Bacili gram pozitivi aerobi - BACILLUS ANTHRACIS

GENERALITATI

Bacillus anthracis face parte din genul Bacillus, gen ce cuprinde 48 de specii, caracterizate prin faptul ca au dimensiuni mari, grupandu-se frecvent in lanturi, formeaza spori centrali sau subterminali, si se cultiva pe medii simple. O singura specie, B. Anthracis, este patogena pentru numeroase animale si pentru om. Unele specii, ca B. Cereus si B. Subtilis pot cauza uneori infectii umane (meningite, pneumonii, toxiinfectii alimentare).

Majoritatea speciilor genului sunt saprofite, larg raspandite in natura (sol, apa, alimente, materii fecale, tegumente, plante, praf, balegar, namol, etc).

MORFOLOGIE-STRUCTURA

Agentul antraxului este un bacil imobil, cu dimensiuni relativ mari, avand 3-15 microni lungime si 2 microni latime, cu capetele "taiate" drept, Gram pozitiv.

In conditii favorabile sporogenezei prezinta un spor central sau subterminal, cu diametrul mai mic decat grosimea bacteriei.

• In produsele patologice bacilii sunt incapsulati, nesporulati, dispusi fie izolati fie in lanturi scurte. Ca urmare a fixarii bacililor capetele lor devin usor concave, lantul imitand trestia de bambus.

Bacillus anthracis, frotiu colorat Gram dintr-o leziune cutanata

• In frotiuri de pe medii simple bacilii sunt necapsulati, sporulati, formand lanturi lungi.

Coloratie Gram, X1500. Observam capetele taiate drept, endosporii elipsoidali, cu localizare centrala, rezistenti la colorare. ( Todar's online textbook of microbiology)

Capsula

Capsulogeneza are loc in organismul animalelor receptive, respectiv al omului.

Evidentierea capsulei prin coloratia cu Tus de India (X1000) si prin folosirea anticorpilor marcati cu floresceina (X1000) (Todar's online textbook of microbiology)

Sporogeneza are loc doar in prezenta oxigenului, pe medii de cultura sau in cadavrele deschise, etc.

Prin coloratiile uzuale, sporii nu se coloreaza, ei apar sub forma unei vacuole ovalare in corpul colorat al formei vegetative. Prin metode speciale, prin metoda cu verde malachit, sporii se coloreaza in verde.

Spori de Bacillus anthracis, microscopie electronica

CARACTERE DE CULTURA

- Aerob, se dezvolta cu usurinta pe mediile uzuale, la un optimum de temperatura de 35-38 grade Celsius.

- Prin crestere in bulion, formeaza flocoane cu depozit pe peretii eprubetei, lasand mediul limpede.

- Pe geloza simpla sau geloza sange, tulpinile virulente dezvolta colonii rotunde, opace, cu suprafata rugoasa, marginile neregulate; au aspectul unei impletituri de filamente "cap de meduza", "coama de leu", caractere de cultura"rough". Uneori, datorita capsulei pot avea caracter mucos.

Colonii de tip "R" pe geloza sange, detaliu

Colonii mucoase( geloza)

PATOGENEZA

Boala afecteaza de obicei animalele ierbivore iar oamenii sunt gazde accidentale.

Animalele prezinta edem al gatului si faringelui cu aparitia edemului glotic si moartea prin asfixie si toxemie; sangerari prin orificiile naturale, febra.

Boala la om

Infectia se transmite prin contactul cu:

1. animalele bolnave (in timpul ingrijirii, sacrificarii, tunderii, etc)
2. produsele obtinute de la animalele bolnave (sange, carne, oase, piele, lana)
3. consumul de produse alimentare provenite de la animalele bolnave
4. exista posibilitatea contaminarii in situatii de criza ( arme biologice)

Nu s-au raportat cazuri de transmitere interumana.

Forme clinice

1. Antraxul cutanat (pustula maligna, buba neagra, dalacul).

Este forma cea mai frecventa.

Daca tabloul clinic e dominat de edem extins, febra ridicata, si stare toxica este vorba de edemul malign, care este o forma grava a carbunelui cutanat

2. Antraxul pulmonar

Este forma cea mai grava.Apare la persoane ce lucreaza in industria pielariei si textila, ce vin in contact cu piele, lana, de la animalele bolnave.

3. Antraxul gastrointestinal

Este forma cea mai rara de antrax. Apare prin ingestia carnii infectate, insuficient preparata termic.

4. Septicemia

5. Meningo - encefalita carbunoasa

Este in general o urmare a septicemiei cu punct de plecare de la nivel cutanat, pulmonar sau gastrointestinal.

Diagnosticul de laborator al infectiei carbunoase la om

Consta in efectuarea unui diagnostic bacteriologic.

Recoltarea produselor patologice - se face in functie de afectiunea clinica, serozitate din vezicula sau pustula, lichid de edem in antraxul cutanat; sputa in antraxul pulmonar; materii fecale in antraxulul gastrointestinal; sangele in septicemii; lichid cefalorahidian in meningita; material necropsic la decedati.

Examinarea macroscopica si microscopica a produsului patologic - serozitatea si lichidul de edem au un aspect hemoragic; sputa din forma pulmonara este hemoptoica, iar materiile fecale din forma digestiva sunt sanghinolente.

Frotiurile realizate din produsele patologice se coloreaza cu albastru de metilen si prin metoda gram. Bacilul antracis apare sub forma unor bastonase cu capetele taiate drept, incapsulati, izolati sau dispusi in lanturi scurte, gram pozitivi. In produsul patologic bacilii apar insotiti de leucocite si de tritusuri celulare. In leziunile vechi capsula dispare dar apar sporii centrali sau subterminali cu diametrul mai mic decat grosimea bacilului.

3. Cultivarea - insamantarea produselor patologice se face pe medii simple (bulion, geloza simpla), geloza sange sau medii selective. Tulpinile virulente de bacil antracis sunt de tip R. In bulion formeaza flocoane ce se depoziteaza pe peretii eprubetei, mediul ramanand limpede (aspect R). Pe mediile solide apar colonii R mari (diametrul de 4-5mm), opace, albe, rugoase cu margini neregulate. Aspectul caracteristic poate fii comparat cu un "cap de meduza" sau " coama de leu". Pe geloza sange nu produc hemoliza.

4. Identificarea - bacilul antracis se identifica pe baza caracterelor morfologice observate pe frotiurile executate din produsul patologic sau din cultura. Cercetarea caracterelor biochimice evidentiaza ca bacilul carbunos elaboreaza catalaza, lichefiaza lent gelatina si serul coagulat de bou( datorita proprietatilor proteolitice ale germenului(mediile insamantate prin intepare pe geloza dreapta dau aspectul unui brad rasturnat), fermenteaza fara producere de gaz: glucoza, maltoza, fructoza, zaharoza, trehaloza, nu fermenteaza: galactoza, lactoza, arabinoza.

Diagnosticul retrospectiv

Se face pe cadravele umane sau animale. In cazul cadavrelor vechi, intrate in putrefactie se foloseste reactia ASCOLI (de termo-precipitare). Culturile in aceste cazuri sunt negative datorita distrugerii bacililor carbunosi de catre flora de putrefactie. Prin reactia ASCOLI se evidentiaza antigenul carbunos in organele cadravelor printr-o reactie de precipitare in inel cu ser anticarbunos.

GENUL CORYNEBACTERIUM

Generalitati

Genul Corynebacterium face parte din familia actinomycetaceae si cuprinde specii saprofite numite difteromorfi (care sunt membri ai florei indigene de la suprafata pielii, nazo - faringelui, orofaringelui, tractului urogenital, tractului intestinal) si specia patogena Corynebacterium diphteriae care este agentul etiologic al difteriei.

Morfologie

Bacilii difterici au o lungime de 2-5μm, sunt Gram pozitivi la limita, nesporulati, necapsulati si imobili. Au o dispozitie particulara, aparand sub forma literelor chinezesti sau cuneiforme. In coloratia Del Vecchio se observa granulele metacromatice (de volutina sau polifosfat).

Caractere de cultura

Clostridium diphteriae sunt bacterii anaerobe si se dezvolta pe medii imbogatite selective si diferentiale. Mediul de imbogatire folosit este OCST, care contine ou, cistina, ser de bou, telurit de potasiu. Mediul selectiv este mediul Loffler, un mediu solid cu ser coagulat de bou (colonii sub forma unor picaturi de ceara).

Mediul Tinsdale e folosit ca mediu diferential, el contine telurit de potasiu si permite diferentierea bacilului difteric de difteroizi (coloniile de bacil dipteric sunt negre, lucioase cu un halon format de sulfura de telur, iar cele pseudodifterice sunt gri inchise sau negre fara halon). Poate fi folosit si mediu cu geoza sange cu telurit de potasiu.

Coloniile ce se formeaza sunt de tip R pentru tulpinile virulente si S pentru cele nevirulente.

Patogenitate

Omul este singura gazda naturala pentru Corynebacterium diphteriae. Trasmiterea se realizeaza pe cale aeriana ( picaturile Pflugge) sau prin contat direct cu purtatorii sanatosi. Pot produce infectii la nivelul leziunilor preexistente ale pielii sau vaginului. In functie de poarta de intrare exista trei tipuri de difterie:

Difteria faringiana (angina difterica). Este cea mai frecventa forma si cele mai frecvente manifestari sunt faringita si tonsilita difterica (angina difterica), uneori difteria nazala (rinita). Cand infectia se localizeaza la nivelul laringelui se produce o laringita.

Bacilii difterici raman intotdeauna cantonati la poarta de intrare si secreta toxina difuzibila A (exotoxina) care se raspandeste in organism.

Toxina are afinitate pentru anumite tesuturi (miocard, glande suprarenale, rinichi, musculatura neteda, sistem nervos), producand degenerescenta parenchimatoasa grava (miocardite) si polipolionerita difterica si paraliziile postdifterice ce afecteaza diversi nervi cranieni (acestea pot apare pana la a 6-a saptamana dupa debutul bolii).

Gravitatea bolii nu consta in prezenta leziunilor de la poarta de intrare (pseudomembrane) decat daca produce asfixie consecutiva crupului difteric, ci consta in actiunea toxinei difuzibile care produce leziuni ireversibile ce pot antrena moartea. Toxina o data eliberata se fixeaza rapid iar actiunea ei este ireversibila (nu mai poate fi neutralizata prin antitoxina).

Alte localizari ale difteriei sunt cele de la nivel cutanat (difteria plagilor chirurgicale) sau extrem de rar difteria vulvara.

Diagnosticul de laborator

Recoltarea produselor patologice pentru examenul bacteriologic:

a)     - la bolnav se detaseaza falsele membrane recoltandu-se exudat din portiunea de sub membrana. In cazul localizarii amigdaliene, recoltarea se face dimineata pe nemancate, fara ca bolnavul sa fii efectuat un tratament cu antiseptice. In cazul altor localizari recoltarea se face cu acelesi precauti, de a nu se fii facut toaleta cu antiseptice sau aplicari de antibiotice. In cazul anginei difterice se recolteaza trei tampoane; de la nivelul leziunii nespecifice se recolteaza trei tampoane si obligatoriu un tampon nazal si un tampon faringian.

b)    - in cazul purtatorilor se recolteaza un tampon nazal si un tampon faringian

Examenul microscopic - din unul din tampoanele recoltate se efectueaza frotiuri colorate Gram si Dell Vechio. Examenul microscopic realizat pe frotiul colorat gram evedentiaza prezenta unor bacili drepti sau usor incurbati, cu extremitati rotunjite, si maciucate, grupati in gramezi, asemanatoare caracterelor cuneiforme sau comparate cu betele unei cutii de chibrituri rasturnate, gram pozitivi la limita. Pe frotiul colorat Dell Vechio se pot observa corpusculii meta-cromatici care sunt granulatii de volutina, cunoscute sub numele de corpusculi Babes-Ernst.

Coloratie Gram

Colѯratie Dell Vechio

Cultivare - bacilii difterici necesita pentru dezvoltare prezenta unor adausuri in mediile de cultura (ser sau sange).

a) - Cel de-al doilea tampon recoltat se descarca direct pe mediile solide specifice:

Mediul Tinsdale - selectiv si diferential (cu sange formolat, telurit de potasiu, tiosulfat de sodiu).

Mediul Gundel-Tietz - diferential cu sange 10%, telurit de potasiu, cistina.

Mediul Loffler - electiv, cu ser coagulat de bou. Mediile se incubeaza 24h la 37C.

b) - Cel de-al treilea tampon se introduce in mediul lichid de imbogatire OCST (ou-cisteina-ser, telurit pentru 12h la 37C, dupa care din acest mediu se insamanteaza pe mediile solide anterior enumerate.

c)     - Tampoanele recoltate in cazul altor localizari se insamanteaza in OCST si apoi pe mediile solide.

d)    - Tampoanele recoltate de la purtatori se insamanteaza in OCST si apoi pe mediile solide.

Se studiaza aspectele coloniilor crescute dupa incubare. Pe mediul Loffler bacilii difterici formeaza colonii mici albe, granulare.

Pe mediul Tinsdale formeaza colonii mici, cenusii negre cu halou cafeniu.

Pe mediul Gundel-Tietz formeaza colonii negre cu aspecte diferite de crestere in functie de biotip (Gravis; Mitis;Intermedius).

- Gravis - aspect de colonii mari cu suprafata granulara, margini crenelate, aspect de margareta cu centrul mai negru (colonii R)
- Mitis - colonii mari sau miojlocii, margini colorate, netede lucioase (colonii S)

- Intermedius - colonii mici plate, centrul negru, suprafata granulara (caractere intermediare intre coloniile R-S).

Pe geloza sange bacilii difterici produc colonii gri cu aspect granular.

Cultura pe mediul Gundel-Tietz

Colonii Corynebacterium Var Gravis

4. Caractere biochimice - caracteristicile metabolice produc diferenteirea de difteromorfi, in special de C. Ulcerans.

- proba cistinazei (realizata pe mediu Pisu cu cistina si acetat de plumb) este pozitiva pentru bacilii difterici. Diftericul transforma cistina in H2S care impreuna cu acetatul de plumb formeaza sulfura de plumb de culoare neagra. Difteromorfii dau proba negativa.

- proba ureazei (realizat in mediul lichid Christensen cu uree si indicator) este negativa pentru bacilul difteric si pozitiva pentru C.ulcerans.

- fermentarea zaharurilor pe mediul Hiss, ajuta la incadrarea in specie si biotip. Bacilul difteric fermenteaza glucoza, difteromorfii fermenteaza zaharoza; polizaharidele sunt fermentate diferit in functie de biotip.

5. Caractere de patogenitate - factorul de patogenitate al bacilului difteric este producerea de exotoxina pentru care se foloseste testul de toxinogeneza. Nu orice tulpina de bacil difteric este toxigena, aceasta proprietate de toxinogeneza este determinata de lizogenizarea cu un bacteriofag (profagul beta specific). Acesta codifica proteina specifica a toxinei.

Testarea toxinogenezei se poate face in vitro prin testul Eleck - Ouchterlony - Frobisher si in vitro pe cobai.

Testul Eleck este o reactie de precipitare in gel (toxina antitoxina). Pe mediul de cultura solid se aplica median o banda de hartie de filtru impregnata in ser specific antidifteric; perpendicular se face insamantarea tulpinii de testat si se termostateaza la 37C 24h. Daca tulpina testata este producatoare de exotoxina apare o reactie antigen-anticorp intre exotoxina si anticorpii difuzati din banda de hartie de filtru. Apar linii de precipitare in unghi de 45 intre banda de hartie si striurile de insamintare. Tulpinile negative nu dau linii de precipitare.

Testul Elek

6. Antibiograma - e necesara pentru stabilirea sensibilitatii la antibiotice pentru instituirea tratamentului adecvat alaturi de cel antitoxic si simptomatic. Antibiograma este importanta si in cazul purtatorilor sanatosi pentru sterilizarea lor.