.

CAP. 4. ACTIVITATI FINALE

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Conform rezultatelor interpretarilor se indica prezenta sau absenta Salmonellei in probele analizate.

CAP. 5. RESPONSABILITATI

Limite de autoritate

Pentru executarea in bune conditii a prezentei proceduri limitele de autoritate sunt:

Responsabilitati

Director Executiv

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura.

Sef de Laborator

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura si coraboreaza datele prezentate in buletinul de analiza.

Sef Birou Sanatatea Animalelor

aproba cererea de analiza si primirea probei pentru incercare,

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura si coraboreaza datele prezentate in buletinul de analiza,

verifica prin sondaj, rezultatele incercarilor

Responsabilul de incercare

supervizeaza executia incercarii;

raspunde de corectitudinea executiei;

elaboreaza opinii si interpretari asupra rezultatelor inscrise in buletinul de analiza, prin compararea cu reglementari si normative in vigoare,

redacteaza buletinele de analiza, cu observatiile si concluziile aferente;

valideaza executia incercarii;

confirma rezultatul prin semnatura.

verifica nutritivitatea si selectivitatea mediilor de cultura;

gestioneaza tulpinile de referinta

Executantii de analiza

inregistreaza proba in registrul de analiza;

completeaza fisele analitice ale probelor si toate inregistrarile calitatii referitoare la incercarea din prezenta procedura specifica

inregistreaza in fisele de temperaturi ale aparatelor valorile citite

executa sub supravegherea specialistilor operatiile de pregatire a probelor;

executa incercarea conform regulilor din procedura specifica;

verifica functionarea mijloacelor de masurare si/sau incercare;

pregatesc si aseptizeaza spatiile si suprafetele de lucru;

conditioneaza si verifica starea sticlariei utilizata in incercare;

tehnoredacteaza buletinul de analiza

comunica responsabilului de incercare orice problema aparuta in timpul operatiilor efectuate;

CAP. 6. INREGISTRARI

Registru unic primire probe diagnostic cod R-L-11-1

Registru de diagnostic Necropsic si Bacteriologic cod R-L-11-55

buletine de analiza FG-L-13-01

fisa de diagnostic bacteriologic FL-LBT-01

fisa de monitorizare a temperaturii FG-L-14-11

fisa pentru evidenta tulpinilor de referinta FL-LBT-54

fisa de evidenta a materialelor sterilizate la etuva FL-LBT-56

fisa de solicitare medii de cultura Fl-LBT-57

fisa preparare si aprovizionare cu solutii FL-LBT-58

fisa pentru evidenta control sterilitate si valoare nutritiva a mediilor de cultura FL-LBT-59

fisa pentru evidenta autoclavarii infectelor FL-LBT-60

fisa interna de gestionare a deseurilor din laboratoare FO-L-08-09

CAP. 7. ANEXE

Fisa de diagnostic bacteriologic FL-LBT-01

Fisa pentru evidenta tulpinilor de referinta FL-LBT-54

Fisa de evidenta a materialelor sterilzate la etuva FL-LBT-56

Fisa de solicitare medii de cultura: FL-LBT-57

Fisa preparare si aprovizionare cu solutii FL-LBT-58

Fisa pentru evidenta control sterilitate si valoare nutritiva a mediilor de cultura FL-LBT-59

ANEXA 1

ANEXA 2

ANEXA 3

ANEXA 4

MEDII DE CULTURA

ANEXA 5

Nr. crt	Data prepararii	CANTITATEA	pH-ul	Valabilitatea	Laboratorul unde se prepara	Semnatura
Directia Sanitara Veterinara si pentru Siguranta Alimentelor Cluj Laborator Sanitar Veterinar de Stat CLUJ Pag:  din

ANEXA 6

ANEXA 7