Procedura corecta de recoltare a sputei

Procedura corecta de recoltare a sputei

Se explica pacientului motivul recoltarii sputei;

Pacientuleste rugat sa isi clateasca gura cu apa inainte de a expectora (aceasta ajuta la indepartarea resturilor de mancare sau a bacteriilor contaminate);

Pacientul este rugat sa inspire adanc de 2 ori, sa-si tina respiratia cateva secunde dupa fiecare inspire si apoi sa expire lent. Dupa al treilea inspire va expira in forta si va incerca sa tuseasca. Aceasta manevra are ca rezultat un produs patologic din profunzimea plamanilor. Bolnavul poate acum sa expectoreze, colectand cu grija sputa in recipientul special;

Daca sputa este insuficienta cantitativ,pacientul trebuie incurajatsa expectoreze din nou pana la obtinerea rezultatului dorit (la unii pacienti este nevoie de timp mai indelungat pentru aceasta manevra!);

Chiar daca Nu se obtine nici o expectoratie, recipientul trebuie considerat deseu infectios!

Daca sa recoltat corect, recipientul trebuie inchis bine si etichetatcorect(pe corpul recipientului si nu pe capac), cu datele complete ale pacientului!;

La sfarsitul operatiunii se spala mainile cu apa si sapun;

Se da un alt recipient la pacient si asistentul se asigura ca pacientul a inteles ca a doua zi va trebui sa isi recolteze singur inca o sputa, imediat dupd trezirea de dimineata;

Se arat pacientului cum se inchide etans recipientul;

Se instruieste pacientul pentru aducerea probei cat mai repede cu putinta la laborator.

Variante de recoltare acceptate

sputa matinala, in primele 1-2 ore de la trezire - procedeu de electie in stationare sau la domiciliul bolnavului(recoltare supravegheata de personalul medical);

sputa colectata in interval de 12-24 de ore;

sputa expectorata pe loc cu ocazia consultului medical.

Cele trei esantioane de sputa necesare la momentul "0" pot fi recoltate in una dintre variantele urmatoare:

3 spute matinale in 3 zile succesive;

2 spute matinale recoltate sub supraveghere medicala in zile succesive + o sputa colectata in 12-24 de ore

2 spute colectate pe loc (la 1-2 ore interval una de alta) + o spua colectata in 12-24 de ore;

3 spute in aceeasi zi la interval de 3-4 ore.

TRANSPORTUL SI CONSERVAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Prelungirea intervalului recoltare-prelucrare reduce sansele evidentierii micobacteriilor din produsele biologice. Cu cat intervalul este mai lung, cu atat creste riscul uscarii produsului, compromiterea viabilitatii bacililor(culturi fals negative) si pierdera colorabilitatii lor (pierdera acido-alcaoolo-rezistentei), precum si cel al contaminarii lor cu germeni din microbiota indigena cu proliferare rapida (constant prezenti in unele produse precum sputa sau urina), fie cu germeni din mediul extern.

Procesul degradarii este accelerat de inchiderea imperfecta a recipientelor, expunerea la lumina solara sau la raze ultra violete(UV), la temperatura ridicata a mediului ambient(in sezonul cald).

Daca prelucrarea produsului patologic nu se poate face imediat dupa recoltare ,acesta se pastreaza la frigider. Nu se admite pastrarea la termostat. Se accepta cel mult pastrarea la temperatura camerei ,la intuneric, pentru cel mult cateva ore.

Transportul probelor biologice, conform cerintelor legislatiei in vigoare este responsabilitatea celui care organizeaza expedierea.

Probel biologice trebuie ambalate astfel incat sa nu se produca scurgeri, si ambalajul sa fie rezistent la socuri, schimbari de presiunesau alte incidente ce pot aparea in urma manevrarii lor, in timpul transportului. Pentru acasta se utilizeza cutiide transport confectionate special, cu o capacitate de 20-30 de recipiente, care sa fie pozitionate vertical. Capacul cutiei trebuie sa fie bine fixat si sa aiba un mecanism de inchidere (incuiere). In timpul transportului, probele trebuie pe cat posibil mentinute la rece si la adapost de lumina.

Formularele de solicitare a examenului bacteriologic insotesc cutia, dar NU se introduc in interiorul acesteia. In afara formularelor de solicitare, cutiile pentru transportul produselor sunt insotie de o lista care permite identificarea probelor si a pacientilor.

Inainte de expediere, trebuie respectate urmatoarele conditii:

numarul de probe din cutie corespunde cu cel de pe lista de identificare

numarul de identificare de pe fiecare recipient corespunde  cu numarul de pe lista de insotire;

lista contine datele necesare pentru fiecare pacient, data expedierii si detaliile despre unitatea sanitara expeditoare.

EXAMENUL MICROSCOPIC

SPUTA

Etalarea:

se marcheaza lame noi, curate si degresate cu numere complete preluate din registrul de laborator, utilizand de exemplu un creion rezistent la sterger, insolubil in alcool, cu creion de grafit daca lamele au capat matuit;

se pun in ordine flacoanel cu produsele patologice;

cu ansa bacteriologica (pipeta Pasteur) se aleg portiuni purulente, opace din sputa sau se preleva o ansa din sedimentul rezultat dupa centifugare (aproximativ 10-20 µl) si se etaleaza in portiune centrala a lamei pe o arie de aproximativ 1×2 cm, fara sa ajunga la marginea lamei; verificam inca o data identitatea sputei;

produsul se intinde uniform pe lama, in strat subtire, astfel incat sa se obtina un frotiu prin care sa se poata vedea literele unui text tiparit, atunci cand este uscat. Frotiul prea gros se poate desprinde de pe lama in cursul colorarii. De asemenea, pe un frotiu prea gros, bacilii acido-alcoolo rezistenti (BAAR) sunt dificil de vizualizat, putand fi mascati de elementele celulare;

Uscarea

lamele se lasa la uscat la temperatura camerei sau pe o platina incalzitoare. Nu se usuca la flacara!.

Fixarea

se tine lama cu pensa si se trece partea opusa a frotiului prin flacara becului de gaz de 3 ori;

trebuie sa realizam fixarea, dar sa nu aiba loc carbonizarea frotiului;

se asteapta racirea lamelor.

Colorarea

Coloratiile folosite pun in evidenta caracterul acido-alcoolo rezistent al micobacteriilor.

Coloratia de referinta pentru evidentierea BAAR este coloratia Ziehl-Neelsen.

In afara de aceasta si diversele ei variante, pentru evidentierea BAAR se pot folosi si substante fluorescente.

Coloratia Ziehl-Neelsen

Colorarea

se aseaza lamele cu frotiurile fixate pe suportul de colorare fara sa se atinga intre ele;

se acopera complet frotiurile cu solutie 0,3% de fucsina fenicata proaspat filtrata;

se trece pe sub lame flacara unui bec de gaz pana la emiterea de vapori, fara sa fiarba;

se repeta actiunea de 3-4 ori in primele 3 minute. Se completeaza cu fucsinea daca aceasta s-a uscat sau s-a scurs de pe lama. Se lasa pana la 10 minute;

se spala cu jet slab de apa de robinet si se scurge apa.

Decolorarea

se acopera frotiul cu acid-alcool 3% si se lasa pentru decolorare maxim 3 minute;

se repeta decolorarea daca frotiul ramane rosu. Dupa decolorare frotiul trebuie sa fie roz pal sau alburiu. O decolorare mai prelungita nu reprezinta neaparat o greseala pentru ca BAAR apartinand complexului M. Tuberculosis sunt intens rezistenti la decolorare;

se spala din nou cu jet slab de apa de robinet si se scurge apa.

Recolorarea

se acopera frotiul cu albastru de metilen 0,3% timp de 30 secunde, maximum 1 minut. Prelungind timpul de contact cu albastru de metilen, fondul frotiului va fi prea inchis la culoare, facand dificila vizualizarea BAAR;

se spala bland sub jet de apa de robinet;

se usuca frotiurile in pozitie inclinata pe suport de lame.

Examinarea frotiurilor colorate Ziehl-Neelsen se face la microscopul optic folosind obiectivul cu imersie si oculare 10× sau 7×.

In nici un caz nu se vor utiliza oculare de 5×!

Examinarea frotiului

Pentru a obtine rezultate bune prin microscopie sunt necesare un microscop bun, un spatiu de lucru corespunzatorsi un examinator experimentat. Citirea frotiurilor trebuie sa fie realizata in mod sistematicsi standardizat, astfel incat sa ofere garantia examinarii unei parti reprezentative din frotiu.

Pentru a avea garantia ca o anume parte din frotiu este examinata o singura data, examinarea trebuie sa fie facuta intr-o maniera ordonata:

frotiurile colorate Ziehl-neelsen se examineaza numai cu obiectivul cu imersie;

frotiurile se examineaza dintr-un capat in celalalt, camp microscopic dupa camp microscopic. Dupa ce se examineaza un camp se trece la urmatorul, miscand lama longitudonal, astfel incat sa poata fi examinast campul alaturat. Fiecare camp se examineaza cu grija, atat in centru cat si la periferie. Nu se imprima lamei o miscare continua in timpul examinarii;

se examineaza minim 100 de campuri inainte ca frotiul sa fie declarat negativ. Un tehnician bun poate examina un frotiu colorat Ziehl-Neelsen in circa 5-7 minute. In cazul unui frotiu care are 2 cm lungime, parcugerea unei lungimi inseamna aproximativ 100 campuri. Daca frotiul este intens pozitiv pot fi examinate doar pana la 25 de campuri;

la sfarsitul examinarii se ia lama de pe platina microscopului, se verifica inca o data numarul si se inregistreaza imediat rezultatul.

Inainte de a incepe examinarea unei lame noi se sterge lentila frontala a microscopului cu hartie moale;

se pastreaza lamele pentru controlul intern si externde calitate conform recomandariilor prevazute in PNCT;

lunar se face analiza procentajului de examene microscopice pozitive. Orice diferenta semnificativa fata de rezultatele obtinute in lunile anterioare trebuie analizata.

Caracteristicile morfologice ale BAAR

BAAR au aproximativ 1-10 µm lungime si apar ca bacili subtiri, drepti sau incurbati;

In colorati Ziehl-Neelsen, BAAR apar ca bacili rosii, drepti sau usor incurbati, uneori cu structura granulara, izolati, in perechi sau grupati, evidentiindu-se clar pe fondul albastru al frotiului.

Exprimarea semicantitativa a rezultatelor examenului microscopic

Rezultatul pozitiv cu 1-3 BAAR trebuie interpretat cu prudenta, fiind necesara examinarea unui alt esantion de sputa!

Cauze de eroare in microscopie

Situatii aprute in cursul procesului de prelevare a produsului patologic:

prelevat al calitatii sau in cantitate necorespunzator;

spalarea insuficienta a recipientelor reutilizabile;

greseli in numerotarea recipientelor de recoltare-acestea trebuie numerotate pe corp, nu pe capac.

Situatii aparute in cursul efectuarii frotiului

erori de identificare a lamelor;

efectuarea a prea multe frotiuri deodata. Se recomanda a nu se efctua mai mult de 12 frotiuri o data;

reutilizarea lamelor, in mod particular al celor pozitive din punctual de vedere al prezentei BAAR; aceasta practica este inacceptabila!!!

utilizarea de lame vechi care prezinta zgarieturi; recomandarea expresa este de a utilize lame noi.

contaminarea prelevatului din cauza utilizarii incorecte a anselor sau pipetelor.

Situatii aparute in cursul colorarii frotiurilor

utilizarea de fucsina nefiltrata

incalzirea excesiva a fucsinei pe lama, putand determina cristalizarea colorantului;

decolorare insuficienta;

lame lipite unele de altele in procesul colorarii.

Situatii aparute in cursul examinarii microscopice

lentila frontala a microscopului nu a fost stearsa intre examinari;

prezenta bacililor in uleiul de cedru, prin atingerea frotiurilor cu aplicatorul;

inregistrarea gresita a rezultatelor;

examinarea superficiala a frotiurilor.

Controlul intern al calitatii examenului microscopic

Asigurarea calitatii este un process continuu care are ca scop crestera eficientei microscopiei si garantarea examenului microscopic ca mijloc de diagnostic si monitorizare a tratamentului tuberculozei.

Controlul calitatii intra in responsabilitatea tuturor celor care lucreaza in laborator. Controlul calitatii trebuie sa fie parte integrate din activitatea zilnica.

Controlul calitatii examenului microscopic este un process de monitorizare interna efectiva si sistematica a performantelor, care garanteaza ca informatiile oferite de laborator sunt exacte, de incredere si reproductibile.

Acest deziderat este indeplinit prin:

aprecierea calitatii produselor patologice prelevate;

monitorizarea performantelor tehnicii de colorare;

monitorizarea calitatii reactivilor;

monitorizarea performantelor echipamentului;

monitorizarea tehnicii de citire.

In fiecare laborator care face examen microscopic pentru diagnosticul bacteriologic al tuberculozei se va tine in mod obligatoriu evidenta scrisa a controlului calitatii, indifferent de nivelul de competentasi responsabilitatiile laboratorului implicat.

Rezultatele pentru frotiurile de control sunt considerate inacceptabile daca:

Pentru coloratia Ziehl-Neelsen:

in frotiul pozitiv nu se evidentiaza BAAR;

in frotiul negative sunt prezenti BAAR sau artefacte rosii la culoare care pot fi confundate cu BAAR;

fondul nu este decolorat corespunzator(este rosu in loc sa fie albastru).

Pentru evitarea erorilor, se iau urmatoarele masuri:

se analizeaza situatia, se identifica motivul erorii si se aplica corectiile necesare

se reia colorarea cu 2 frotiuri de control si a frotiurilor de la pacienti;

rezultatele citirilor pentru frotiurile de control vor fi inregistrate;

se vor curate si pastra lamele cu frotiuri positive si negative conform recomandariilor PNCT in vigoare, in vederea controlului extern al calitatii. Frotiurile pentru control se vor pastra in cutii separate:"control pozitiv BAAR", "control negative BAAR";

Analiza periodica a rezultatelor

rezultatele examenului microscopic se analizeaza lunar calculand rata de pozitivitate astfel:

Numar total frotiuri cu BAAR pozitiv ×100 / Numar total de examinari microscopice = (%) rata de pozitivitate.