MICROBIOLOGIE

MICROBIOLOGIE

DEFINITIE : metoda de testare a sensibilitatii/ rezistentei la antibiotice si substante chimioterapice, a unei tulpini bacteriene izolate si identificate, dintr-un prelevat patologic.

INDICATIILE antibiogramei :

in infectii cu etiologie bacteriana, determinate de germeni cu sensibilitate variabila la antibiotice,

in infectii bacteriene severe, sistemice (septicemii, endocardite, meningite, peritonite etc) care necesita spitalizare si tratament de lunga durata,

in infectii bacteriene localizate cu tendinta la cronicizare (infectii urinare, biliare, otice, osteomielite, escare etc) in care exista riscul selectarii de tulpini rezistente la antibiotice, datorita persistentei indelungate in organism si supuse permanent presiunii selective a diverselor scheme de administrare a antibioticelor,

in infectii intraspitalicesti : determinate de tulpini bacteriene (Staphylococcus aureus meticilino- rezistent/ MRSA ; Enterococcus faecium rezistent la vancomicina/ VRE ; E. coli, Klebsiella pneumoniae producatoare de beta lactamaze cu spectru extins/ ESBL ; Acinetobacter baumanni, Pseudomonas aeruginosa multultidrog rezistenti etc,) selectate in sectii de terapie intensiva sau diverse profile chirurgicale, datorita tratamentelor cu antibiotice cu spectru larg si de lunga durata,

CONTRAINDICATIILE antibiogramei:

agentul etiologic microbian are o sensibilitate cunoscuta si deocamdata constanta : Ex : sensibilitate la penicilina a tulpinilor de Streptococcus pyogenes (Str. beta hemolitic grup A),

in infectii cu evolutie clinica usoara, tendinta de vindecare spontana, in care tratamentul antibiotic este standard, conform protocoalelor de tratament,

Conditii pentru obtinerea unor informatii corecte:

stabilirea cu exactitate ca germenul izolat este agentul etiologic real (corelarea rezultatelor microscopiei/ morfologia si colorabilitatea bacteriilor intra- si extraleucocitare, cu caracterele culturale si manifestarile clinice),

bacteriile izolate din situsuri anatomice normal sterile (LCR, sange, lichid pleural, peritoneal, colectii inchise etc) sunt de cele mai multe ori, agentul cauzal al infectiei,

bacteriile patogene izolate in culturi mixte, cu flora de asociatie saprofita, trebuie diferentiate, identificate si testate pentru cunosterea sensibilitatii la antibiotice,

- germenul testat pentru aprecierea sensibilitatii la antibiotice si chimioterapice, trebuie sa fie obligatoriu, in cultura pura.

METODE:

METODE DIFUZIMETRICE (KIRBY BAUER)

METODE CANTITATIVE: tehnica dilutiilor in medii de cultura solide sau lichide, tehnica E- test, metode cu citire automata (Microscan, Vitek, ATB Expression/bio Merieux etc)

Tehnica difuzimetrica Kirby Bauer

* Materiale necesare

germenul de studiat (inocul),

geloza Mueller Hinton (valoarea nutritiva permite dezvoltarea majoritatii germenilor, nu contine inhibitori ai actiunii substantelor antimicrobiene),

substante antimicrobiene: antibiotice si chimioterapice (microcomprimate de 6 mm, impregnate cu anumite cantitati, diferite, de substanta antibacteriana activa,

* Principiul metodei : consecutiv depunerii de microcomprimate impregnate cu antibiotic pe suprafata unui mediu solid insamantat cu cultura bacteriana, au loc urmatoarele procese fizico - chimice :

- microcomprimatul absoarbe apa din mediu- necesara dizolvarii substantei antimicrobiene active, care, ajunsa in solutie, va difuza in mediu conform legilor fizice ce conditioneaza difuziunea moleculelor in gelul de agar, prezentand o scadere constanta a gradientului de concentratie, de la marginea discului spre periferie. Sensibilitatea bacteriei la un anumit antibiotic este apreciata dupa marimea diametrului zonei de inhibitie a cresterii, din jurul microcomprimatului impregnat cu antibioticul de testat.

Cu tehnica difuzimetrica nu se pot testa decat germenii cu crestere rapida si constanta.

* Standardizarea conditiilor tehnice si a reactivilor de lucru :

Fiecare din componentele ce concura la efectuarea antibiogramei pot influenta diametrul zonei de inhibitie si, deci, criteriile de interpretare.

1. Mediul de cultura geloza Mueller - Hinton

asigura o dezvoltare buna a majoritatii germenilor patogeni cu crestere rapida,

nu exercita antagonism fata de agentii antimicrobieni,

contine concentratii adecvate de Ca si Mg,

este izotonic pentru sangele care trebuie adaugat in anumite situatii (testarea sensibilitatii streptococilor beta - hemolitici, pneumococilor, neisseriilor, geloza Mueller- Hinton se suplimenteaza cu sange berbec 5- 10%),

pentru testarea sensibilitatii hemofililor, se utilizeaza pentru antibiograma un mediu special, care contine factori de crestere, X, V,

compozitie definita,

asigura reproductibilitate de la lot la lot,

compozitie standard si consistenta corespunzatoare,

pH : 7,2 - 7,4,

grosimea stratului de geloza : 4 mm (25 ml mediu pentru diametrul placii de 90 mm),

2. Germenul de testat :

agentul etiologic de testat sa fie in cultura pura,

contraindicata efectuarea antibiogramei din flora bacteriana mixta,

efectuarea antibiogramei indicata pentru acele specii bacteriene a caror CMI nu e o constanta dinainte previzibila,

se testeaza numai bacteriile cu dezvoltare rapida, uniforma, si indeosebi, acelea care au tendinta de a castiga rapid rezistenta fata de medicamentele de uz clinic,

antibiograma direct din produs se face in cazul produselor biologice normal sterile si contaminate cu un singur germen ( LCR, hemocultura, lichid pleural, urina),

antibiograma efectuata imediat ce se izoleaza si identifica germenul ; stocarea indelungata duce la aparitia determinantilor de rezistenta.

* Inoculul : - sa fie reprezentativ, preparat din 4 - 6 colonii identice,

marimea inoculului riguros standardizata nefelometric (turbiditate standard : 0,5 unitati MacFarland),

insamantarea inoculului pe placi se face la max 15 min de la momentul prepararii,

cu ajutorul unui tampon steril de vata se inoculeaza placa, prin rotare in 3 directii diferite, pana la acoperirea uniforma a suprafetei mediului,

placile insamantate se lasa la temperatura camerei pentru uscarea inoculului inainte de depunerea microcomprimatelor,

daca inoculul si insamantarea placilor s-a efectuat corect, se obtine o cultura bacteriana uniform confluenta.

3. Substante antimicrobiene :

sunt comprimate cu diametrul de 6 mm, iar pe fata este imprimat simbolul respectiv (simbolul denumirii antibioticului: A, TE, CIP, NOR etc, eventual incarcatura de antibiotic pe microcomprimat : 1μg, 5μg.30 μg),

conservarea microcomprimatelor : la adapost de lumina, caldura, umiditate,

inainte de utilizare, se mentin la temperatura camerei 30 min pentru echilibrare termica,

interzisa folosirea comprimatelor cu termen de valabilitate depasit,

selectionarea setului de microcomprimate pentru antibiograma :

2 sau 3 seturi prin combinarea truselor de microcomprimate distribuite :

unul pentru germeni Gram - pozitivi,

unul pentru germeni Gram - negativi,

unul pentru infectii urinare,

set de microcomprimate pentru bacili Gram (-) izolati din infectii digestive,

asezarea spatiala a microcomprimatelor se face pe grupe de agenti antimicrobieni,

depunerea microcomprimatelor se face cu pensa oftalmologica, tip Iris, presand usor fiecare microcomprimat, pentru a ajunge toata suprafata lui in contact cu cultura sau cu ajutorul unui dispozitiv numit « dispencer »,

se va respecta o distanta de 15 mm de la marginea placii si aprox. 24 mm intre marginile comprimatelor sau 30 mm distanta intre centrele lor,

pe o placa de 90 mm diametru se pot pozitiona 8 comprimate.

Placile de antibiograma se incubeaza la 37sC, timp de 18- 20 ore, in aerobioza, dupa care se efectueaza citirea.

Placile cu mediu Mueller Hinton cu 5- 10 % sange de berbec, folosite pentru testarea sensibilitatii streptococilor, pneumocilor, meningococului etc, se incubeaza in atmosfera aeroba, suplimentata cu 5% CO2 (exicator cu lumanare sau plicuri geeneratoare de CO2).

In Laboratorul de Microbiologie Clinica se folosesc seturile mentionate, ale

caror antibiotice sunt strict necesare, in functie de felul germenilor si localizarea

infectiei.

* Citirea, exprimarea si interpretarea rezultatelor

se supun citirii numai placile care prezinta o cultura corespunzatoare dpdv al puritatii si densitatii,

citirea se efectueaza cu ochiul liber, masurand diametrul zonei de inhibitie, in mm, de 2-3 ori, in diferite directii, cu o rigla,

pe mediile fara sange masurarea diametrului se face direct pe fundul placii, in lumina reflectata,

daca s-a adaugat sange, zona de inhibitie se determina prin masurarea la suprafata, in lumina reflectata, dupa indepartarea capacului cutiei Petri.

exprimarea rezultatelor se face in acord cu standardul CLSI, prin incadrarea marimii diametrului de inhibitie a cresterii culturii, in categoriile: sensibil/ S, intermediar/ I, rezistent/ R.

se foloseste programul WHONET de interpretare si raportare a rezistentei germenilor la antibiotice, bazat pe interpretarea conform Standardului CLSI 2008.

* Se iau in consideratie :

colonii mari, bine dezvoltate, aparute in zona de inhibitie, colonii ce reprezinta mutante rezistente in cadrul unei populatii microbiene, predominant sensibile.

astfel de colonii se vor rerepica, identifica, retesta sensibilitatea la antibiotice.

Control de calitate : tulpini de referinta - Staphylococcus aureus ATCC

25923, E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

* Surse de eroare :

alt mediu decat geloza Mueller - Hinton,

mediu necontrolat din punct de vedere al pH - ului,

folosirea microcomprimatelor cu termen de valabilitate depasit,

inocul nestandardizat,

depasirea intervalelor de timp intre prepararea inoculului si insamantare, intre insamantare si aplicarea comprimatelor, intre aplicarea lor si incubare,

perioada de incubare prea scurta,

testarea pe culturi mixte, produse pluricontaminate, pe germeni cu dezvoltare lenta,

citire inexacta a diametrelor zonelor de inhibitie sau transcrierea lor eronata,

lipsa controlului de calitate, cu tulpini de referinta.

Metode cantitative :

- antibiogramele cantitative exprima valoarea CMI si CMB:

* CMI: concentratia minima inhibitorie (cantitatea cea mai mica de antibiotic, capabila sa inhibe dezvoltarea bacteriilor),

* CMB: concentratia minima bactericida (cantitatea cea mai mica de antibiotic care determina efect bactericid).,

- CMI si CMB se exprima in mg/ L sau μg/ mL

a)       Tehnica dilutiilor in mediu lichid:

se prepara in bulion Mueller Hinton dilutii binare, de antibiotic (concentratii descrescande de substanta antibacteriana),

- se adauga in fiecare tub cantitate fixa, standardizata ca densitate a inoculului, de tulpina bacteriana de testat,

- se folosesc martori:

Martor (+) de crestere a culturii/ bulion MH cu tulpina de testat, fara antibiotic

Martor (-): bulion cu antibiotic, fara cultura bacteriana,

- incubare 18-20 ore la 37sC,

! Ultima dilutie care a inhibat cresterea bacteriana corespunde valorii CMI (ultimul tub ramas limpede)

Pentru determinare CMB se fac subculturi (treceri) pe medii solide, din tuburile ramase vizibil limpezi (fara crestere bacteriana).

! CMB corespunde ultimei concentratii de antibiotic care a determinat distrugerea completa a bacteriilor (efect bactericid).

* Interpretare:

- germenii care au un CMI <= 3 mg/L se considera ca sunt influentati de tratamentul cu antibioticul respectiv si procesul inflamator are o evolutie favorabila,

* Indicatiile determinarii CMI:

infectii sistemice, grave: septicemii, endocardite, meningite purulente, osteomielite etc.

b)      Tehnica dilutiilor in mediu solid:

dilutiile de antibiotic se realizeaza in geloza Mueller Hinton,

- placa se imparte in cadrane, sub forma de sectoare de cerc: in fiecare sector se descarca o ansa calibrata incarcata cu inocul standardizat (0,5 MacFarland), din tulpina de testat,

- incubare 18- 20 ore la 37sC,

- CMI: sectorul de placa care contine ultima dilutie de antibiotic, ce inhiba cresterea bacteriana,

* Curbele de concordanta: evidentiaza relatia existenta intre diametrul zonei de inhibitie a cresterii si CMI.

c)   Tehnica E- test se bazeaza pe combinarea celor doua principii: de dilutie si difuzie a diferitelor gradiente de concentratii de antibiotic, in acelasi timp. Ca in orice alta metoda bazata pe dilutii, metoda E- test exprima direct, cantitativ, prin valori CMI, gradul de sensibilitate microbiana.

Stripurile de plastic E- test sunt marcate cu scala valorilor MIC in µg/mL, iar gradientul de antibiotic predefinit exponential este fixat si stabilizat pe suprafata stripului.

Cand stripul este aplicat pe suprafata mediului de cultura inoculat cu suspensia bacteriana standardizata nefelometric (0,5 - 1) are loc un transfer imediat al antibioticului de pe suportul inert, de plastic, in mediul agarizat. Dupa incubare, cresterea bacteriana a devenit vizibila, mai putin in jurul unei elipse.