Determinarea secventei primare a acizilor nucleici - Strategie si modalitati

Determinarea secventei primare a acizilor nucleici

Strategie si modalitati

Strategia curenta de secventializare a acizilor nucleici este formata din trei etape, conforme cu principiile comune de analiza a polimerilor:

a) acidul nucleic este intotdeauna prea lung pentru a fi secventializat direct si trebuie fractionat in fragmente de marime adecvata. Acestea sunt separate, fiecare fiind apoi supus secventializarii;

b) prin scindarea diferita a fragmentului de secventializat, se produc amestecuri de segmente de oligonucleotide, de diferite lungimi (pentru fiecare tip de scindare) care se suprapun;

c) separarea si identificarea componentelor fiecaruia dintre aceste amestecuri si apoi compararea lor in scopul reconstituirii secventei initiale a fragmentului.

In raport cu secventializarea proteinelor, secventializarea initiala a acizilor nucleici a fost mai complicata deoarece: i) structura ADN este dublu catenara; ii) macromoleculele sunt mult mai lungi; iii) prezenta a numai a patru baze, face ca varietatea monomerilor sa fie redusa si eventuala identificare a produsilor de hidroliza sa constituie o operatie delicata.

In concluzie, inceputurile in secventializarea acizilor nucleici au fost tributare modalitatilor de scindare si de fractionare a oligonucleotidelor. In rezolvarea acestei probleme, deceniul 1970-1980 a fost decisiv.

Inainte de 1970 cercetatorii nu dispuneau nici de endonucleaze specifice si nici de modalitati de scindare echivalente degradarii Edman. Secventializarea realizata pentru ARNt pentru alanina a constat in: i) scindarea partiala cu ajutorul ribonucleazelor T1 si A (Tabel 2.4); ii) suprapunerea fragmentelor obtinute in urma actiunii secventiale a unei exonucleaze (una din fosfodiesterazele din Tabelul 2.4); iii) analiza produsilor prin cromatografie.

In aceste situatii, pentru a stabili secventa celor 72 de nucleotide ale ARNt pentru alanina, i-au fost necesari mai multi ani lui R. Holley. Abia in 1965, la mai mult de 10 ani de la secventializarea insulinei de catre E. Sanger, a fost posibila elucidarea structurii materialului genetic din structura unor fagi de aproximativ 4 000 nucleotide.

Anii 1970 marcheaza descoperirea endonucleazelor de restrictie si primele realizari ale tehnicilor de biologie moleculara, printre care si clonarea care permitea multiplicarea moleculelor de ADN disponibile.

La baza evolutiei ulterioare a secventializarii ADN au stat doua metode care se bazeaza pe un principiu comun:

i) ADN era decupat in fragmente cu enzime de restrictie si catenele sunt separate;

ii) utiland modalitati specifice de tratare pentru fiecare baza, se obtin patru ansambluri de fragmente de marimi diferite (prin intermediul unui semnal care identifica inceputul sau sfarsitul catenei);

iii) separarea fragmentelor in functie de marime rezolva problema secventializarii.

Diferenta dintre cele doua metode consta in modul de obtinere a ansamblurilor de fragmente: una din metode se bazeaza pe scindarea chimica (metoda introdusa de A. Maxam si W. Gilbert), cealalta se inspira din procesul de replicare si se bazeaza pe tehnologia sintezei enzimatice (metoda Sanger).

Cu toate ca metoda Maxam si Gilbert a cedat de mult locul metodei Sanger, pentru care la ora actuala exista numeroase variante, confruntarea dintre cele doua conceptii ramane interesanta. In continuare vom descrie principiul si numai cateva aspecte tehnice pentru fiecare metoda.

Metoda chimica Maxam W. Gilbert

Metoda de secventializare chimica este formta din mai multe etape. Fragmentul de ADN care urmeaza a fi secventializat este marcat la una dintre extremitati printr-un semnal care va permite detectarea sa. Cea mai frecventa tehnica este marcarea cu fosfor radioactiv (³²P). Aceasta se realizeaza in doi timpi: i) modificare-eliminare baza; ii) hidroliza alcalina a grupelor fosfodiester, posibila prin pierderea sau deschiderea ciclului bazelor. Scindarea este dubla fiind realizata atat la capatul 3' cat si la cel 5'.

Specificitatea taieturii este data de reactivii utilizati si de conditiile de reactie:

a) pirimidinele: hidrazinoliza; in conditii controlate de tarie ionica este realizata degradarea preferentiala a citozinei sau a ambelor pirimidine (C si T);

b) purinele: metilare cu protonare; alegerea pH este decisiva pentru orientarea reactiei catre guanina sau catre ambele purine (G si A).

Separarea produsilor se realizeaza prin electroforeza in gel de poliacrilamida urmata de autoradiaografia fragmentelor pentru reconstituirea secventei (Figura 2.12

Figura 2. 12. Principiul si prezentarea schematica secventializarii prin metoda Maxam si Gilbert.

Metoda "dideoxi" a lui F. Sanger

F. Sanger, pionierul secventializarii insulinei, a conceput o metoda geniala de secventializare care se bazeaza pe principiul replicarii. Analiza structurii ADN si a rolului sau in exprimarea genelor a fost usurat enorm de punerea la punct a acestei tehnici de secventializare. Esenta tehnicii de secventializare a ADN, propusa F. Sanger si colaboratorii, a constituit-o generarea de fragmente a caror lungime era dependenta de ultima baza din structura secventei. Colectii de astfel de fragmente au fost generate prin intreruperea controlata a sintezei enzimatice. Aceasta tehnica s-a impus in fata celorlalte tehnici de secventializare datorita simplitatii sale.

Pentru intelegerea principiului sunt necesare informatii privind imperecherea specifica a bazelor in structura ADN si sinteza catenelor complementare cat si asupra modului de actiune al polimerazei. Sanger a utilizat ADN polimeraza I bacteriana care realizeaza o copie complementara a catenei matrita ADN utilizand nucleotid trifosfati (dNTP).

Principiu

Acelasi procedeu este aplicat pentru patru amestecuri de reactie, in acelasi timp. In toate, ADN polimeraza este folosita pentru a sintetiza catena complementara unei secvente matrita pornind de la un fragment oligonucleotidic (primer) complementar cu capatul 5'-3' al matritei.

a) Fragmentul care urmeaza a fi secventializat (matrita), este denaturat, pentru obtinerea de monocatene, si adus in contact cu un primer. Hibridizarea primerului cu matrita monocatenara permite initierea actiunii ADN polimerazei, in prezenta substratelor nucleotidice dNTP;

b) In fiecare dintre cele in patru loturi se adauga o mica cantitate dintr-un 2'-3'dideoxiribonucleotid trifosfat (ddNTP) diferit, analog cu una dintre nucleotide. Incorporarea acestui analog, in locul unei nucleotide normale, blocheaza alungirea datorita lipsei hidroxilului din pozitia 3' terminala. Din acest considerent ddNTP au fost denumite molecule terminatoare de catena. Concentratia lor este destul de mica pentru a opri sinteza numai ocazional;

c) Prin electroforeza in gel de poliacrilamida se realizeaza separarea fragmentelor din cele patru loturi. Marimea diferita a fragmentelor este datorata opririi copierii catenei matrita la un anumit nivel, corespunzator fiecaruia dintre cele patru tipuri de ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP si ddTTP). In figura 2.13 este prezentata simplificat schema principiului reactiei si modalitatea prin care se deduce direct, din lectura gelului, secventa catenei complementare, deci cea a matricei de secventializat. De remarcat ca rezolutia gelului trebuie sa fie de o nucleotida;

d) Determinarea secventei a fost realizata de Sanger prin autoradiografia gelului deoarece unul dintre dNTP introduse in reactie era marcat radioactiv cu ³²P sau ³⁵S, izotopi capabili sa impresioneze un film fotografic.

Aceasta metoda ingenioasa i-a permis lui F. Sanger, in 1977, sa stabileasca prima secventa completa de 5386 baze a bacteriofagului FX174. Total automatizata ulterior, tehnica a permis descifrarea completa a genoamelor multor organisme procariote si eucariote si a fost folosita cu succes in amplul proiect de secventializare a genomului uman. Secventializarea clasica a acizilor nucleici inventata de Sanger are la ora actuala o serie de variante care au facut-o sa se impuna ca singura alternativa viabila de determinare a secventei acizilor nucleici. Toate aceste variante se bazeaza pe principiul initial de sinteza de fragmente complementare cu matrita de analizat. Diferentele constau in evolutia spectaculoasa a modalitatilor de separare si identificare a acestor fragmente. Detectarea fluorescenta reprezinta o alternativa viabila pentru tehnica autoradiografica. Acum, se folosesc primeri sau nucleotid trifosfati marcati fluorescent a caror separare se realizeaza prin electroforeza in gel de acrilamida sau prin electroforeza capilara. Marcarea fluorescenta ofera posibilitatea combinarii amestecurilor de reactiei urmata de separarea electroforetica a ansamblului. Benzile obtinute pot fi detectate independent in functie de reactivul cu care au fost marcate. O alternativa a metodei foloseste analogi dideoxi marcati fluorescent diferit care permit realizarea tuturor reactiilor intr-o singura etapa (tub). Folosirea marcarii fluorescente si evolutia interesanta a sistemelor de detectare si a programelor de interpretare a rezultatelor a permis automatizarea tehnicii si extinderea aplicatiilor acesteia. (Figura 2.14). Astazi, pe langa secventializare, tehnica permite analiza de fragmente (genotipare) si identificare de mutatii punctiforme la nivelul moleculelor ADN.

Figura 2. Metoda Sanger: a) Principiul de sinteza a catenei complementare si modul de interventie al ddNTP; b) Prezentare schematizata a realizarii practice a secventializarii. In urma electroforezei celor patru loturi se obtine secventa catenei complementare

Sinteza chimica a polimerilor nucleici

Polinucleotidele au devenit repede unelte si materiale de experienta, astfel incat sinteza acestora s-a impus din ce in ce mai acut. Sinteza polimerilor nucleotidici ridica aceleasi probleme ca si cea a polipeptidelor. Este necesara: i) activarea gruparii care este implicata in legatura, impiedicandu-le, in acelasi timp, pe celelalte sa reactioneze; ii) fixarea nucleotidelor secventiale in ordinea determinata.

Strategia este asemanatoare cu cea de la polipeptide fiind preferata sinteza prin "elongare in faza solida", care inlatura obstacolele eliminarii reactivilor neutilizati si produsilor fiecarei etape. Catena ADN poate fi sintetizata secvential prin adaugarea de monomeri activati la un lant in formare care este cuplat pe un suport solid. In cazul metodei "fosforoamiditilor" monomerii activati sunt deoxiribonucleozide 3'fosforamiditi (Figura 2.15

Etapele sintezei in faza solida

Sinteza in faza solida este una dintre cele mai utilizate tehnologii pentru obtinerea oligonucleotidelor si polinucleotidelor de diferite dimensiuni folosite ca primeri in reactiile de amplificare sau ca sonde in reactiile de hibridizare.

Etapele sintezei sunt urmatoarele:

a) Nucleozidul n, care va constitui extremitatea 3', este fixat prin intermediul unui brat de bilele unui suport solid (silice, rasina). Hidroxilul sau 5' este liber;

b) Nucleotidul n-1, activat si protejat, este legat in doi timpi: i) condensarea 3'-5' in mediu anhidru, prin actiunea unui agent de cuplare (nucleu tetrazoliu). In aceasta etapa atomul de fosfor din pozitia 3' a unitatii monomere se cupleaza cu atomul de oxigen din pozitia 5' a lantului in crestere pentru a forma un fosfit triester. Gruparea 5' OH a monomerului activat nu reactioneaza deoarece este cuplata cu gruparea protectoare dimetoxitritil (DMT). De asemenea, gruparea 3' fosforil este inactivata de gruparea protectoare β-cianoetil. In acelasi mod sunt blocate gruparile amino ale bazelor purinice si pirimidinice. Reactia se realizeaza in mediu anhidru deoarece apa reactioneaza cu fosforamiditii; ii) oxidare cu iod a gruparii fosfit triester (P (III)) in fosfat triester P (V). In aceasta etapa fosfit triesterul in care fosforul este trivalent este oxidat cu iod pentru a trece in fosfotriester in care fosforul este pentavalent.

Figura 2. Utilizarea principiului reactiei Sanger in secventializarea automata: a) sinteza fragmentelor complementare si marcarea acestora folosind molecule ddNTP cuplate cu fluorocromi; b) principiul de separare a fragmentelor pe gel sau prin electroforeza capilara; c) modalitate de prezentare a rezultatelor.

Figura 2. Protectia si activarea nucleotidelor. In acest procedeu fosforul trivalent poarta: i) o grupare protonata reactiva (fosforamidita) obtinuta printr-o legatura de tip amid; ii) o grupare ester care blocheaza gruparea OH (gruparea β CE); iii) hidroxilul din pozitia 5' este protejat cu o grupare (metoxitritril) aleasa datorita capacitatii sale de clivare usoara in mediu acid (grup DMT); Gruparile amino ale bazelor, susceptibile sa reactioneze, sunt si ele protejate.

c) Hidroxilul din 5' este eliberat prin acidifiere: catena este gata pentru urmatorul ciclu. In aceasta etapa gruparea protectoare DMT este eliberata in mediu de acid dicloracetic care elibereaza 5'OH si lasa celelalte grupari protectoare intacte. In acest moment catena are o unitate monomera in plus si este gata pentru o noua reactie (Figura 2. 16

Procedeul este automatizat si poate produce lanturi de 150 baze necesitand 10 minute pentru fiecare ciclu. Sinteza ribopolinucleotidelor este mult mai delicata datorita reactivitatii hidroxilului din pozitia 2': este dificila protectia eficienta fara a altera posibilitatile de reactii ale gruparii 3'.

La sfarsitul sintezei se realizeaza un tratament cu amoniac pentru a elimina toate gruparile protectoare si detasaza nucleotidele "curate" de pe suport. Sinteza in faza solida reprezinta abordarea ideala atat pentru sinteza polipeptidelor cat si pentru a polinucleotidelor. Toate reactiile au loc in acelasi recipient si reactia poate fi coordonata in functie de cantitatile de reactivi introdusi. Produsii de reactie pot fi purificati prin electroforeza in gel de poliacrilamida sau prin cromatografie lichida de inalta rezolutie (HPLC High Performance Liquid Chromatography).

Figura 2.16. Sinteza in faza solida a catenelor unui polinucleotid prin metoda "fosforamiditilor".