Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de Treponema, Leptospira, Borrelia

Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de Treponema, Leptospira, Borrelia

Algoritm de diagnostic, demonstratii, interpretare.

Genul Treponema:

germenii din genul Treponema se caracterizeaza prin faptul ca au spirele uniforme, cele de la extremitati fiind mai subtiri.

Treponema pallidum: specia reprezentativa a acestui gen produce sifilisul, boala specifica omului, cu o evolutie clinica caracterizata prin trei stadii cu evolutie variata in timp, separate intre ele prin perioade de acalmie (mute clinic).

Sifilisul este o boala raspandita pe tot globul, care inregistreaza azi o recrudescenta ingrijoratoare.

Treponema pallidum: este un patogen exclusiv uman, nu se intalneste in mediul exterior si are o rezistenta extrem de redusa.

T. pallidum este de forma helicoidala, cu spirale stranse si regulate, cu 7-13 spire. Spiralele sunt atat de fine, inact nu se pot observa decat la microscopul cu fond intunecat sau prin imunofluorescenta.

Nu se coloreaza cu coloranti de anilina, dar reduc nitratul de argint la argint metalic care se depune pe suprafata lor, astfel, treponemele pot fi vizualizate in tesuturi (tehnica de impregnare argentica, Levaditi).

Transmiterea veneriana reprezinta calea aproape exclusiva de contagiune pentru sifilis, in timp ce pentru alte treponematoze, transmiterea se face prin contact tegumentar.

Treponema Reiter: tulpina de laborator, izolata de la om, cultivata pe medii artificiale, in conditii de anaerobioza, nepatogena, are importante inrudiri antigenice cu Tr. pallidum, pe baza carora a fost posibila cunosterea structurii antigenice a treponemelor patogene,

Treponema pallidum - tulpina patogena de laborator (tulpina Nichols): tulpina patogena obtinuta in laborator prin infectarea intratesticulara a iepurilor cu prelevate de la bolnavi de sifilis si mentinute in laborator prin treceri succesive. Sifilisul experimental la iepuri reprezinta singura posibilitate de pastrare in laborator a tulpinilor de treponeme patogene in vederea studiilor si executarii unor teste de diagnostic al sifilisului, de inalta specificitatte.

Cultivare:

modified Eagle's minimum essential medium,

- method for the cultivation and replication of virulent Treponema pallidum: a modified Eagle's MEM plus screened fetal bovine serum (FBS) to a final concentration of about 5% to about 30% and a dilution of about 1:30 of testis extract under a dissolved oxygen tension of about.

- folosirea unui anumit tip de celule, o anumita concentratie de oxigen, agenti reducatori, si factori de crestere, apermis atasarea germenilor pe celule si multiplicarea lor, mai multe generatii.

Patogenitate:

1. Sifilis primar:

se caracterizeaza printr-o leziune numita "sancrul dur"(care se deosebeste de "sancrul moale" determinat de b. Ducrey), ce apare dupa multiplicarea treponemelor la locul de inoculare,

chiar in perioada de incubatie (10- 60 zile/ 25 zile in medie) treponemele disemineaza pe cale limfatica si sanguina, cu declansarea precoce al unui raspuns imun umoral si celular, ce justifica pozitivarea timpurie a unor reactii serologice,

sancrul este localizat in regiunea genitala sau perigenitala,

aspectul unei eroziuni cu baza indurata,

serozitatea sancrului este f. bogata in spirochete, de aceea bolnavul de sifilis cu sancru, constituie cea mai obisnuita sursa de contagiune,

sancrul dur insotit de obicei, de adenopatie regionala,

fenomele locale caracteristice leziunii primare se vindeca spontan in aproximativ 4-6 saptamani, fara sa lase urme evidente, fara alte semne clinice de boala.

2. Sifilisul secundar:

dupa 2-3 luni de la contagiune, apar leziunile caracteristice perioadei secundare, care reprezinta faza de infectie generalizata: treponemele se gasesc in tesuturi si umori,

leziunile secundare constau intr-un exantem papulos rosu, prezent in toate partile corpului si a unor papule umede si palide prezente mai ales, in regiunea ano- genitala, axilara sau gura,

se pot produce si alte manifestari, ca: meningita sifilitica, corioretinita, nefrita etc,

bolnavul este foarte contagios,

dupa cateva luni, leziunile secundare se vindeca spontan, urmand o indelungata faza de sifilis latent, care poate dura ani sau zeci de ani,

se admite ca la 20-30% dintre bolnavii netratati, nu se mai inregistreaza aparitia manifestarilor tertiare.

3. Sifilis tertiar:

la bolnavii netratati sau tratati insuficient, dupa faza de latenta, apar manifestari tertiare, limitate la un anumit nivel si sunt sarace in treponeme,

se descriu leziuni granulomatoase (gome sifilitice), tegumentare si ososase, modificari degenerative in SNC (tabes, paralizie generala progresiva), leziuni cardiovasculare (aortitta, insufucienta valvulara aortica), hepatice,

Azi, este frecvent sifilisul "asimptomatic" sau "decapitat", inregistrat la persoane infectate, in cursul unui tratament intamplator cu antibiotic, dar in doze insuficiente pentru a distruge treponemele.

4. Sifilis congenital

ca o consecinta a faptului ca treponemele strabat placenta, sifilisul congenital se inregistreaza la copiii nacuti din mama infectata in cursul sarcinii,

o bolnava de sifilis in momentul conceptiei sau in primele luni de sarcina, de obicei, avorteaza sau naste un fat mort,

o mama care contacteaza boala in a 2- a jumatate a sarcinii va da nastere unui copil cu sifilis congenital; tratamentul corect al mamei in cursul sarcinii permite insa dezvoltarea normala a fatului si previne sifilisul congenital.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR:

1. Punerea in evidenta a Tr. pallidum prin examen direct (diagnostic bacteriologic):

in sifilisul primar: exudat din sancru, aspirat ganglionar, biopsii,

in sifilisul secundar: exudat din leziuni, biopsii,

in sifilisul tertiar: LCR, piese biotice sau necroptice,

in sifilisul congenital precoce: prelevate din cordon ombilical, placenta, secretii, nazale, leziuni cutanate,.

* Diagnosticul etiologic/ bacteriologic:

a)     evidentierea Tr. pallidum in microscopia pe fond intunecat:

acest examen se poate efectua numai atata timp cat exista sancrul,

germenul fiind anaerob, se va gasi numai sub crusta caracteristica, existenta pe fundul sancrului,

dupa spalarea leziunii cu ser fiziologic, cu o pipeta Pasteur deschisa, se incearca indepartarea cu blandete a crustei, pentru a evita sangerarea, (prezenta hematiilor face imposibila vizualizarea treponemelor la ex. ultramicroscopic),

in extremitatea deschisa, f. subtire a pipetei Pasteur, se va ridica spontan, prin capilaritate, un lichid limpede, care reprezinta serozitatea din sancru.

din aceasta serozitate se vor efectua preparate umede lama- lamela, ce vor fi examinate la microscop cu camp intunecat,

pe fondul intunecat se vizualizeaza treponemele, identificabile prin forma caracteristtica si marea lor mobilitate, fiind specifica miscarea de flexiune, care diferentiaza treponemele patogene de cele saprofite,

b)    Microscopia fluorescenta (DFA- TP: Direct Fluorescent Antibody test for T. pallidum):

cea mai specifica tehnica pentru evidentierea Y. Pallidum in exudatele leziunilor sifilitice, LCR sau alte specimene.

- preparatele se coloreaza argentic, apoi se efectueaza coloratia imunofluorescenta, cu conjugate monoclonale specifice T. pallidum.

- microscopia fluorescenta pentru preparate histopatologice evidentiaza in modul cel mai specific prezenta T. pallidum ,

- evidentierea T. pallidum in tesuturi reprezinta un diagnostic definitiv de sifilis.

2. Punerea in evidenta a anticorpilor prin examene serologice.

Diagnosticul sifilisului intampina dificultati, datorita, in principal, urmatoarelor cauze:

timpul f. scurt (1- 2 saptamani) in care se poate efectua diagnosticul bacteriologic prin evidentierea germenului in produsul patologic,

lipsa unei reactii serologice "perfecte",

greutatile tehnice care nu permit prepararea unor antigene de inalta specificitate,

Diagnostic serologic:

- prezenta anticorpilor aparuti in urma contactului organismului cu Tr. pallidum se evidentiaza prin 2 mari categorii de teste:

a) teste cu antigene cardiolipinice,

b) teste cu antigene treponemice

a)     Teste cu antigene cardiolipinice:

- antigenul e reprezentat de extracte lipoidice nespecifice (nu provin din organismul treponemic), cel mai folosit fiind extractul alcoolic, purificat din muschi din cord bovin, numit cardiolipina; el evidentiaza anticorpii antilipoidici.

a.1.) Reactia de floculare (VDRL):

- Avantaje: se executa prin tehnici usor reproductibile, mare sensibilitate: pozitivandu- se inaintea altor reactii si negativandu- se printre ultimele,

- Dezavantaje: lipsa de specificitate, dand cel mai mare procent de rezultate biologic fals pozitive, la persoane care nu aveau sifilis,

- principiul testului: antigenul lipic ramane dispersat cu serul normal, dar formeaza aglutinate vizibile cand se combina cu reaginele,

- rezultatul de citeste in cateva minute,

- acest test este folosit pentru screening si supraveghere epidemiologica, datorita costului redus,

a.2.) RPR:

- antigenul VDRL modificat contine microparticule de carbune care agrega in prezenta anticorpilor de tip reaginic din serul pacientulului;

- reactie calitativa si semicantitativa;

- detecteaza anticorpi nespecifici pentru infectia cu Treponema pallidum produsi ca reactie la materialul lipoid eliberat din celulele afectate ale gazdei si la materialul lipoproteic eliberat de spirochete,

- sensibilitatea testului poate fi redusa la temperatura scazuta,; cele mai bune rezultate se obtin intre 20- 25°C,

!!! VDRL si RPR pozitive devin negative dupa 6-18 luni de tratament efectiv al sifilisului.

a.3.) Reactia de fixare a Complementului Bordet - Wassermann (RFC "la cald"):

- avantaje: specificitate mai mare decat la reactiile de floculare,

- dezavantaje: sensibilitate mai mica, tehnica laborioasa.

Foloseste antigen cardiolipinic.

Sistem hemolitic: sange de berbec defibrinat, ser hemolitic (Ac) in concentratie de 4X > decat cea stabilita prin titrare. Sensibilizarea se face prin amestecarea brusca a celor doua solutii.

Complementul: seruri de cobai.

I etapa a reactiei: Complement + Sistem hemolitic:

incubare 10 min, la 37°C,

Prepararea antigenului: diluarea antigenului cardiolipinic in solutie fiziologica 1/ 120.

Ser de bolnav: inactivate in dimineata zilei in care se practica reactia.

- reactia poate fi efectuata calitativ (ser de cercetat nediluat) sau cantitativ (cu dilutii de ser),

- pentru fiecare serie de seruri de cercetat se folosesc controale de seruri pozitive si negative,

(Ag, Ac, C, hematii)

a)     Ac(+):

reactie pozitiva  (+), (++), (+++), (++++): hematiile cad in BUTON, cu ser roz deasupra,

b) Ac (-): Ag + C + hematii: HEMOLIZA (lichid rosu omogen in tuburile de reactie).

b)    Reactii serologice care utilizeaza antigene treponemice:

b.1.) Tehnici serologice care utilizeaza antigene treponemice extrase din Treponema  Reiter (specifice de grup), de tip RFC si CIE,

b.2.) Reactii serologice ce utilizeaza antigene treponemice extrase din Treponema Nichols (de utilitate practica):

* Testul de hemaglutinare (Treponema pallidum Hemagglutination Test, TPHA)

- Principiu: se utilizeaza hematii de pasare special conservate si sensibilizate (invelite in antigene treponemice din tulpina Nichols), care se leaga de anticorpii specifici prezenti in serul sau plasma pacientilor bolnavi de sifilis. Aceste celule se afla in suspensie intr-un mediu care contine substante destinate a elimina reactiile nespecifice,

- reactiile pozitive sunt reprezentate de godeurile unde are loc aglutinarea celulelor,

- reactiile negative sunt reprezentate de godeurile in care, hematiile sensibilizate nu intalnesc anticorpii specifici din serul testat si nu aglutineaza, cad "in buton" sau formeaza un inel la baza godeului,

- se utilizeaza obligatoriu martori de reactie pozitivi si negativi.

* Testul imobilizarii treponemelor (TPI):

serul de cercetat diluat, era pus in contact cu complement si treponeme vii, mobile, recoltate din serozitatea sancrului dur, obtinut experimental, pe testicule de iepure,

- in prezenta anticorpilor specifici, treponemele erau imobilizate, in timp ce in lipsa acestore, mobilitatea era pastrata (miroscopie cu fond intunecat)

* Teste de imunofluorescenta indirecta (FTA- Abs):

se foloseste tulpina Reiter pentru a se cupla cu anticorpii nespecfici, comuni, determinati de treponeme atat patogene, cat si comensale,

- astfel sunt indepartati anticorpii nespecifici,

- pe lame de sticla sunt depuse tulpini de Treponema  Nichols/ pallidum, pe care se fixeaza anticorpii specifici, ramasi in serul sau plasma de bolnav, dupa indepartarea celor nespecifici, formand complexe antigen- anticorp,

- se adauga conjugat fluorescent anti- Ig umane,

- la examinarea la microscopul cu fluorescenta, treponemele din complexele marcate fluorescent, apar galben- verzui.

* Tehnica ELISA:

utila pentru detectia Ac tip Ig M si IgG, anti- Treponema pallidum, in infectii intra- uterine.

Aspecte biologice. De rutina, diagnosticul sifilisului se bazeaza pe metodele serologice care sunt disponibile in majoritatea laboratoarelor. Metodele directe (microscopia cu fond intunecat, imunofluorescenta, inocularea la animal) raman apanajul laboratoarelor  de specialitate. Raspunsul imun fata de infectie include producerea de anticorpi fata de o paleta larga de antigene, fiind implicati atat anticorpi nespecifici (anticardiolipina/reagine) cat si anticorpi specifici antitreponemici. Primul raspuns demonstrabil este reprezentat de anticorpii specifici antitreponemici de tip IgM, care pot fi detectati la sfarsitul celei de a 2-a saptamani de infectie; anticorpii antitreponemici de tip IgG apar mai tarziu, in saptamana a patra. Astfel, la debutul simptomatologiei clinice majoritatea pacientilor prezinta anticorpi IgM si IgG.
Anticorpii nespecifici se pozitiveaza dupa aproximativ 4 saptamani de la contactul infectant. Tratamentul si infectia HIV asociata pot afecta raspunsul imun. Titrul anticorpilor nespecifici si cel al anticorpilor specifici IgM scade rapid dupa tratamentul adecvat in sifilisul precoce, dar anticorpii specifici IgG persista indefinit.
Testele non-treponemice sunt rapide, usor de efectuat, au un cost redus si prezinta o sensibilitate foarte buna, in special in stadiul precoce al infectiei. Principalul lor dezavantaj este ca se asociaza cu o rata importanta de rezultate fals pozitive, in special la gravide (la aceasta categorie, aproximativ 28% din rezultatele pozitive pentru RPR pot fi biologic fals pozitive).

Rezultatele pot fi exprimate calitativ sau semicantitativ; titrurile VDRL/RPR sunt crescute la pacientii cu infectie acuta, reinfectie sau reactivare a unei infectii din antecedente care nu a fost tratata adecvat. Aproximativ 72-84% din pacientii cu sifilis primar sau secundar prezinta o scadere de 4 ori a titrului VDRL/RPR, la 6 luni dupa incheierea unui tratament corect. Rata seroreversiei depinde de titrul pretratament si stadiul bolii.

Indivizii care prezinta primul episod de infectie au sanse mai mari de seroreversie decat cei cu infectii repetate. Astfel, testele non-treponemice sunt utile nu numai pentru identificarea infectiei ci si pentru monitorizarea eficientei tratamentului.
Testele treponemice sunt folosite pentru a confirma testele screening pozitive. Au o incidenta de rezultate fals pozitive mai scazuta decat testele reaginice. Nu sunt in general recomandate pentru screening-ul infectiei deoarece au sensibilitate mai redusa decat testele non-treponemice in primele 2-3 saptamani ale stadiului de sifilis primar. Acest tip de anticorpi persista toata viata; nu sunt utili in monitorizarea eficientei terapeutice.
Testele imunoenzimatice EIA care folosesc antigene treponemice recombinate in placi cu godeuri pentru a detecta anticorpi IgG si IgM au o sensibilitate similara testelor non-treponemice si o specificitate echivalenta testelor TPHA si FTA-ABS. Din aceste motive, testele EIA pot reprezenta o alternativa eficienta la asocierea traditionala a testelor non-treponemice si treponemice, pentru diagnosticul definitiv al sifilisului. Testele EIA IgM sunt mai sensibile decat FTA-ABS IgM si pot fi folosite pentru diagnosticul sifilisului precoce sau congenital.
Sifilisul congenital. La nastere nou-nascutul are acelasi profil serologic ca al mamei de la care s-a facut transferul pasiv al IgG si care vor disparea in primele 3-6 luni la un copil neinfectat. Controlul serologic al copilului neinfectat se face cu scopul de a urmari scaderea progresiva a titrului anticorpilor. Pentru copilul infectat si tratat, anticorpii  antitreponemici persista mult timp si numai scaderea semnificativa a VDRL -ului permite urmarirea eficacitatii  tratamentului. Dozarea IgM la nou-nascut, face  diferentierea intre pasajul pasiv de anticorpi materni (IgG) si sinteza activa de IgM de catre nou-nascut. Un profil serologic cu IgM negativ nu exclude diagnosticul de sifilis congenital, daca mama a fost infectata tardiv in cursul sarcinii.
Serodiagnosticul la gravide. Asa cum s-a mentionat mai sus, testele non-treponemice sunt asociate cu o rata semnificativa de rezultate fals pozitive, in special in prezenta unor titruri scazute. De aceea, in zonele cu prevalenta mare a infectiei unde accesul la testele de confirmare este limitat, gravidele care prezinta un titru ≥ 8 trebuie obligatoriu sa primeasca tratament. Cu toate acestea, avand in vedere morbiditatea si mortalitatea asociate cu infectia congenitala si  lipsa de acces in multe zone la teste RPR cantitative, se recomanda ca toate gravidele care prezinta un rezultat pozitiv la testele non-treponemice sau treponemice sa fie tratate imediat. Riscurile asociate cu un sifilis netratat in perioada sarcinii depasesc cu mult riscul tratamentului necesar la mamele cu un rezultat fals-pozitiv.
Sifilisul si infectia HIV. La majoritatea pacientilor HIV pozitivi raspunsul serologic pentru infectia cu Treponema pallidum este nemodificat. Sunt rare cazurile in care s-au raportat reactii negative sau slab pozitive pentru un pacient cu sifilis secundar.

Exprimarea rezultatului:
Pentru VDRL/RPR:
- negativ (-);
- pozitiv  (de la  + la ++++). Daca se efectueaza un test semicantitativ, se va comunica impreuna cu intensitatea reactiei si titrul corespunzator ultimei dilutii care a indicat un rezultat pozitiv.
Pentru TPHA:
- negativ (-);
- echivoc;
- pozitiv (de + la ++++).

Algoritm de diagnostic. Un algoritm simplu pentru diagnosticul de sifilis se face pornind de la VDRL si TPHA.

VDRL = negativ; TPHA = negativ:
-   serologie negativa;
-  rezultatul nu exclude un diagnostic de sifilis la debut; in caz de suspiciune clinica se recomanda repetarea serologiei peste 2 saptamani sau efectuarea FTA-ABS IgM sau  EIA IgM care se pot pozitiva precoce.
VDRL = negativ; TPHA = pozitiv:
-   infectie veche tratata;
-   eventual ar mai putea fi vorba de un sifilis intr-o faza foarte timpurie: in caz de suspiciune clinica se recomanda repetarea serologiei peste 2 saptamani sau efectuarea FTA-ABS IgM sau  EIA IgM;
-   alte posibilitati: reactie fals pozitiva la TPHA, sifilisul latent tardiv la care diagnosticul este uneori dificil, reactii incrucisate cu treponematozele non veneriene (pian, bejel, pinta) la pacientii originari din zone endemice.
VDRL = pozitiv; TPHA = pozitiv:
-   sifilis recent sau vechi, netratat sau tratat tarziu.
Nota: in sifilisul primar valorile sunt slab pozitive, in cel secundar, titrul anticorpilor este crescut. In absenta semnelor clinice, un  nivel  la limita al anticorpilor face dificila interpretarea serologica. Se pune problema unui sifilis latent precoce sau a unui tratament antibiotic urmat de pacient. La pacientii tratati tardiv, serologia poate ramane pozitiva, dar urmarirea in dinamica a titrului anticorpilor cu diminuarea semnificativa a VDRL -ului ajuta la stabilirea diagnosticului.
VDRL = pozitiv; TPHA = negativ:
-   in cazul unui VDRL intens pozitiv, este cel mai probabil  vorba de un rezultat biologic fals pozitiv (se pune adesea problema existentei anticorpilor anticardiolipinici); oricum se recomanda repetarea serologiei peste 2-3 saptamani (eventual determinari cantitative in dinamica) -    in cazul unui VDRL slab pozitiv se recomanda efectuarea FTA-ABS; daca acest test este negativ este vorba de un rezultat biologic fals pozitiv; daca testul este pozitiv poate fi vorba de un sifilis precoce si in acest caz se recomanda repetarea serologiei peste 2-3 saptamani (profilul serologic cel mai frecvent intalnit in sifilisul primar este VDRL+, TPHA +; foarte rar, in stadii precoce ale sifilisului primar, TPHA este negativ, FTA-ABS fiind pozitiv).

Recomandari

Recomandari pentru determinarea serologiei sifilis: in prezenta semnelor si simptomelor de infectie cu Treponema pallidum sau alte boli cu transmitere sexuala;
- test screening prenatal (in trimestrul I, III si la nastere);
- test screening premarital;
- test screening la angajare, asigurari de viata, etc.;
- test screening pentru donatorii de sange si de organe;
- detectarea sau excluderea infectiei la pacientii HIV pozitivi;
- monitorizarea raspunsului la tratament (RPR cantitativ).

Pregatire pacient

Se recolteaza a jeun (pe nemancate).

Specimen recoltat

a. pentru VDRL: sange venos;

b. pentru TPHA: sange venos, lichid cefalorahidian.

Recipient de recoltare -a. pentru sange venos: vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator; b. pentru lichid cefalorahidian: recipient steril cu dop infiletat.

Cantitate recoltata - a. 5 ml pentru sange venos; b. 1 ml pentru LCR.

Cauze de respingere a probei

1. Pentru sange venos:

a. pentru VDRL: specimen lipemic (apar rezultate care nu pot fi interpretate);

b. pentru TPHA: specimen hemolizat, lipemic, contaminat bacterian (apar rezultate care nu pot fi interpretate).

Prelucrare necesara dupa recoltare

- a. pentru sange venos: se separa serul prin centrifugare; determinarile se executa imediat; daca acest lucru nu este posibil, serul se pastreaza la 2-8° C sau la - 20° C;

b. pentru lichid cefalorahidian: LCR se centrifugheaza; se separa supernatantul; se lucreaza imediat; daca acest lucru nu este posibil, supernatantul se pastreaza la  2-8° C sau la - 20° C.

Stabilitate proba - serul si supernatantul lichidului cefalorahidian sunt stabile: 7 zile la 2-8° C si timp indelungat la - 20° C.

Limite si interferente

A. Pentru VDRL: Reactii fals pozitive:
- infectii bacteriene: pneumonie pneumococica, scarlatina, lepra, febra recurenta, endocardita bacteriana, malarie, rickettsioza, psittacoza, leptospiroza, sancrul moale, tuberculoza, pneumonie cu mycoplasma, tripanosomiaza;
- infectii virale: variola, varicela, rujeola, mononucleoza infectioasa, oreion, hepatita virala, SIDA;
- cauze neinfectioase: graviditate, boli hepatice cronice, neoplasme avansate, mielom multiplu, boli ale tesutului de colagen, transfuzii multiple, varsta inaintata.
Serurile puternic lipemice (lactescente) pot influenta testul.

B. Pentru TPHA: Reactii fals pozitive:
- mononucleoza infectioasa, lupus, lepra, malarie, febra recurenta, leptospiroza;
- nivel anormal de Ig G sau Ig M;
- treponematoze nevenerice: pian, bejel, pinta;
- serurile puternic lipemice (lactescente) pot influenta testul.

Pentru serurile pozitive sau echivoce se recomanda efectuarea reactiei FTA - ABS care permite diferentierea anticorpilor IgM de cei IgG.